Abstract
Fundo
Hedgehog (HH) de sinalização desempenha um papel fundamental nos processos celulares normais, no desenvolvimento gastrointestinal de mamíferos e diferenciação normal e na oncogênese e manutenção do fenótipo maligno em um variedade de cancros humanos. A evidência crescente implica ainda mais o envolvimento da sinalização HH na oncogênese eo comportamento metastático dos cancros do cólon. No entanto, abordagens genómicas para elucidar o papel do HH sinalização em cânceres em geral estão faltando, e os dados obtidos sobre a sinalização HH no câncer de cólon é extremamente limitada.
Metodologia /Principais Achados
Para identificar única alvos a jusante dos genes GLI, os reguladores transcricionais de sinalização de Hh, no contexto do carcinoma do cólon, que empregou um inibidor de molécula pequena de ambos GLI1 e Gli2, GANT61, em duas linhas celulares de cancro do cólon humano, HT29 e GC3 /C1. Análise do ciclo celular demonstraram acumulação de células tratadas com GANT61 no G1 /S limite. cDNA microarray perfil de expressão gênica de 18,401 genes identificados genes diferencialmente expressos (degs), tanto únicas e comuns aos HT29 e GC3 /c1. Análises com GenomeStudio (estatísticas), Matlab (mapa de calor), Ingenuity (análise via canonical), ou por qRT-PCR, p21 identificou
Cip1 (CDKN1A) e p15
Ink4b (CDKN2B), que desempenham um papel na o G1 /S posto de controle, como genes regulados positivamente no G1 /S limite. Genes que determinam a progressão do ciclo celular em G1 /S incluindo E2F2, a ciclina E2 (CCNE2), Cdc25A e CDK2, e os genes que regulam a passagem de células através de G2 /M (CYCLIN A2 [CCNA2], Cdc25C, a ciclina B2 [CCNB2], CDC20 e CDC2 [CDK1], foram sub-regulada. Além disso, novos genes envolvidos na resposta ao estresse, DNA danos resposta, replicação do DNA e reparo de DNA foram identificados com a inibição da sinalização HH.
Conclusões /Significado
Este estudo identifica genes que estão envolvidos na proliferação celular de HH-dependente em células cancerígenas do cólon, e na sequência da sua inibição, os genes que regulam a progressão do ciclo celular e os eventos a jusante da G1 /S limite.
Citation :.. Shi T, Mazumdar T, Devecchio J, Duan ZH, Agyeman a, Aziz M, et al (2010) Microarray Gene cDNA Expression Profiling de Hedgehog via de sinalização de inibição em células cancerígenas do cólon humano PLoS ONE 5 (10): e13054. doi: 10.1371 /journal.pone.0013054
editor: Terence Lee, da Universidade de Hong Kong, China
Recebido: 06 de junho de 2010; Aceito: 02 de setembro de 2010; Publicação: 01 de outubro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Shi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O apoio financeiro do Instituto Nacional do Câncer concessões RO1 CA 32613 (JAH), RO1 108929 (JAH), e da Cleveland Clinic. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
hedgehog (hh) de sinalização desempenha um papel crítico num grande variedade de processos celulares normais. É central na embriogénese, a regulação da transição epitelial-a-mesenquimal, a modelação de uma variada gama de estruturas de vertebrado em uma variedade de órgãos, manutenção da homeostase dos tecidos adultos, a reparação de tecidos, a proliferação celular, e na sobrevivência de células [1] , [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. A via HH canónica também é crítico para o desenvolvimento normal dos mamíferos gastrointestinal, onde está envolvido na regulação de diferenciação de coordenadas de vilosidades intestinais normais [10], [11], [12]. Assim, no tracto gastrointestinal normal, ligandos HH são induzidas nas células diferenciadas em torno da superfície das vilosidades, gerando um ciclo de feedback negativo para inibir a sinalização de Wnt canónica nas células basais da cripta, protegendo assim as células diferenciadas a partir dos efeitos proliferativos de WNT [ ,,,0],13]. A activação da via de sinalização de Hh canónica compreende a ligação de ligandos ao receptor HH membrana Patched (PTCH1), que é internalizada levando à activação da molécula de sinalização Smoothened (SMO), através de libertação da supressão mediada por PTC. SMO activa o árbitro final da sinalização de Hh, a família GLI de factores de transcrição que se ligam ao elemento de ligação consensual GACCACCCA semelhante em sequências de promotor para regular transcricionalmente genes alvo HH [3], [14], [15]. GLI1 e Gli2, os activadores transcricionais de sinalização de Hh, possuem funções distintas, bem como de sobreposição que envolvem activador actividades repressores (Gli2) [16] (GLI1 e Gli2) ou; no entanto, seus papéis na regulação dos processos de proliferação celular HH-driven, de sobrevivência ou morte celular são mal compreendidos. Historicamente, GLI1 tem sido considerado o marcador mais fiável de actividade da via HH, no entanto Gli2 parece ser o principal activador de sinalização de Hh, com GLI1 como um alvo transcricional de Gli2 [3], [7], que conduz a aumento de HH de sinalização tanto tanto quantitativa como qualitativamente [16]. Uma característica importante de proteínas GLI é que a sua actividade biológica é dependente do contexto, influenciado pelo ambiente celular [17], [18].
A activação da cascata de sinalização HH canónica é activado de forma aberrante e bem conhecida por desempenhar um papel crítico na oncogénese e a manutenção do fenótipo maligno em vários tipos de cancros humanos. Tal activação envolve a amplificação de GLI1 ou Gli2, mutações em PTC ou SMO, ou a expressão do gene desregulado [3], [4]; estas células malignas são também sensíveis ao inibidor de molécula pequena que tem como alvo SMO, ciclopamina [4], [19], [20], [21], [22], [23]. carcinomas do cólon são pensados para derivar de activação constitutiva de sinalização de Wnt por mutação do APC ou genes β-catenina, enquanto o envolvimento da via de sinalização de Hh não é tão clara. Em malignidades gastrointestinais, regulação transcricional-se de ligandos HH tem sido identificado como o activador predominante de sinalização de Hh nestas doenças (revisto em [3]). Além disso, há uma evidência emergente de que a sinalização de Hh está envolvido na carcinogénese colorrectal [24], [25], carcinoma do cólon auto-renovação das células estaminais, e no comportamento metastático avançados de cancros do cólon [26]. No entanto, as abordagens genómicas para elucidar o papel do HH sinalização em cancros em geral, faltam, genes reguladores a jusante da GLI1 e Gli2 que funcionam na proliferação celular, sobrevivência e manutenção do fenótipo HH malignos permanecem incompletamente caracterizada [5], e dados derivados em HH sinalização no cancro do cólon é extremamente limitada.
a proliferação celular é conduzida por progressão das células através do ciclo celular consistindo de passagem sequencial através de G1, S, G2 e M fases. quinases dependentes de ciclina (CDKs) associado com ciclinas para dirigir a maquinaria do ciclo celular [27], [28]. Assim, os associados CDK2 com ciclina E na transição G1 /S e com ciclina A durante a fase S, CDK4 e ligam CDK6 a ciclina D durante a progressão no G1 /S, enquanto complexos CDC2 com ciclina A em G2, e com ciclina B durante a transição G2 /M. membros da família CDC25 também regular a progressão do ciclo celular através de desfosforilação da CDK [29], [30]. inibidores de CDK, incluindo p21
Cip1 [29], [31] e p15
Ink4b [[32], se ligam a complexos ciclina-CDK durante a transição do ciclo celular, em particular no G1 /S (p21
cip1, p15
Ink4b; [32]) e G2 /M (p21
cip1; [29]), e também pode induzir a paragem do ciclo celular no G1 S fronteira /seguinte sinais citostáticos através da inibição funcional do cyclin- complexos CDK. A família E2F de factores de transcrição, também regula a expressão de genes requeridos para a transição G1 /S, em particular genes envolvidos na activação dos mecanismos de replicação do ADN, e a reparação do ADN [33].
tecnologia de microarranjo de ADNc possui desde que a capacidade para estudar a expressão de milhares de genes simultaneamente, e é uma ferramenta importante na dissecção de vias de transdução de sinal. Para a cascata de sinalização de Hh, HH /GLI expressão do gene alvo foi examinado após a estimulação EGF [6] ou GLI1 induzível [16] ou Gli2 [9] activação de genes em queratinócitos humanos, ou na transformação de células induzida por GLI1 [7]. Para identificar alvos a jusante únicas dos genes GLI que funcionam na proliferação celular no contexto de carcinoma do cólon, que empregou um inibidor de molécula pequena de ambos GLI1 e Gli2, GANT61, identificada numa tela pequena molécula à base de células para os inibidores de GLI1 mediada transcrição [34]. GANT61 actua no núcleo para bloquear a função GLI1, inibe tanto GLI1- e GLI2- transcrição mediada, e demonstra um elevado grau de selectividade para HH /GLI sinalização [34]. Assim, GANT61 actua a jusante da cyclopamine (visando SMO) para inibir os determinantes finais da regulação transcricional HH.
Em duas linhas de células de carcinoma de cólon humano, HT29 e GC3 /c1, inibindo a via de sinalização HH usando GANT61 expressão diminuída de GLI1, Gli2 e o receptor de ligando HH, PTCH1, e inibiu a proliferação celular através da indução de acumulação no G1 /S de limite 24 horas após o tratamento, determinado por análise de citometria de fluxo. Em uma análise mais detalhada usando perfis de cDNA microarray de expressão gênica e quantitativa PCR em Tempo Real, p21
Cip1 (CDKN1A) e p15
Ink4b (CDKN2B), que podem provocar o G1 /S do ponto de verificação, foram-regulada, enquanto que genes que determinam ainda mais a entrada de G1 para a fase S incluindo E2F2, a ciclina E2 (CCNE2), Cdc25A e CDK2 foram reduzidos na expressão. Concomitante com a diminuição da progressão da fase G1 para a fase S, a diminuição da expressão da ciclina A2 (CCNA2), Cdc25C, a ciclina B2 (CCNB2), CDC20 e CDC2 (CDK1), que regulam a passagem de células através de G2 /M foram também demonstradas. genes novos adicionais que estão envolvidos na resposta ao estresse, e a resposta a danos no DNA, não previamente identificados após a cessação do HH sinalização em células cancerosas humanas, incluem os genes de resposta precoce DDIT2 (GADD45G), DDIT3 (GADD153), DDIT4 (REDD1), PPP1R15A (GADD34) e ATF3 que foram significativamente up-regulada. Genes envolvidos na síntese e reparo do DNA (Tyms, TOP2A, TK1, pólo, POLE2), e novos genes adicionais envolvidos na progressão ou de danos ao DNA respostas em fase S que foram significativamente regulada para baixo, incluem KIAA0101 (p15 [PAF]), Replication fator C variantes 2, 3, 4, 5, CDT1, a transcrição E2F fatores CDCA4 e TFDP1, MDC1, FANCD2, PCNA, e os genes envolvidos na reparação do ADN, RAD51C (XRCC3), RAD54B, RAD51 e infernos. Este estudo, portanto, genes que são regulados durante o encerramento da proliferação celular HH-dependente e sobrevivência em células cancerígenas do cólon identificados, e envolve genes associados com a prisão /S-fase G1, danos no DNA e as respostas ao estresse.
Resultados
GANT61 induz regulada para baixo expressão de genes GLI e acúmulo de células humanas de carcinoma do cólon no G1 /S
em HT29 e células C1 GC3 /tratados com GANT61 (20 mM) para até 48 h, a expressão de genes alvo e GLI1 Gli2 foram regulados negativamente, e também o receptor do ligando HH PTCH1, tal como determinado por qRT-PCR (Figura 1A). Subsequentemente, HT29 ou GC3 /C1 células foram tratadas, em duplicado, com GANT61 (20 uM) seguido por coloração com PI e análise citométrica de fluxo para a determinação da distribuição do ciclo celular entre G1, S e G2 /M fases (Figura 1B). Em ambas as linhas celulares, as células acumuladas no G1, 24 horas após o tratamento com GANT61. Em células HT29 tratados com GANT61, um aumento de 20% nas células em fase G1 foi associada com uma diminuição correspondente na células dentro da fase G2 /M (de 14%) e na fase S (5%), consistente com uma G1 /S prisão checkpoint. Em células C1 GC3 /, um aumento de 8%, em células em fase G1 às 24 h após o tratamento GANT61 também correspondia a uma redução semelhante em células na fase G2 /M do ciclo celular (Figura 1B).
As células foram tratadas durante 48 h com GANT61 (20 uM) ou com DMSO (controlo de veículo) de 0,2%. (A) qRT-PCR de GLI1, Gli2 e genes Ptch1 desde o tempo 0 a 48 h. (B) O DNA foi extraído em 24 horas após o tratamento, coradas com iodeto de propídio, e posteriormente analisadas para os efeitos de inibição da sinalização de Hh sobre a distribuição de fase das células no ciclo celular por citometria de fluxo.
cDNA microarray analisa identificar alterações na expressão de genes comuns e únicas para HT29 e GC3 /c1 após o tratamento GANT61
para delinear as mudanças na expressão gênica em HT29 e /C1 linhas de células de carcinoma do cólon humano GC3 em resposta ao tratamento com o antagonista GLI1 /Gli2, GANT61, a expressão de genes humanos foi 18,401 perfilado em células de controlo tratadas com veículo (DMSO a 0,2%) e em células tratadas com GANT61 (20 uM) durante 24 h. Genes com uma falsa Descoberta Classificação (FDR) -adjusted valor de p 0,001 e dobre mudança 1,5 foram considerados genes diferencialmente expressos (degs) induzida por GANT61 em relação ao controlo veículo, das quais 1.368 genes foram expressas diferencialmente no HT29 , e 1.002 genes em GC3 /células C1 (Figura 2). 755 genes ou 558 genes foram regulados positivamente, e 613 ou 444 genes foram regulados negativamente, em HT29 e células C1 GC3 /, respectivamente. 763 e 397 genes foram expressos diferencialmente e única para HT29 ou GC3 /C1, respectivamente. Dos 763 degs únicas para HT29, 459 (60%) eram sobre-regulada e 304 (40%) foram regulados negativamente. Da mesma forma, dos 397 degs únicas para GC3 /c1, 262 (66%) foram up-regulada e 135 (34%), regulada para baixo. Em contraste, 605 genes que representam 3,4% de todos os genes eram expressos diferencialmente que eram comuns a ambas as linhas celulares; Destes, 296 foram regulados positivamente (49%), e 309 (51%) foram regulados negativamente (Figura 2). Todos os genes comuns a ambos HT29 e GC3 /C1 que eram significativamente regulada para cima ou para baixo-regulada (p 0,001). Estão listados nas Tabelas 1 e 2, respectivamente
As células foram tratadas com GANT61 (20 uM) ou apenas veículo (0,2% DMSO) durante 24 horas, e extraiu-se o ARN total tal como descrito em Materiais e Métodos. Mudanças na expressão gênica foram determinadas pelo perfil genético cDNA microarray utilizando o Illumina Human-ref8 V3.0 matriz Bead-Chip. Genes com um falso Descoberta Rate (FDR) -adjusted valor p (p 0,001) e dobre as alterações 1,5 foram considerados degs. Painel superior: genes regulados positivamente. painel inferior: genes regulados por baixo. A expressão diferencial para o total, únicas-regulado, única regulada para baixo, comum-regulada e comum degs regulada para baixo, são mostrados.
Modulação da sinalização canônica vias seguintes inibição da HH sinalização
os genes com alterações significativas na expressão após o tratamento GANT61 foram atribuídos a diferentes vias de sinalização canônica e submetido a Ingenuity Pathway Analysis (IPA), onde a resultante 1.368 degs em HT29 e 1.002 degs em GC3 /C1 foram mapeados para redes definidas pela base de dados IPA (Figura 3). Para os degs mapeados, incluindo genes regulados tanto acima e para baixo, os 15 mais significativamente alterados vias canônicas em HT29 demonstrado -log (valor-p) variando 2,045-9,025, e em GC3 /c1 2,32-7,509. Dos 15 percursos que envolvem genes significativamente regulada para baixo, 12 eram comuns a ambas as linhas celulares. Os 3 vias comuns com o maior diferencial de expressão sub-regulada incluem genes envolvidos na resposta a danos no ADN, o controlo do ponto de verificação do ciclo celular, e a mitose. Outras vias regulada envolveu o G1 /S e G2 /M de DNA postos de controle de danos, o metabolismo precursor DNA e de sinalização celular que envolve diferentes vias, incluindo aqueles envolvidos em cânceres, que também demonstram 3 assinaturas única para ambos os HT29 ou GC3 /c1 (Figura 3 ). Dos 15 vias envolvendo os genes que são mais significativamente sobre-regulada, 8 são comuns a ambos HT29 e GC3 /C1, e 7 representam vias únicas para cada linha celular, o que demonstra uma maior diversidade de padrões de sobre-regulada a expressão do gene (Figura 3 ). Os caminhos-regulada comuns a ambas as linhas de células incluem as
Os 15 melhores vias de sinalização canônicos, como esteróides, piruvato, glutationa glicólise, ou glicerolípido, e não directamente relacionadas com o controle da proliferação celular relacionado metabolismo-. , determinado pelo IPA, que foram significativamente regulada para cima ou para baixo-regulado por tratamento GANT61 em HT29 e células GC3 /C1, são mostrados. Os 1.368 degs em HT29 e 1.002 degs em GC3 /c1 foram mapeados para a rede definidos IPA. Os valores de p de significância que determinam a probabilidade de que a associação entre os genes no conjunto de dados e da via canônica é por acaso foram calculadas pelo teste exato de Fisher, e são expressos como -log (valor-p). A. Pathways com enriquecidos genes regulados negativamente. B. Pathways com enriquecidos genes up-regulamentados. Azul: vias comuns a ambos HT29 e GC3 /C1. Vermelhos: Pathways exclusivos para qualquer HT29 ou GC3 /C1. quadrados amarelos:. Relação entre o número de degs que mapeiam para um caminho canônico específico dividido pelo número total de genes que compõem esse caminho
Genes que demonstram padrões de mudança vezes diferenciais em HT29-tratados GANT61 e /células C1 GC3
Dobre padrões de mudança de mais altamente degs em HT29 e GC3 /foram selecionados c1, analisadas e apresentadas em um mapa de calor para avaliar e comparar similaridade e diferenças na expressão diferencial entre as duas linhas de células tratadas com GANT61 (Figura 4). Além de genes com diversas funções que não estão directamente relacionados com a proliferação de HH-dependente, sobre-regulada genes que influenciam a G1 /transição S e subsequente progressão do ciclo celular, e que são comuns a ambas as linhas de células, incluem CDKN1A, e o DNA transcrições -Dano-induzíveis 3 e 4 (DDIT3 e DDIT4). Um considerável maior número de genes envolvidos na proliferação celular e de transição do ciclo celular através da fronteira G1 /S, a progressão da fase S e na transição G2 /M, foram significativamente regulada negativamente na expressão, e comum a ambas as linhas celulares. Estes incluem CDC6 (envolvidos no G1 /S), três genes que impulsionam a entrada ou a passagem através da fase S (CCNE2, E2F2) e G2 (CCNA2), genes envolvidos na replicação e reparação do ADN (Tyms, pólo, TOP2A, TK1, POLE2) e dois genes que regulam a mitose (AURKB, CDC20;. Figura 4, asteriscos)
O mapa de calor foi gerado em Matlab (Mathworks), e compara dobrar padrões de mudança das mais altamente degs em HT29 e células GC3 /C1 após o tratamento GANT61. Os mais altamente degs demonstrou um valor de p de p 0,001 entre o controlo de veículo (0,2% DMSO) e células tratadas com GANT61. Painel esquerdo (vermelho): genes up-regulamentados. Painel direito (verde): genes regulados por baixo. Genes marcados com asteriscos definir quais os genes com funções específicas em G1 /S de transição, a progressão da fase S, replicação de DNA ou de reparação, ou de regulação do G2 ou transições de fase M-. Dobre mudanças de todos os degs down-regulamentados e todos, mas um up-regulada DEG são ≤8 (bar espectro de cores central).
Dos 296 genes up-regulamentados, além dos genes comparativamente representada no mapa de calor que incluem DDIT3 (GADD153) e DDIT4 (REDD1), também foram identificados transcritos de novo ADN de danos adicionais induzível e incluem DDIT2 (GADD45G), PPP1R15A (GADD34) e ATF3 (Tabela 1). TP53INP1, que pode regular a paragem do ciclo celular, e TP53INP2, identificados nas respostas de morte celular, foram também regulado para cima. Dos 309 genes significativamente regulada em resposta a GANT61, novos genes identificados incluem KIAA0101 (p15 [PAF]), replicação Fator C variantes 2, 3, 4, 5, CDT1, a transcrição E2F factores CDCA4 e TFDP1, MDC1, PCNA , FANCD2, e os genes envolvidos na reparação do ADN, RAD51C (XRCC3), RAD54B, RAD51 e infernos (Tabela 2).
genes diferencialmente expressos envolvidos no G1 /S e G2 /M transições
para avaliar ainda mais os genes envolvidos no controlo da progressão do ciclo celular em células de carcinoma do cólon humano, após o tratamento GANT61, 10 genes envolvidos na G1 /S ou G2 /M transições, identificado por IPA, foram seleccionados para posterior análise. Os genes requeridos para a G1 /S de contorno para transição G1 /S, ou para a indução de uma G1 /S do ponto de verificação seguinte sinais citostáticos, incluem os dois inibidores de quinase dependentes de ciclina, p21
Cip1 (CDKN1A) e p15
Ink4B (CDKN2B), que foram supra-regulados por 5.2- 3.1- dobra e, 24 horas após a administração GANT61 (Tabela 3). genes adicionais necessários para a transição G1 /S que foram regulados negativamente incluem o factor de transcrição de E2 E2F2 (-4,2 vezes), e outros genes críticos que foram sub-regulada por 2.1- 3.2- a dobra, incluem ciclina E (CCNE2) , CDK2 e Cdc25A. No G2 /M, GANT61 induzida regulada negativamente a expressão de CCNA2 (CICLINA A2), a ciclina B1 (CCNB1), ciclina B2 (CCNB2), CDK1 (CDC2), e por 2,3 a Cdc25C 3.1- vezes (Tabela 3).
para determinar a robustez do gene cDNA microarray expressão profiling após o tratamento de HT29 e células GC3 /C1 com GANT61 (20 mM), durante 24 horas, qRT-PCR foi utilizado para determinar mudanças na expressão dos selecionados grupo de 10 degs determinados a partir dos cDNA microarrays. Os genes envolvidos e iniciadores sintetizados estão apresentados na Tabela 4. qRT-PCR foi realizada em ADNc gerado usando RNA total isolado independentemente de entre-tratada GANT61 HT29 e GC3 /células C1 para 0 h, 16 h, 24 h, 38 h e 48 h depois do tratamento. GAPDH foi utilizado para normalizar todos os dados de qRT-PCR. Genes determinados por qRT-PCR incluiu a expressão de E2F2, CCNE2, Cdc25A e CDK2 em G1 /S, que foram sub-regulada, a sobre-regulação de CDKN1A e CDKN2B em G1 /S, e a sub-regulação de CCNA2, Cdc25C, CCNB2 , e CDK1 na fase G2 /M (Figura 5). A sobre-regulada ou regulada negativamente as alterações na expressão de genes após o tratamento GANT61 e determinada pelo perfil de cDNA microarray, foram confirmadas por qRT-PCR (Figura 5).
As células foram tratadas só com veículo (0,2% DMSO) ou GANT61 (20 mM) durante 16 h, 24 h, 38 h, ou 48 h. O ARN total foi extraído e qRT-PCR foi realizada como descrito em Materiais e Métodos utilizando os conjuntos de iniciadores listados na Tabela 2. Os dados representam a média ± desvio padrão de 4 determinações, e GAPDH foi utilizada para normalizar os níveis de ARNm relativos.
Discussão
a via de sinalização HH é ativado em uma variedade de cancros humanos após mutações em genes que regulam canônica de sinalização HH, incluindo o receptor PTC, ea molécula de sinalização HH, SMO, e também pode ser activado por meio de sobre-regulação transcricional dos ligandos HH (revisto em [3]). Esta via está a tornar-se cada vez mais importante devido a ganhar conhecimento sobre o seu papel proeminente em muitos processos do desenvolvimento e na manutenção do fenótipo maligno em uma ampla variedade de cancros humanos, cujo crescimento foi encontrado para ser prevenida por inibição selectiva de HH constitutiva actividade da via de [14], [35], [36]. Os tumores do cérebro, da próstata, pele, pâncreas e rim demonstraram a necessidade de sinalização de Hh-GLI, e reagiram com a inibição do HH sinalização molécula alvo SMO por ciclopamina ou SMOshRNA [4], [19], [20] , [21], [22], [23].
os activadores de transcrição na sinalização de Hh incluem membros da família GLI de factores de transcrição, e GLI1 Gli2, que têm tanto distintos, bem como funções de sobreposição [16 ]. A activação das proteínas GLI é um processo complexo que envolve interacções modificações e de um número de vias reguladores positivos e negativos e não é totalmente compreendido [1], [14], [35]. Os genes alvo regulados pela via de sinalização de Hh diferem entre tecidos e tipos de células, bem como a ser influenciada pela presença ou ausência de factores reguladores co-expressas com proteínas GLI que eventualmente determinar os programas de transcrição activados por HH sinalização [6], [37 ]. Assim, as vias de sinalização oncogénicos convergem na sinalização de Hh canónica ao nível dos factores de GLI de transcrição e, adicionalmente, os genes alvo a jusante de GLI1 e Gli2 para aumentar ainda mais a via de sinalização de Hh em sobrevivência celular em doenças malignas [6], [7], [20 ], [38], [39], [40]. O fenótipo de sinalização de Hh é, portanto, significativamente influenciada e, em última análise determinada pela co-expressão de factores reguladores adicionais, e, portanto, pelo contexto celular de expressão do gene.
sinalização de Hh desempenha um papel no programa de diferenciação das vilosidades intestinais normais [11], [12], [41], e tem sido sugerido recentemente que as células epiteliais de cancro do cólon humano exibir um eixo de sinalização HH-GLI no processo da carcinogénese [24], [25]. Expressão de componentes da via HH-GLI foi consistentemente demonstrado em uma análise de 40 carcinomas primários humanos do cólon e tumores metastáticos para o fígado [26], em conformidade com as conclusões dos investigadores anteriores [25], [42], [43]. Assim, utilizando qRT-PCR, a expressão da GLI1, PTCH1, Gli2 e SHH foi determinada em todos os carcinomas do cólon humanos examinados. O requisito para ambos GLI1 Gli2 e para a proliferação e sobrevivência prolongada de linhas celulares de carcinoma de cólon humano in vitro, incluindo HT29, foi demonstrada utilizando a tecnologia siRNA [26]. Além disso, o knockdown de SMO por SMOshRNA impediu o crescimento de células HT29 em ratinhos SCID, enquanto HT29 em peso xenoenxertos subcutâneos respondeu a ciclopamina por redução do volume do tumor [26]. Assim, a activação de GLI1 canónica e Gli2 através SMO é importante para a sobrevivência e proliferação de células de carcinoma de cólon humano in vivo.
No estudo actual, a função de ambos GLI1 Gli2 e a jusante do SMO foi inibida na presença de GANT61, um inibidor de molécula pequena que foi identificado a partir de uma tela à base de células para inibir especificamente a transcrição mediada por GLI1, mas que também inibia a função de Gli2 [34]. Este agente foi seleccionado para inibir especificamente os árbitros finais de HH de sinalização, os fatores de transcrição GLI, na elucidação dos genes alvo a jusante que determinam a proliferação HH-dependente em células de carcinoma do cólon humano. Duas linhas celulares, bem caracterizados em nossos laboratórios, HT29 e GC3 /c1, foram tratados com GANT61 (20 mM), durante 24 horas, e a expressão de GLI1, Gli2 e mRNA PTCH1 foi regulada para baixo. Além disso, os efeitos sobre a proliferação celular, tal como determinada pela distribuição das células no interior da análise do ciclo celular e citometria de fluxo demonstraram acumulação de células em G1 a seguir ao tratamento, com uma diminuição concomitante de células a partir do compartimento de G2 /M, e no caso de HT29 , também a partir da fase-S, o que sugere a indução de uma G1 /S checkpoint.
HT29 e células GC3 /C1 foram tratados subsequentemente com GANT61 (20 uM) durante 24 horas, o ARN foi extraído e alterações no gene expressão foram determinadas por cDNA microarray Illumina profiling. Após as análises estatísticas, 1.368 genes em HT29 e 1.002 genes em GC3 /C1, foram determinadas para ser significativamente moduladas por tratamento GANT61 (FC 1,5; p 0,001). Para genes que foram sobre-reguladas na expressão, 296 genes eram comuns a ambas as linhas de células, e para os genes regulados de deslocamento, 309 genes eram comuns a ambas as linhas celulares. O bloqueio de células na fronteira G1 /S é evidenciado pela expressão sobre-regulada de p21
Cip1 e p15
Ink4b que em parte regular o G1 /S de transição. p15
Ink4b é um membro da família INK4 de inibidores de CDK, é induzida em resposta a sinais citostáticos [32], [44], e complexos com ciclina D /CDK4 ou ciclina D /CDK6 para mediar a paragem na fase G1 no a transição G1 /S em certos sistemas de [30], [32]. p21
Cip1 pode ligar-se uma ampla variedade de complexos de ciclina-CDK, com uma preferência por aqueles que contêm CDK2 (revisto em [31], [45], e durante um ciclo celular normal, facilita a formação de complexos de ciclina-CDK activa para promover proliferação celular. no entanto, quando superexpresso, p21
Cip1 forma um complexo inibitório com ciclina e /CDK2, levando a G1 e paragem fase consequentemente S-, formando assim o G1 /S checkpoint [46], [47]. o agendada momento de expressão de ciclinas e, a e B que accionam a progressão do ciclo celular, é reflectida nas alterações importantes nas fases do ciclo celular. ciclina e é expresso em níveis máximos em células que sofrem a transição G1 para S, declinando durante S- progressão da fase, de tal modo que as células G2 /M são ciclina e-negativa (revisto em [30]). ciclina a é expresso em G1 tardia, demonstra a expressão acentuada durante a fase S, e aumenta à medida que as células avançar para G2, com a degradação in início da mitose; ciclinas de tipo B começam a ser expressas na fase S tardia, e conduzir as células embora G2- e M- fases do ciclo celular [30]. CDK2 controla o G1 /S de transição por complexação com a ciclina E, e é activado por Cdc25A, que desfosforila CDK2 [48]. CDC2 controla a entrada em mitose celular na transição G2 /M, formando assim complexos com ciclinas A e B, é activado por cdc25C, e é sub-regulada em M-fase tardia [29]. Todos estes genes são regulados negativamente em expressão em resposta à inibição da função GLI1 /Gli2 (Tabela 2). Assim, os sinais induzida para promover a acumulação celular em G1 /S de chumbo para a repressão de genes que regulam a progressão do ciclo celular, e p21
expressão Cip1 foi mostrado para esgotar a expressão de genes que regulam a replicação e reparação do ADN, e a mitose [49], [50], [51]. No presente estudo desses genes incluem CDC6 (ativa no G1 /transição S e essencial para a iniciação da replicação do DNA), Tyms, TOP2A, TK1, POLE e POLE2 (fase S) e AURKB e CDC20 (mitose [52] [53]), determinada pela análise do mapa de calor. Uma representação esquemática dos genes envolvidos na inibição induzida pela GANT61 de progressão do ciclo celular na progressão /S, S-fase G1, G2 e regulação durante e fases M, identificados a partir de cDNA microarrays, análise do mapa de calor, e por qRT-PCR , é mostrado na Figura 6, e envolve a 5 das 12 vias de sinalização comuns determinados por análise de IPA.
de cDNA microarray, mapa de calor, e análises de qRT-PCR, os genes envolvidos em diferentes fases do ciclo celular, incluindo o G1 /S de transição e progressão através S- G2- e fases M-, são mostrados. Os genes identificados incluem inibidores de CDK, membros da CDK e famílias CDC, ciclinas, genes envolvidos na replicação e reparação do ADN, e os genes que regulam o fuso mitótico, e envolvem 5 das 12 vias de sinalização comuns determinados por análise IPA. Vermelho: genes regulados positivamente. Verde: genes regulados por Down. máscara clara → máscara escura, aumento da expressão diferencial.
gene cDNA microarray Comprehensive profiling análise dos genes que determinam o fenótipo sinalização HH foi realizado apenas em modelos de células não-cancerosas. Nestes sistemas, a activação GLI foi estimulada pelo tratamento com EGF [6], GLI1 estável ou expressão de HA-RAS [7], ou a expressão de Gli2 constitutivamente activada [16]. Nesses estudos, a ciclina D [6], [7], GADD153 [7], CDKN2B, CDKN1A, CDK2, PCNA, TOP2A, CCNB1, XRCC1 [16], foram identificados como genes ativados a jusante da GLI.