Abstract

Fundo e Propósito

Os principais obstáculos para o tratamento de câncer de pâncreas são a capacidade altamente invasiva e resistência à quimioterapia e radioterapia. O glicogénio sintase quinase 3β (GSK3β) regula várias vias celulares e está implicada em várias doenças, incluindo cancro. Aqui nós investigamos um papel patológico para GSK3β no fenótipo resistente invasivo e tratamento de câncer de pâncreas.

Métodos

células cancerosas do pâncreas foram examinados para a expressão GSK3β, fosforilação e actividade utilizando Western blot e

in vitro

ensaio de cinase. Os efeitos de inibição GSK3β sobre a sobrevivência de células de cancro, proliferação, capacidade invasiva e susceptibilidade a gemcitabina e radiação foram examinados a seguir ao tratamento com um inibidor farmacológico ou por interferência de ARN. Efeitos da inibição GSK3β em xenoenxertos de células de câncer também foram examinados.

Resultados

células cancerosas pancreáticas apresentaram maior expressão e atividade da GSK3β do que as células não neoplásicas, que foram associados com mudanças na sua fosforilação diferencial . A inibição da GSK3β reduziu significativamente a proliferação e sobrevivência de células de cancro, eles sensibilizados a gemcitabina e radiação ionizante, e atenuou a sua migração e invasão. Estes efeitos foram associados a uma diminuição da expressão da ciclina D1 e fosforilação de Rb. A inibição da GSK3β também alterou a localização subcelular de Rac1 e F-actina e a micro-arquitectura celular, incluindo lamelip�ios. Coincidente com estas alterações estavam a redução da secreção de metaloproteinase de matriz-2 (MMP-2) e diminuição da fosforilação da quinase de adesão focal (FAK). Foram observados os efeitos da inibição GSK3β na invasão tumoral, a susceptibilidade a gemcitabina, expressão de MMP-2 e fosforilação de FAK em xenoenxertos tumorais.

Conclusão

A segmentação de GSK3β representa uma estratégia eficaz para superar a desafios duplos da invasão e resistência ao tratamento no câncer de pâncreas

Citation:. Kitano a, Shimasaki T, Chikano Y, Nakada M, Hirose M, Higashi T, et al. (2013) aberrante glicogênio sintase quinase 3β está envolvido no celular do cancro do pâncreas invasão e resistência à terapia. PLoS ONE 8 (2): e55289. doi: 10.1371 /journal.pone.0055289

editor: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 22 de agosto de 2012; Aceito: 20 de dezembro de 2012; Publicação: 08 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kitano et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas-in-Aid para a Investigação científica do Ministério da Educação, Ciência, Esportes, Tecnologia e Cultura japonesa; Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (para KK, TM); Sociedade Japonesa para Tecnologia (para KK, TM); o Extramural Collaborative Research Grant do Instituto de Pesquisa do Câncer da Universidade Kanazawa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é um importante problema de saúde devido a uma taxa de sobrevida em 5 anos total inferior a 10% [1]. Caracteriza-se pela capacidade proliferativa e altamente invasivo das células tumorais e uma forte predisposição para a metástase [2] – [4]. A natureza agressiva do câncer de pâncreas dificulta o diagnóstico precoce e intervenção cirúrgica curativa e torna resistentes à quimioterapia e radiação [3], [4]. A terapia utilizada é a gemcitabina infusão, embora menos de 20% dos pacientes respondem a esse tratamento [3], [4]. estratégias terapêuticas novas que melhoram os efeitos de gemcitabina e atenuar as propriedades invasivas das células de cancro pancreático são necessários. A terapia dirigida a alvo molecular emergiu e inclui a segmentação das metaloproteinases de receptores do factor de crescimento, factor angiogénico /receptores e da matriz, uma vez que estes são expressas de forma aberrante em cancro pancreático [2] – [4]. Vários ensaios clínicos de câncer de pâncreas já têm como alvo esses fatores de crescimento, quer como monoterapia ou em combinação com gemcitabina, mas a maioria têm mostrado pouco ou nenhum benefício terapêutico [5]. A identificação de novos alvos moleculares que possam melhorar os efeitos terapêuticos da gemcitabina e de radiação é, por conseguinte, uma elevada prioridade [6].

glicogénio-sintase-quinase 3β (GSK3β) é uma cinase de serina /treonina proteína que regula a múltiplas vias de sinalização [ ,,,0],7]. Com base nas suas funções e envolvimento em patologias primários conhecidos, GSK3β tem sido implicado como um alvo terapêutico para a intolerância à glucose, doenças neurodegenerativas e inflamação [8]. Anteriormente, demonstrou que a expressão desregulada, actividade de fosforilação e de GSK3β são características distintas de cancros gastrointestinais e glioblastoma e que GSK3β sustenta a sobrevivência e proliferação destas células tumorais. Um papel para GSK3β aberrante nestes tipos de tumores é apoiada pela observação de que a inibição farmacológica da sua actividade reduz a sobrevivência e proliferação das células cancerosas e predispõe a apoptose

In vitro

e em xenoenxertos tumorais [9] – [ ,,,0],12]. Embora o seu papel no câncer ainda está em discussão [13], os resultados globais até agora indicam que a expressão aberrante e atividade da GSK3β é uma característica comum e fundamental em um amplo espectro de cancros (revisto em [14]).

com base em estudos anteriores que demonstraram o envolvimento de GSK3β na sobrevivência celular de NF-kB mediada por [15], GSK3β foi encontrada para suportar a sobrevivência de células de cancro do pâncreas através desta via de [16], [17]. Embora GSK3β é um regulador chave da polarização e migração celular durante os processos fisiológicos tais como o desenvolvimento de tecidos e cicatrização de feridas [18], muito pouco se sabe sobre o seu papel na migração e invasão de células cancerosas. Aqui nós investigamos o envolvimento potencial do GSK3β na natureza invasiva do câncer de pâncreas e sua resistência à gemcitabina e radiação ionizante, os dois principais obstáculos a um tratamento mais eficaz.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes com câncer pancreático antes da cirurgia. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica da Universidade de Kanazawa.

As experiências com animais foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório na Universidade de Medicina de Kanazawa, e de acordo com diretrizes nacionais para o uso de animais em de pesquisa no Japão (https://www.lifescience.mext.go.jp/policies/pdf/an_material011.pdf). O protocolo foi aprovado pela Comissão em Experimentação Animal da Universidade de Medicina de Kanazawa.

Linhas de células e tecidos amostras

As células humanas embrionárias de rim (HEK-293) e células do cancro do pâncreas (PANC-1, MIA PaCa-2, BxPC-3, Capan-1) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). Estas linhas celulares foram caracterizadas por perfis de ADN na ATCC, e passadas por menos do que seis meses após a reanimação. Elas foram mantidas a 37 ° C com 5% de CO

2 em DMEM (HEK-293, PANC-1, Mia PaCa-2, Capan-1) e RPMI 1640 (BxPC-3) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (SFB) e antibióticos (penicilina G e estreptomicina) (GIBCO). As células foram colhidas durante a fase de crescimento exponencial para a extração de RNA e proteínas.

Este estudo incluiu 15 pacientes com câncer de pâncreas, que passou por uma cirurgia no Departamento de Oncologia Cirúrgica do Hospital Universitário Kanazawa (Tabela S1). Os espécimes cirúrgicos foram fixados em formol neutro tamponado a 10%, embebidos em parafina e processadas para diagnóstico histopatológico e exames de imuno-histoquímica.

Western Blot

A proteína foi extraída de células cultivadas utilizando tampão de lise (CelLytic -MT, Sigma-Aldrich), contendo uma mistura de inibidores da protease e da fosfatase (Sigma-Aldrich). As concentrações de extractos de proteína foram medidas por Coomassie Protein Assay Reagents (Pierce). A 30 ug aliquota de proteína foi separada em electroforese em gel de sulfato de poliacrilamida dodecil de sódio (SDS-PAGE) e analisado por transferência de Western para as proteínas de interesse e a sua fosforilação [9], [11], [12], utilizando os respectivos anticorpos primários (Tabela S2). membranas electrotransferidas (Amersham) foram bloqueadas com 5% de albumina de soro de bovino antes da detecção das fracções de proteínas fosforiladas. A quantidade de proteína em cada amostra foi monitorizada pela expressão de β-actina. Os sinais foram desenvolvidos usando quimioluminescência aumentada (ECL).

In vitro

Kinase Ensaio para GSK3β Atividade

A nonradioisotopic

in vitro

ensaio da quinase (NRIKA) [19] foi utilizado para detectar a actividade de GSK3β derivada a partir de células. O NRIKA utiliza uma combinação sequencial de imunoprecipitações para isolar GSK3β em amostras de proteínas celulares, um

In vitro

reacção da quinase que usa proteína recombinante humana β-catenina (substrato) e não-radioisotópico de adenosina trifosfato (ATP), seguido pela imunotransferência para detectar a β-catenina phosporylated na serina (S) 33, S37 e /ou treonina (T) 41 resíduos (p-β-catenina

S33 /37 /T41) [19]. Como um controlo negativo, o anticorpo monoclonal de ratinho para GSK3β foi substituída por uma quantidade igual de IgG de rato não imune (Sigma-Aldrich) no passo de imunoprecipitação. GSK3β actividade é demonstrada pela presença de ácido p-β-catenina

S33 /37 /T41 na reacção de teste e pela sua ausência na reacção de controlo negativo. A quantidade de GSK3β imunoprecipitado e a presença da proteína β-catenina recombinante na reacção de quinase foram monitorizados por imunotransferência

A imuno-histoquímica

a expressão e /ou a fosforilação de GSK3β, da metaloproteinase de matriz (MMP). – 2 e quinase de adesão focal (FAK), em tecidos de tumor e não neoplásicas adjacentes de doentes com cancro pancreático foram examinadas pelo método do complexo biotina-avidina-peroxidase [11], [12]. Seguindo desparafinização, desmascaramento antigénio microondas e bloqueio de reacções imunológicas não específicas, as secções de parafina foram incubadas com anticorpo para GSK3β, tirosina (Y) 216 fosforilado GSK3β (p-GSK3β

Y216), MMP-2, FAK, Y397 fosforilado ou Y861 fosforilado FAK (p-FAK

Y397, p-FAK

Y861) e p-β-catenina

S33 /37 /T41, respectivamente. Fontes e diluições de trabalho destes anticorpos foram apresentados na Tabela S2. As secções foram então incubadas com IgG anti-coelho de cabra biotinilado ou de cavalo anti-IgG de ratinho (diluído 1:200; Vector). A imunorreactividade foi detectada utilizando o kit ABComplex /HRP (DakoCytomation). Para o controlo negativo, os anticorpos primários foram substituídos por coelho ou rato IgG não-imune (DakoCytomation). A sobre-expressão ou maior fosforilação das respectivas moléculas em tumores foi definida como a mais forte expressão ou a fosforilação de proteínas, quer nas células de tumor em comparação com ductos pancreáticos não neoplásicas do mesmo paciente.

Efeitos de Inibição GSK3β sobre a sobrevivência celular e proliferação

células semeadas em placas de 96 poços foram tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma-Aldrich) ou um inibidor GSK3β (Ar-A014418; Calbiochem) dissolvido em DMSO para as concentrações finais indicadas no meio. Notavelmente, AR-A014418 não inibe a actividade de 26 quinases intimamente relacionadas e é considerado altamente específico para GSK3β [20]. Em pontos de tempo designados, os números relativos de células viáveis ​​em proliferação e foram determinados utilizando WST-8 (4- [3- (4-iodofenil) -2- (4-nitrofenil) -2H-5-tetrazolio] -1,3 benzeno dissulfonato) kit de ensaio (contagem celular kit-8;. Wako) e de Proliferação celular kit ELISA BrdU (Roche), respectivamente

pequeno RNA de interferência (siRNA) específico para GSK3β humana (GSK3β Validated discrição RNAi) e controle negativo siRNA (Furtivo RNAi controle negativo Baixo GC duplex) foram adquiridos da Invitrogen. O siARN tem como alvo específico do GSK3β a sequência 5′-GCUCCAGAUCAUGAGAAAGCUAGAU-3 ‘. As células foram transfectadas com 10 nM de ARNsi, quer utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen). O efeito de interferência de ARN de expressão GSK3β foi determinada por transferência de Western utilizando um anticorpo contra ambos GSK3α e β (Tabela S2). A especificidade do siRNA GSK3β específicos de foi confirmada em nossos estudos anteriores [11], [12]. Para examinar o efeito de interferência de ARN GSK3β sobre a sobrevivência e proliferação das células, as células semeadas em placas de 96 poços foram transfectadas com 10 nM de ARNsi de controlo ou específicas do GSK3β. Às 72 horas após a transfecção, os números relativos de células viáveis ​​em proliferação e foram determinados pelos métodos descritos acima.

Efeitos de Inibição GSK3β sobre a sensibilidade das células cancerosas à gemcitabina e a radiações ionizantes

As células cancerosas semeadas em placas de 96 poços (3-6 x 10

4 células por poço) foram tratados com concentrações crescentes de gemcitabina (Eli Lily) ou Ar-A014418. Seguindo o tratamento por 72 horas, o número relativo de células viáveis ​​foi medida por ensaio de WST-8 para determinar IC

(concentração inibidora a sobrevivência das células 50%) 50 de gemcitabina e AR-A014418 e para gerar isobologramas. As células foram então tratadas com uma dose de gemcitabina perto de IC

50 na presença de DMSO ou uma dose baixa (5 ou 10 uM) de AR-A014418. O método isobolograma [21] foi usada para determinar se o efeito inibidor de GSK3β sobre a sensibilidade das células do cancro do pâncreas a gemcitabina foi aditiva, sinérgica ou antagonista.

O efeito do inibidor GSK3β sobre a sensibilidade das células do cancro do pâncreas à radiação ionizante estava examinados por ensaio de sobrevivência de células formadoras de colónia. Em cada poço de placas de 6 poços, 1000 células de cancro pancreático foram semeadas e tratadas sequencialmente com DMSO ou uma dose baixa (5 ou 10 uM) de AR-A014418 durante 24 horas e com radiação ionizante em doses de 0, 4 e 8 Gy. Aos 6 dias após a irradiação, o número total de colónias coradas com 0,1% de violeta de cristal (Wako) foi marcado em cada poço. O número médio de colónias em três experiências separadas foi calculado com desvios-padrão.

Os ensaios para a migração e invasão celular

migração de células cancerosas e invasão foram examinados por ensaio de cicatrização baseado em monocamada e transpoço ensaio. As monocamadas confluentes de células de cancro do pâncreas, na presença de DMSO ou Ar-A014418, a uma dose de 5 ou 10 uM foram riscados com uma ponta 20 pL-micropipeta para criar uma zona livre de células (ferida). Em cada condição, a distância de folga entre os bordos da ferida foi monitorizada em três pontos fixos de referência para 6 a 24 horas por uma câmara CCD (MRM Axiocam, Zeiss) ligado a um microscópio de contraste de fase (Axiovert 40 CFL, Zeiss). A migração celular em cada ponto de tempo foi calculada como a média da distância de ferida medido nos três pontos e comparada entre as células tratadas com DMSO e AR-A014418.

A migração celular e invasão foram examinados pelos ensaios Transwell usando não revestido e revestido de matrigel 24 poços sistema de câmara dupla (BD BioCoat ™ Matrigel ™ incubação câmara, BD Bioscience). As células cancerígenas foram suspensas em meio livre de soro contendo DMSO ou Ar-A014418 (5 ou 10 uM), e 2 × 10

4 células foram aplicadas ao emparelhamento câmara superior, com a câmara inferior preenchido com meio contendo 10% de FBS ( como um quimio-atractor) e DMSO ou Ar-A014418 (5 ou 10 uM). Em 22 horas depois de permitir que as células para migrar e invadem, as células no lado inferior da câmara foram fixadas e coradas com Diff-Quick Kit (Symex). Em cada ensaio, o número total de células por campo de alta potência microscópico no lado inferior da câmara não revestidos ou revestidos com Matrigel foi contado e teve para migrar ou invadir as células. O número médio de células em cinco campos microscópicos de alta potência foi calculado com desvios-padrão.

As células cancerosas celular morfologia e Imunofluorescência Citoquímica

cultivadas em uma lamela foram tratadas com DMSO ou AR- A014418 (5 ou 10 uM) durante 12 horas e depois riscados conforme anteriormente descrito. Ao fim de 12 horas após a arranhar, das células ao longo das bordas da ferida foram observadas por microscopia de contraste de fase. Estas células foram então fixadas com paraformaldeído a 4% e permeabilizadas com 0,1% de Triton-X (Sigma-Aldrich). As células foram incubadas sequencialmente com anticorpo monoclonal de ratinho para Rac1 (BD Bioscience; diluída 1:200) a 4 ° C durante a noite e com murganho anti-IgG Alexa 488 Flour®-rotulado (Invitrogen; diluída 1:1,000) à temperatura ambiente durante 40 min no escuro. Depois de se lavar fora o excesso de anticorpo, as células foram coradas para filamentosa (F) actina com faloidina Flour® Alexa 546-rotulado (Invitrogen; diluído 1:40) durante 20 min. Em seguida, os núcleos das células foram contrastadas com Hoechst 33342 (Molecular Probes) e observadas por microscopia de fluorescência (Keyence) para a expressão e localização subcelular da Rac1 e F-actina.

Rac1 Actividade

A proteína foi extraída a partir de células tratadas com DMSO ou 10 ^ M AR-A014418 durante 24 horas em 25 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,5) contendo NaCl 150 mM, MgCl 5 mM de

2, 1% de NP-40, ditiotreitol 1 mM e 5% glicerol. Rac1 activo foi isolado a partir da amostra de proteína pelo método suspenso utilizando GST-humana Pak1-PBD (Thermo) e resinas (Glutationa Sepharose 4 Fast Flow; GE Healthcare). A fracção de Rac1 ligado ao trifosfato de guanosina (GTP) (Rac1-GTP, uma forma activa) foi eluído a partir das resinas e detectado por análise de Western blot utilizando anticorpo policlonal de coelho para Rac1 (diluído 1:1,000; Thermo). Separadamente, a proteína celular total foi sondado para o total Rac1 usando o mesmo anticorpo.

Expressão e secreção de metaloproteinase de matriz-2 (MMP-2)

A expressão de ARNm de MMP-2 foi examinada por quantitativa transcrição reversa-PCR (qRT-PCR). O ARN total foi isolado a partir de células utilizando ISOGEN (Wako). O DNA complementar (cDNA) foi gerado usando um kit de transcrição reversa (Promega). qRT-PCR foi realizada utilizando SYBR Premix Ex Taq

TMII (Takara Bio) com os respectivos conjuntos de sentido e anti- sentido para os iniciadores de amplificação de MMP-2 e β-actina (Tabela S2) [11].

expressão da MMP-2 foi analisado por zimografia de gelatina [22]. As células cancerígenas foram inoculadas em placas de 12 poços durante 48 horas e, em seguida, tratada com DMSO ou Ar-A01418 (10 ou 25 fiM) durante 24 horas em meio isento de soro. Células tratadas condicionado ou meio foram incubadas com tampão de amostra de SDS durante 30 min a 37 ° C. As amostras foram separadas em 10% SDS-PAGE contendo 0,005% de gelatina Alexa Fluor 680-marcado. Após a electroforese, os géis foram lavados em 2,5% de Triton X-100 durante 2 horas e, em seguida, incubadas em tampão de substrato durante a noite a 37 ° C. O gel foi verificado pelo sistema de imagem Odyssey IR LI-COR (Lincoln).

Tumor Study Xenoenxerto

Nós preparamos subcutâneos PANC-1 xenoenxertos em ratinhos como descrito [23]. Estes ratinhos foram divididos em 4 grupos e tratados com injecção intraperitoneal (duas vezes por semana durante 10 semanas) de DMSO (diluente), a gemcitabina (20 mg /kg de peso corporal) e AR-A014418 (2 mg /kg de peso do corpo, equivalente a 10 uM em meio de cultura, conforme determinado e optimizados nos nossos estudos anteriores [10], [12]), isoladamente ou em combinação, respectivamente. Todos os ratinhos foram terminadas após o tratamento e os tumores de xenoenxertos foram removidos e processados ​​para exame histológico e imuno-histoquímica para a expressão de MMP-2 e a FAK e fosforilação de FAK em células de tumor, como descrito acima.

Análise estatística

Entre-grupo significância estatística foi determinada utilizando o estudante

t

teste. No estudo de xenoenxerto de tumor, os volumes dos tumores em cada grupo de tratamento foram expressos como média ± desvio padrão (SD). A significância estatística das diferenças entre os dados foi determinada com o teste de Kruskal Wallis H seguido por teste de Mann-Whitney U-test com correcção de Bonferroni. A

P valor

de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Expression, fosforilação e actividade das GSK3β em células cancerosas

células cancerosas no pâncreas. apresentaram maiores níveis basais de GSK3β e a forma activa Y216 fosforilado (p-GSK3β

Y216) e níveis mais baixos de a forma inactiva S9-fosforilada (p-GSK3β

S9) em comparação com células HEK 293 (Fig. 1A ). GSK3β derivado de células do cancro foi activo para a fosforilação do seu substrato, β-catenina (Fig. 1B). Estes resultados indicam que as células de câncer de pâncreas expressar GSK3β ativos que não é regulada por fosforilação diferencial a S9 e Y216. A imuno-histoquímica para os cortes seriados mostraram que GSK3β e p-GSK3β

Y216 foram expressos de forma difusa e co-localizada nas células tumorais e sobre-expresso nas células tumorais invasivas de 8/15 (53%) doentes com cancro pancreático (Fig. 1C). Superexpressão foi mais frequente em pacientes com tumor primário T3 /T4 ou com linfonodo e metástases à distância no momento da cirurgia (Tabela S1).

(A) extrato de proteína de cada linha celular foi analisada por inmunotransferência para a expressão de GSK3β e sua fosforilação (p-GSK3β

S9, p-GSK3β

Y216). expressão de p-actina foi monitorizada como um controlo de carga. actividade (B) foi detectada por GSK3β NRIKA [19] nas respectivas células. Tal como descrito em Materiais e Métodos, GSK3β actividade é demonstrada pela presença de ácido p-β-catenina

S33 /37 /T41 na reacção de ensaio (T) e pela sua ausência na reacção de controlo negativo (CN). A quantidade de GSK3β imunoprecipitado e a presença de substrato (β-catenina) na reacção de quinase foram monitorizados por imunotransferência. (C, D) secções de parafina em série de um cancro pancreático primário e seu tecido adjacente não neoplásico (paciente n ° 5 na Tabela S1) foram imunocoradas para GSK3β e p-GSK3β

Y216 (C), e para a MMP-2 , FAK, p-FAK

Y397 e p-FAK

Y861 (D). A barra de escala em cada painel indica 100 mícrons de comprimento.

Efeitos de GSK3β Inhibitor sobre célula de sobrevivência e proliferação

Nós investigamos se GSK3β contribui para a sobrevivência de células cancerosas e proliferação. Os níveis de glicogênio sintase (GS) fosforilada no Y641 (p-GS

S641) e p-β-catenina

S33 /37 /T41 diminuiu em células de câncer após o tratamento com AR-A014418 (Fig. S1A, B ), indicando a sua actividade contra GSK3β em células cancerosas. inibição GSK3β atenuou a sobrevivência e proliferação de células de cancro (Fig. 2A, C). Depleção de GSK3β atenuado pela interferência de ARN a viabilidade celular e a proliferação de todas as linhas celulares de cancro (Fig. 2B, D). Estes resultados são consistentes com os estudos anteriores [16], [17] sugerindo que os impactos GSK3β aberrantes sobre a sobrevivência e proliferação de células de cancro do pâncreas.

(A) números relativos de células viáveis ​​nos pontos de tempo designados eram medida pelo ensaio de WST-8 para as respectivas células na presença de DMSO ou Ar-A014418, nas concentrações indicadas. (B) os números relativos de células viáveis ​​foram medidos para as respectivas células após a transfecção de não específica (NS) ou siARN-GSK3β específica. (C, D) O número relativo de células em proliferação foi determinada medindo a quantidade de incorporação de BrdU. As células em proliferação foram pontuados às 48 horas após o tratamento com DMSO ou Ar-A014418 (10 uM, 20 uM) (C), ou após a transfecção com não específica (NS) ou siARN específica GSK3β-(D). Os valores mostrados em (A-D) são as médias ± desvio padrão de cinco experiências separadas. *

p Art 0,05, diferença estatisticamente significativa entre as células tratadas com DMSO ou AR-A014418 e entre as células tratadas com não específico e específico-GSK3β siRNA

Efeitos de GSK3β. inibidor combinado com gemcitabina ou radioterapia contra células

os resultados acima nos levaram a abordar se a inibição GSK3β poderia aumentar os efeitos da gemcitabina e radiação ionizante. As doses elevadas (25 ou 50 uM) de AR-A014418 sozinho tinha um efeito terapêutico contra as células cancerosas (Fig. 2A, C). Por conseguinte, os efeitos das doses relativamente baixas (5 ou 10 uM) foram testados em combinação com gemcitabina ou a radiação ionizante. Em primeiro lugar, nós examinamos os efeitos dose-dependentes da AR-A014418 e gemcitabina na sobrevivência de células cancerosas e determinou a sua IC

50 valores (Fig. 2A, Fig. S2). IC

50 valores para Ar-A014418 foram semelhantes em PANC-1, Mia PaCa-2 e BxPC-3 células, enquanto que aqueles para gemcitabina variada (Tabela S3). A seguir, analisou o efeito da AR-A014418 sobre a sensibilidade das células cancerosas a gemcitabina. Quando as células foram tratadas com doses crescentes (1 ng /mL a 10 ug /mL) de gemcitabina, combinação com uma dose baixa de AR-A014418 reduziu significativamente o IC

50 de gemcitabina (Fig. S2, Tabela S4). análise de isobolograma [21] dos dados revelou que uma dose baixa de AR-A014418 em combinação com gemcitabina foi aditivo contra células PANC-1 e sinergística contra células MIA PaCa-2 (Fig. 3A). Confirmou-se que o tratamento combinado com AR-A014418 reforçado significativamente o efeito de gemcitabina contra xenoenxertos de células de cancro (Fig. 3C) em roedores, sem efeitos prejudiciais com o reagente.

(A) A influência de AR-A014418 sobre o efeito de gemcitabina foi analisada utilizando o isobolograma [21] representando graficamente a IC

50 da terapia de combinação (Fig. S2, Tabela S4). (B) O efeito combinado de radiação ionizante e AR-A014418 foi testado em PANC-1 e células MIA PaCa-2 por ensaio de formação de colónias. *

p Art 0,05, diferença estatisticamente significativa entre as células tratadas com DMSO ou AR-A014418. (C) O efeito combinado de gemcitabina e AR-A014418 foi testado em PANC-1 xenoenxertos. ratinhos atímicos com PANC-1 xenoenxerto foram distribuídos em quatro grupos de tratamento com injecção intraperitoneal (duas vezes por semana) de DMSO (controlo; 8 murganhos), a gemcitabina (GEM; 20 mg /kg de peso corporal; 9 ratos) e AR-A014418 ( AR; 2 mg /kg de peso corporal; 8 murganhos), sozinho ou em combinação (GEM + AR; 9 ratos). No momento após o tratamento durante 10 semanas, o volume do tumor (cm

3) foi calculada usando a fórmula de 0,5 × S

2 × G, onde S é o diâmetro menor tumor (cm), e L é o maior (cm ) [10], [12]. O volume médio do tumor foi comparado entre os 4 grupos. *

p Art 0,05, diferença estatisticamente significativa entre os dados

O efeito da AR-A014418 combinado com radiação ionizante foi testada em células cancerosas.. No ensaio de sobrevivência de células formadoras de colónia, na presença de 10 uM AR-A014418 reduziu significativamente a viabilidade das células cancerosas em comparação com o tratamento com radiação ionizante por si só (Fig. 3B). Juntos, estes resultados demonstram que o tratamento combinado com inibidor de GSK3β sensibiliza células cancerosas a gemcitabina e à radiação ionizante.

Molecular alterações associadas com GSK3β inibição em células cancerosas

Para compreender o mecanismo subjacente a participação de GSK3β na proliferação de células cancerosas e resistência à terapia, foi investigado o efeito de inibição GSK3β sobre a expressão e a fosforilação das proteínas envolvidas na regulação do ciclo celular e proliferação. Consistente com estudos anteriores (revisto em [2]), células de cancro do pâncreas mostrou a fosforilação da proteína Rb (p-Rb

S780, p-Rb

S807 /811; A Fig. 4), sugerindo que a ligação a E2F fator de transcrição foi prejudicada [24]. O tratamento com AR-A014418 ou siRNA específico do GSK3β diminuiu os níveis de fosforilação Rb e expressão da ciclina D1 (Fig. 4), no entanto não há mudanças consistentes foram encontrados para CDK4 ou expressão CDK6.

(A) Análise de imunotransferência compara a expressão de Rb, CDK4, CDK6 e ciclina D1, e a fosforilação de Rb em S780 e S807 /811 resíduos (p-Rb

S780, p-Rb

S807 /811) entre as células tratadas com DMSO ( DM) ou 10 uM AR-A014418 (AR) durante 24 horas. (B) Alterações nos níveis de p-Rb

S780 e p-Rb

S807 /811 e expressão de Rb e ciclina D1 foram examinados em PACA-2 células MIA nos pontos de tempo indicados após o tratamento com 10? M AR -A014418. (C) A expressão do Rb, ciclina D1, as proteínas e os níveis de fosforilação de Rb (p-Rb

S780) GSK3α e GSK3β foram examinados e comparados entre as mesmas células de cancro do pâncreas transfectadas com ARNsi não específica (NS) ou GSK3β- siRNA específico (s) (10 nM de cada). (A-C) expressão β-actina foi monitorada como um controle de carga.

Efeitos de GSK3β Inibição de Migração Cancer Cell e Invasion

O ensaio de cicatrização mostrou que a migração de as células cancerosas foi significativamente reduzida por tratamento com 5 uM e 10 uM AR-A014418 (Fig. 5A, Fig. S3). Mais importante, estas concentrações eram insuficientes para inibir a proliferação celular de 24 horas após o tratamento (Fig. 2A). No ensaio Transwell, 5 uM e 10 uM AR-A014418 inibiu a migração quimiotáctica de células cancerosas e a invasão do componente da matriz extracelular (Fig. 5B).

(A) painéis superiores mostram o decurso de tempo para PANC- migração de uma célula num ensaio de cicatrização da ferida na presença de DMSO ou Ar-A014418 (AR). O painel inferior mostra as larguras relativas das feridas, medida como uma percentagem da folga inicial no momento zero. *

p Art 0,05, diferença estatisticamente significativa entre as células tratadas com DMSO ou AR-A014418. (B) células de migrar através Transwell revestido e não invadem as células através de Transwell revestidas com Matrigel foram marcados para PANC-1 e PaCa-2 células MIA tratados com DMSO ou Ar-A014418 (AR) durante 22 horas. achados foto-microscópica de representação em cada ensaio são mostrados abaixo das colunas. *

p

. 0,05, diferença estatisticamente significativa entre as células tratadas com DMSO ou AR-A014418

Mudanças na Invasiva fenótipo das células cancerosas Seguindo GSK3β Inibição

Os resultados acima leva à hipótese de que GSK3β tem um papel na migração de células cancerosas e invasão. Isto pode ser atribuído à epitelial-mesenquimal transição (EMT), um fenótipo responsável pela invasão de células de cancro e metástase [25]. Foi investigada a expressão das moléculas relacionadas com o EMT E-caderina, N-caderina e vimentina em células de cancro após tratamento com AR-A04418 e siRNA específico-GSK3β. Não ocorreram alterações consistentes foram observados nos níveis de expressão destas moléculas (Fig. S1C, D), o que implica que EMT é improvável que seja o mecanismo através do qual a inibição GSK3β atenua a migração de células de cancro e invasão. Uma possível explicação pode ser que as linhas celulares de cancro estabelecidas já ter adquirido o fenótipo de EMT.

seguinte focada em micro-arquitectura celular e em particular na lamelip�ios que desempenha um papel importante na migração das células durante os processos fisiológicos e na migração das células do cancro e invasão [26]. Um membro da família Rho-GTPase, Rac1, participa na formação lamellipodia e no câncer progressão [27]. ensaio de cicatrização de feridas mostrou que migram células cancerosas formar lamellipodia no local da Rac1 localização, com filamentos de actina organizar a estrutura de lamelas. O tratamento com AR-A014418 diminuição da formação lamelip�ios em células cancerosas no bordo da ferida e resultou na distribuição citoplasmática difusa de Rac1 e F-actina (Fig. 6A).