Abstract

O câncer gástrico é uma das causas mais comuns de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo. Expressão da proteína supressora de tumor, leucemia promielocítica (PML), é reduzida ou abolida em carcinomas gástricos, em associação com um aumento do nível de invasão linfático, o desenvolvimento de maior estadiamento pTNM, e o prognóstico desfavorável. Aqui, foi investigada a relação entre a extensão de linfócitos que se infiltram no tumor e o estado da expressão da proteína PML em carcinoma gástrico avançado. Observou-se maior número de infiltração de células T em tecidos de carcinoma gástrico em que a expressão PML foi reduzida ou nula, em comparação com os tecidos positivos para PML. A extensão da migração de células T para os sobrenadantes de cultura obtidos a partir de linhas celulares de carcinoma gástrico interferão-gama (IFN-γ estimuladas foi adicionalmente afectada pela expressão de PML

In vitro

. Proteína de interferão-gama indutível 10 (IP -10 /CXCL10) expressão foi aumentado nos tecidos do carcinoma gástrico exibindo níveis reduzidos PML. Além disso, tanto in

Pml

nocaute e células knockdown exibido expressão aumentada de ARNm de IP-10 e de proteína na presença de IFN-γ. PML knockdown aumento sinal do transdutor e activador da transcrição-1 (STAT-1) se ligar ao promotor de IP-10, resultando na transcrição elevado do gene de IP-10 de IFN-mediada γ. por outro lado, a expressão da proteína PML IV suprimida-10 IP activação promotor . com base nestes resultados, nós propomos que a perda de expressão da proteína PML em células de cancro gástrico contribui para o aumento da transcrição de IP-10

através

reforço da actividade de STAT-1, que, por sua vez, promove o tráfico dos linfócitos dentro de regiões tumorais .

Citation: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) perda da proteína leucemia promielocítica no câncer gástrico: Implicações para o IP-10 Expressão e Tumor-linfócitos infiltrantes. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10.1371 /journal.pone.0026264

editor: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), Estados Unidos da América

Recebido: 21 Abril, 2011; Aceito: 23 de setembro de 2011; Publicação: 12 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Ciência básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2010-0.015.506) para Y-HC, pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo governo da Coreia (MEST) (2010-0029353) para JLK, e por RO1 NS50665 para ENB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é uma das causas mais freqüentes de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Os avanços recentes na genética têm facilitado a detecção de eventos que ocorrem durante o curso da carcinogénese gástrica, incluindo a activação de oncogenes, silenciamento de genes supressores de tumores, e a mutação de genes envolvidos na reparação do ADN [1]. Entre estes acontecimentos genéticos, sabe-se que a expressão de supressor de tumor da leucemia promielocítica (PML) proteína seja reduzida ou abolida em cancro gástrico, e que esta está associada com mais extensa invasão linfático, maior estadiamento pTNM, e o prognóstico desfavorável, o que sugere que a perda de PML é ligado a progressão carcinogénese e o carcinoma gástrico [2]. Estudos anteriores implicados dele

Pml

disfunção na progressão de uma variedade de cancros, e expressão reduzida ou abolida de LMP foi reportado em próstata, mama, cólon, SNC, pulmão, cancros gástricos e [2], [3] .

o gene

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foi originalmente identificado por fusão com o receptor de ácido retinóico envolvido em t (15; 17) translocação cromossómica associada com a leucemia promielocítica aguda (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML é uma proteína supressora de tumor, que regula a progressão do ciclo celular, a transcrição de genes, a supressão de transformação, e a apoptose.

Pml

ratinhos knockout são consideravelmente mais sensível à formação de tumores após a exposição a agentes cancerígenos que são controlos de tipo selvagem, e

Pml

-deficient células são menos propensos a sofrer apoptose após a aplicação de tipos particulares de estresse celular [9]. Além de relatórios focados no papel supressor de tumor interpretado por PML, vários estudos confirmaram que a proteína age como um regulador da transcrição,

via

associação com a proteína co-ativador de ligação CREB-; co-repressores incluindo HDAC, N-CR, e mSin3A; e os factores de transcrição Nur77, AP-1, myc, p53, e STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

mutação progressiva de alterações genéticas e em vários genes supressores de tumor promover o desenvolvimento e progressão tumoral [18]. Além de alterações genéticas em células tumorais, ambas as células inflamatórias e mediadores contribuir para a formação de micro-ambientes particulares de tumor [19], [20]. fibroblastos associados a tumores (TAF), e macrófagos (TAMs) também estão envolvidos na modulação do microambiente tumoral

através

produção de citocinas, quimiocinas, interferões e outros factores biologicamente activos [21], [22]. Conversa cruzada entre as células tumorais, TAFs, MAT e linfócitos, é significativo no desenvolvimento e progressão do tumor, e contribui para o estabelecimento do microambiente do tumor enriquecidas na expressão de uma variedade de factores biologicamente activos [23], [24], [25] [26], [27].

TAM estão correlacionadas com a angiogénese e um prognóstico desfavorável em vários tipos de cancro, incluindo o cancro gástrico [22], [28]. mastócitos produz muitos factores angiogénicos e uma variedade de citoquinas, e a sua densidade tem sido relatada a altamente correlacionado com a extensão da neoangiogénese do tumor e o prognóstico pobre [29], [30]. CD4

+ e CD8

+ linfócitos também são encontrados numa variedade de tecidos de cancro sólidos. Até agora, os mecanismos moleculares precisos pelo qual o tipo eo número de células infiltrantes tumorais são regulados são em grande parte desconhecido. Existem vários relatos controversos no que diz respeito ao número e função de linfócitos que se infiltram no tumor. Especialmente, CD8

+ T linfócitos, enquanto que a sua função é conhecida para eliminar células transformadas nascentes e contribuir para a vigilância imunológica [31], é relatado que

células T CD8 + infiltrantes tumorais estão com defeito na função fase efetora após contacto com células tumorais [32], e a sua infiltração é ligada ao prognóstico desfavorável em certos tipos de cancro, tais como cancro do pulmão de células nonsmall e carcinoma nasofaríngeo [33], [34].

As quimioquinas segregadas pelas células do estroma ou tumoral células influenciar a migração de células de tumor, invasão, proliferação, a angiogénese e a infiltração de células imunitárias na massa tumoral [35]. IFN-γ-indutível da proteína-10 (IP-10, CXCL10) é uma das quimioquinas CXC, que desempenha várias funções em doenças inflamatórias e cancro [36], [37]. Uma vez que a IP-10 preferencialmente promove respostas imunes Th1 por robustamente atraindo as células NK e T, que é sugerido como um dos possíveis mecanismos de infiltração de células T aos tumores.

se a perda de genes supressores de tumores em células de tumor induz o recrutamento de linfócitos e modulação das funções de tais células dentro de microambientes tumorais é actualmente pouco claro. No presente estudo, nós examinamos PML função no que diz respeito ao recrutamento de linfócitos e a modulação da expressão de factores derivados do tumor. A expressão de PML foi inversamente correlacionada com a extensão da infiltração de células T CD8

+ células-T em carcinomas gástricos. perda LMP foi ainda associado com a expressão aumentada de IP-10, uma das quimiocinas CXC de atracção de linfócitos, em células de carcinoma gástrico e tecidos. PML knockdown promovido IFN-γ mediada por STAT-1 se ligar ao promotor de IP-10, resultando no aumento da transcrição do gene PI-10. Os nossos dados suportam a noção de que a PML está envolvido no recrutamento de linfócitos nos tumores,

via modulação dos níveis de factores derivados do tumor, incluindo IP-10 de expressão, fornecendo mais evidências de que a perda de genes supressores de tumor em tumores células participa ativamente do estabelecimento de microambientes tumorais.

resultados

Perda de proteína PML está associada com aumento da infiltração de células T CD8

+ T-células em tecido de carcinoma gástrico avançado

coloração imuno-histoquímica para PML e CD8 foi realizada para investigar se a extensão da infiltração de linfócitos foi associado com status de expressão PML no cancro gástrico avançado. As células CD8-imunopositivos foram enumerados como descrito em Materiais e Métodos. No total, 35 amostras (71,4%) apresentaram perda parcial-completo-a da PML nos núcleos de células de tumor de fase IV carcinomas gástricos avançados. As amostras de 14 pacientes com carcinoma gástrico avançado eram difusamente positivo para PML, e tem uma média de 32,7 CD8

+ células-T por campo (Figura 1A). Foram identificados 19 casos de carcinoma gástrico avançado que apresentam positividade focal para PML, com uma média de 47,2 CD8

+ células-T por campo. Além disso, foi observada a perda completa da PML em 16 doentes com carcinoma gástrico avançado; as amostras continham um número médio de 52,8 CD8

+ células-T por campo. As amostras que apresentam positividade focal ou perda completa para PML mostrou um aumento mais acentuado na CD8

+ número de células T que não sejam espécimes fez exibindo positividade difusa para PML. Imagens representativas são mostrados na Figura 1B. Embora a expressão da proteína PML foi reduzida ou abolida em células de tumor, todos de glândulas normais da mucosa gástrica, tecidos estromal e as células linfóides, exibiu imunopositividade nuclear moderada a forte difusa para a LMP.

(A) para coloração imuno-histoquímica proteína PML e CD8 foi realizada em 49 casos de estágio IV carcinomas gástricos avançados. Imunopositividade para a proteína PML foi categorizada como positividade difusa (DP; imunorreactividade nuclear em ≥50% de células tumorais, n = 14), positividade focal (FP; em ≥10% mas 50%, n = 19), ou perda completa (Cl; em 10%, n = 16). O número de células imunopositivas CD8 em um campo de alta potência (HPF, X40) de 0,25 milímetros

2 para cinco fronteiras infiltrativas tumorais seleccionadas aleatoriamente foram contadas para cada amostra, seguido por cálculo da média e desvio padrão. (B) Imagens representativas que mostram a expressão da proteína PML e infiltração de células T +

CD8 em tecidos de carcinoma gástrico avançado. Bares, SD. *

P

. 0,05

influências PML infiltração de células T /migração

in vitro

Tendo em conta a perda de PML expressão de proteínas eo aumento da infiltração de CD8

+ linfócitos T em tecidos de carcinoma gástrico avançado, a hipótese de que PML contribuiu para infiltração de células T /migração no câncer gástrico. Para explorar se o nível de PML em células de cancro gástrico influenciaram a migração de células T, a partir de meios condicionados SNU-638 células transfectadas transientemente com quer

Pml

siRNA ou LMP IV vector de expressão, em seguida, tratados com IFN-γ foi utilizado em Transwell ensaios de migração. SNU-638 células cancerosas gástricas expressas altos níveis de proteína PML, consistente com resultados anteriores [2], Considerando SNU-638 células transfectadas com

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siRNA exibido níveis reduzidos de expressão PML endógena (~46-56%) , tal como confirmado por imunotransferência (Figura 2A). IFN-γ induzido um aumento modesto na expressão da proteína PML, de acordo com os resultados anteriores [38]. A migração de células T de Jurkat para meio condicionado a partir de

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células SNU-638 transfectadas com ARNsi foi significativamente melhorada, em comparação com a das células transfectadas com ARNsi de controlo, após o tratamento com IFN-γ (Figura 2B). Após a transfecção de SNU-638 com o vector de expressão de PML IV, a migração de células T de Jurkat para meio condicionado a partir de células sobre-expressos PML IV foi reduzida em comparação com a do vector vazio (Figura 2C). Estes resultados sugerem que a PML regula os níveis de moléculas produzidas por secretoras e libertados a partir

SNU-638 células de cancro gástrico (A) de IFN-γ-estimuladas células gástricas cancerosas, e também influencia a migração de linfócitos T-. foram transientemente transfectadas com

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ou ARNsi de controlo. Dois dias após a transfecção, as células foram tratadas com ou sem o interferão-gama (IFN-γ (10 ng /ml) durante 8 h e lisadas e analisadas por imunotransferência. Supressão mediada por siRNA eficaz da expressão da proteína PML foi verificada para cada ensaio por imunotransferência . (B) células de Jurkat e a partir de sobrenadantes de cultura de células SNU-638 que foram transfectadas transientemente quer com ARNsi de controlo ou

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siRNA foram analisados ​​por um ensaio de migração Transwell. Após a transfecção, as células SNU-638 foram incubadas com IFN -γ (10 ng /ml) durante 8 h ou deixado sem tratamento, e os sobrenadantes recolhidos foram colocados em câmaras inferiores. as câmaras superiores recebeu 5 × 10

5 células de Jurkat em um volume de 100 ul e as unidades de migração Transwell foram incubadas a 37 ° C durante 2 h. a migração de células de Jurkat a partir da parte superior de câmara inferior foi analisada por células colhidas das mais baixas câmaras por fluorescente contagem de grânulo mediadas por contagem num citómetro de fluxo de examinar. migração celular relativa foi determinada através do número de células que migraram normalizados para o número de células que migram para os sobrenadantes de células SNU-638 transientemente transfectadas com ARNsi de controlo sem IFN-γ, e o valor a partir de células progenitoras foi arbitrariamente definida em 1. (C) SNU-638 células de cancro gástrico foram transientemente transfectadas com vector vazio ou vector de expressão de PML IV (Mock) (PML IV). Dia após a transfecção, as células foram tratadas com ou sem IFN-γ (10 ng /ml) durante 8 h e sobrenadantes da cultura foram obtidas e sujeitado à Transwell ensaio de migração, conforme descrito na expressão da proteína PML B. foi verificada para cada ensaio por imunotransferência. Os dados apresentados são representativos de pelo menos três experiências. Bares, SD. *

P

. 0,05

Perda de PML aumenta a IFN-γ induzido por IP-10 expressão

As quimiocinas, uma família de citocinas quimiotáticas, promover a migração de circulação de leucócitos /linfócitos para locais de inflamação e lesão. Para explorar se os níveis de quimiocinas foram afetados pelo

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status genético, a expressão do gene de quimiocina foi examinada usando ensaio de protecção de ribonuclease (RPA).

Pml

+ /+ e

Pml

– /- fibroblastos de rato embrionárias células (MEF) foram incubadas na ausência ou na presença de IFN-γ por 0-24 h , ARNm total foi recolhido a vários pontos de tempo, e submetido a RPA. Em

Pml

– /- MEFs, IP-10 os níveis de ARNm aumentou 1,5 vezes em 2 h, e tornou-se marcadamente elevada (8 vezes) por 4 h (Figura 3A). Os níveis de ARNm de RANTES foram aumento de 3,2 vezes em 0,5 h, e permaneceram elevados, mas a um grau inferior (1,3 vezes), 8 h de pós-tratamento de IFN-γ

Pml

– /- MEFs . Outros genes de quimiocinas, incluindo MIP-1, MIP-2 e MCP-1, não foram detectável expressa em

Pml

+ /+ ou

Pml

– /- MEFs (dados não mostrados). STAT-1 expressão foi aumentado após a exposição ao IFN-γ em ambos os tipos de células, mas nenhuma diferença foi evidente quando os níveis de IFN-y foram comparados entre os

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+ /+ e

Pml

– /- células. Como a transcrição do gene de IP-10 foi substancialmente elevada em IFN-γ estimulada

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– /- MEFs, medimos níveis de proteínas relevantes em sobrenadantes de cultura de

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+ /+ e

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– /- MEFs, usando um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Consistente com os resultados do EPR, níveis mais elevados de proteína de IP-10 eram evidentes em meio condicionado a partir de IFN-tratadas-γ

Pml

– /- MEFs (Figura 3B). Além disso, o IP-10 de expressão de mRNA em

Pml

células NIH3T3 transfectadas com ARNsi foi melhorada, em comparação com a das células transfectadas com ARNsi de controlo, após o tratamento com IFN-γ (Figura 3C). A redução da expressão da proteína PML no

Pml

células NIH3T3 transfectadas com siRNA foi confirmada por immunoblotting

-. /- MEFs em comparação com

Pml

+ /+

células de tipo selvagem. (A) ARN de

Pml

+ /+ e Pml

– /- MEFs tratados com IFN-γ (10 ng /ml) durante 0-24 h foi submetida a ensaio de protecção de ribonuclease ( RPA). Quantificação de IP-10, RANTES e STAT-1 ARNm (quadruplicou) foi calculado dividindo o valor densitométrico de cada pista pelo valor correspondente GAPDH. (B)

Pml

+ /+

e

Pml

– /- MEFs células foram incubadas na ausência ou na presença de IFN-γ (10 ng /ml) durante 12 h. proteína de IP-10 a partir dos sobrenadantes de cultura foram analisados ​​por ELISA e normalizados pela concentração de proteína celular. A concentração relativa foi calculada como a quantidade normalizada dividido pela quantidade normalizada de não tratada

Pml

– /- células MEFs. fibroblastos (C) NIH3T3 foram transfectadas transientemente com quer

Pml

ou ARNsi de controlo. Dois dias após a transfecção, as células foram tratadas com ou sem IFN-γ para 0-24 h, e analisadas através de imunotransf erência para a detecção da expressão da proteína PML e RT-PCR para mRNA de IP-10. Quantificação (quant) de IP-10 mARN foi calculado dividindo o valor densitométrico de cada pista pelo valor correspondente ARNm da actina. Os dados apresentados são representativos de pelo menos três experiências. Bares, SD. *

P

. 0,01

expressão PML Reduzido é inversamente correlacionada com IP-10 níveis de proteína no tecido do cancro gástrico e SNU-638 células

Em seguida, foi examinada a relação entre IP-10 e a expressão da proteína PML em tecido de carcinoma gástrico avançado. tecidos de cancro foram imuno-histoquimicamente coradas para a LMP e IP-10, e a intensidade de IP-10 imunopositividade foi medida como descrito em Materiais e Métodos. A intensidade média de IP-10 foi de 1,2 em 14 amostras que apresentam positividade difusa (DP) para PML, 2,2 em 19 casos de positividade focal (FP), e 2,0 em 16 amostras em que houve perda total (CL) de expressão PML ( Figura 4A, painel da esquerda). aumentos significativos na expressão IP-10 foram observadas em amostras mostrando positividade focal de PML (

P

= 0,034), em comparação com aqueles que mostra a expressão PML positiva difusa. Um aumento na expressão de IP-10 foi observada quando a perda completa de LMP foi evidente, em comparação com o que foi observado quando LMP foi expressa de forma difusa; no entanto, esta diferença não atingiu significância estatística. Os exemplos representativos de variações do estado da proteína PML que se correlacionaram com diferentes IP-10 os níveis de expressão em células tumorais de carcinomas gástricos avançados são mostrados (figura 4A, direita). Para examinar ainda mais a relação entre a expressão da proteína IP-10 e PML em linhas de células de carcinoma gástrico, IP-10 níveis de proteína foram medidos em sobrenadantes de cultura de SNU-638 células transfectadas transitoriamente com qualquer um

Pml

siRNA ou PML IV exression vetor. As células foram cultivadas na ausência ou na presença de IFN-γ durante 8 h, os sobrenadantes recolhidos e IP-10 níveis quantificados nela (por ELISA). induzida por IFN-γ secreção de IP-10 foi significativamente aumentada em SNU-638-

Pml

células transfectadas com ARNsi, em comparação com a de células SNU-638 transfectadas com ARNsi de controlo (Figura 4B). A transfecção de SNU-638 com PML IV vector de expressão reprimida induzida por IFN-γ IP-10 a secreção (Figura 4C). Os resultados mostram claramente que a secreção de IP-10 a partir de células de cancro gástrico é aumentada quando a expressão de PML é reduzida.

(A) coloração imuno-histoquímica para a LMP e IP-10, a expressão da proteína foi realizada durante 49 casos de estádio IV avançada Os carcinomas gástricos. Imunopositividade para a proteína PML foi categorizada como positividade difusa (DP; imunorreactividade nuclear em ≥50% das células tumorais), positividade focal (FP; em ≥10% mas 50%), ou perda completa (Cl; em 10% ). Para a análise quantitativa da imunorreactividade de IP-10, positivamente áreas manchadas foram medidas utilizando um programa de software ImageJ como descrito em Materiais e Métodos. Imagens representativas mostram LMP e IP-10 de expressão de proteínas em tecidos do carcinoma gástrico avançado (direita). (B) As células SNU-638 foram transientemente transfectadas com

Pml

ou ARNsi de controlo. Dois dias após a transfecção, as células foram incubadas na ausência ou na presença de IFN-γ (10 ng /ml) durante 8 h. proteína de IP-10 a partir dos sobrenadantes de cultura foram analisados ​​por ELISA e normalizados pela concentração de proteína celular. A concentração relativa foi calculada como a quantidade normalizada dividida pela quantidade normalizada de células SNU-638 que foram transitoriamente transfectadas com ARNsi de controlo, na presença de IFN-γ, e a concentração de células parentais foi arbitrariamente estabelecido em 100%. (C) SNU-638 células de cancro gástrico foram transientemente transfectadas com vector vazio ou LMP IV vector de expressão. Dia após a transfecção, as células foram tratadas com ou sem IFN-γ (10 ng /ml) durante 8 h e sobrenadantes da cultura foram obtidos e submetidos a ELISA tal como descrito na expressão da proteína PML B. foi verificada para cada ensaio por imunotransferência. Os dados apresentados são representativos de pelo menos três experiências. Bares, SD. *

P Art 0,05, **

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. 0,01

IP-10 de neutralização diminui a migração de células T

como SNU-638-

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células contendo siRNA que expressam níveis reduzidos de proteína PML mostrou melhoria do recrutamento de células T e a secreção de IP-10 em resposta ao IFN-γ (Figuras 2 e 4), que ao lado examinados se um aumento em níveis de IP-10 facilitou a migração de células T para o meio condicionado a partir de células SNU-638 de cancro gástrico estimuladas pelo IFN-γ. SNU-638-

Pml

células de siRNA foram cultivadas na ausência ou na presença de IFN-γ durante 8 h, e os sobrenadantes recolhidos foram pré-tratados com um anticorpo neutralizante anti-IP-10 ou o controlo não-específico para a IgG 1 h, antes do início do ensaio Transwell. Anticorpo neutralizante ou contendo IgG sobrenadantes foram colocados em câmaras menores, e da migração de células de Jurkat de superior às câmaras inferiores foi analisada por células colhidas das câmaras inferiores examinar. Inclusão de-neutralizante 10 IP anticorpos inibiu a migração de células T de Jurkat para meio condicionado a partir de SNU-638-

Pml

siARN células (Figura 5A). Estes achados são consistentes com os dados obtidos a partir de células NIH3T3; um anticorpo de IP-10 neutralizantes inibida EL-4 migração de células T para o meio condicionado a partir de NIH3T3-

Pml

células siRNA (Figura 5B).

(A) SNU-638-

Pml

células de siRNA foram cultivadas na ausência ou na presença de IFN-γ (10 ng /ml) durante 8 h e o sobrenadante foi recolhido e pré-tratados com anticorpos neutralizantes de IP-10 (5 ng /ml) ou IgG (5 ug /ml) durante 1 h antes do início do ensaio de migração Transwell. O número de células que migram Jurkat obtidos a partir da câmara inferior foi analisada por contagem de grânulo contagem mediada fluorescente num citómetro de fluxo. (B) a migração de células Transwell EL-4 a partir de sobrenadantes de cultura de células NIH3T3 transfectadas transientemente com

Pml

siRNA na presença de neutralização de IP-10 de ratinho ou IgG de controlo. migração celular relativa foi determinada pelo número de células que migraram, dividido pelo número de células que migram para sobrenadantes sem IFN-γ, e o valor a partir de células progenitoras foi arbitrariamente estabelecidos a 1. Os dados apresentados são representativos de pelo menos três experiências. Bares, SD. *

P

. 0,05

knockdown PML aumenta IP-10 promotor de ativação

As-10 IP expressão foi aumentada em células PML knockdown, nós explorada se a expressão da proteína PML afectada de IP-10 a actividade do promotor. O promotor murino IP-10 contém um elemento GAS-like putativa que se encontra entre NTS -246 e -238 (TTN

5AA) (Figura 6A). Nós relatado anteriormente que a PML regula negativamente a actividade de transcrição de STAT-1 [17]. Para verificar se PML afetados IP-10 expressão genética induzida por IFN-γ

via

um mecanismo envolvendo STAT-1, foram isoladas e gerou uma construção repórter com início na posição -330 do IP-10 promotor murino contendo o putativo para gás de elementos semelhantes, como descrito em Materiais e Métodos. A IP-10

Luc

repórter contendo o elemento GAS-como foi transitoriamente transfectado em células NIH3T3 incubadas com ou sem IFN-γ durante 24 h, e, subsequentemente analisadas quanto à actividade de luciferase. induzida por IFN-γ actividade do promotor de IP-10 foi significativamente aumentada em células NIH3T3 transfectadas com o

Pml

siRNA, em comparação com células que recebem ARNsi de controlo (Figura 6B). Após a transfecção de células NIH3T3 com o vector de expressão de PML IV, induzida por IFN-γ IP-10 de activação do promotor foi significativamente reprimido. Regulação negativa da expressão PML usando

Pml

siRNA e superexpressão de PML por PML IV vetor de expressão foram verificadas por immunoblotting. Para determinar se o efeito inibidor de PML em induzida por IFN-γ actividade do promotor PI-10 ocorreu em gástricas linhas de células cancerosas, que realizou experiências semelhantes com SNU-638 células de cancro gástrico. Os padrões de aumento e diminuição na actividade da luciferase em SNU-638 foi semelhante ao de células NIH3T3 (Figura 6c). O nível de expressão da proteína PML em SNU-638 células transfectadas com

Pml

siRNA ou LMP IV vector de expressão foi verificada por meio de imunotransferência (dados não mostrados).

(A) A murino IP- 10 promotor contém um gás de elementos semelhantes a putativa (sublinhada). (B) As células NIH3T3 foram co-transfectadas com o repórter em IP-10 Luc que contém um gás de elementos do tipo e /ou

Pml

ARNsi, ou o vector de expressão da proteína PML IV. As células foram ou não tratados ou tratados com o IFN-γ murino (10 ng /ml) durante 24 h, e, em seguida, foi determinada a actividade da luciferase. O vector pCMV-β-galactosidase foi incluído para normalizar a eficiência da transfecção. A actividade da luciferase é normalizada para a actividade na ausência de IFN-γ e a actividade de células parentais foi arbitrariamente regulado para 100% (RLA; actividade de luciferase relativa). a expressão da proteína PML aumentada ou reduzida em lisados ​​de células transfectadas com vector de expressão de PML IV ou

Pml

siARN foi verificada por imunotransferência, respectivamente. (C) SNU-638 células de cancro gástrico foram co-transfectadas com o repórter IP-10-Luc que contém um gás de elementos do tipo e /ou

Pml

ARNsi, ou o vector de expressão da proteína PML IV e analisados ​​como descrito em B. os valores são a média ± DP de três experiências separadas. Bares, SD. *

P Art 0,05, **

P

. 0,001

LMP aumenta knockdown IFN-γ induzido por STAT-1 DNA ligação ao IP -10 promotor

o efeito de LMP de IFN-γ induzida por STAT-1 de ADN de ligação ao promotor de IP-10 foi adicionalmente examinada. a sobre-expressão da proteína PML em células NIH3T3, após transfecção transitória com o vector de expressão de PML IV, parcialmente bloqueado IFN-γ induzida por ligação ao promotor de IP-10 de ADN de STAT-1, incluindo a sequência de -246 a -238 (Figura 7A, comparar pistas 3 e 5). Competição utilizando um excesso de oligonucleótido não marcado 100-molar que codifica o promotor de IP-10 anulou a formação do complexo (pista 6). Os níveis de PML e STAT-1 em expressão de proteína de lisados ​​de células completas (WCL) e a medida de STAT-1 fosforilação da tirosina em extractos nucleares (NE) foram verificadas por imunotransferência. Utilizando NE de NIH3T3-

Pml

células siRNA obtida após 0,5 h de tratamento com IFN-γ, forte ligação com o promotor murino de IP-10 foi observado (Figura 7B, painel superior, pista 5), ​​comparado com ligação observada em células NIH3T3 siRNA de controlo (pista 3). Os mesmos NEs foram expostos ao oligonucleotídeo consenso STAT-1, e vinculativa STAT-1 DNA foi reforçada no NE de NIH3T3-

Pml

células siRNA (Figura 7B, painel do meio, comparar pistas 3 e 5). Usando SNU-638 células de cancro gástrico, também descobrimos que a ligação de ADN de STAT-1 de

Pml

células SNU-638 transfectadas com ARNsi foi melhorada em comparação com a das células transfectadas com ARNsi de controlo, após o tratamento com IFN-γ (Figura 7C, comparar pistas 3 e 5). Estes dados indicam que a PML inibe parcialmente STAT-1 se ligar ao promotor de IP-10, e que este efeito é correlacionada com a induzida por IFN-γ aumentada de IP-10 a transcrição na ausência da PML.

(A) os extractos nucleares (NE) a partir de células NIH3T3 transfectadas transientemente com o vector de expressão da proteína PML IV e tratadas com IFN-γ (10 ng /ml) durante 30 min foram incubadas na presença de uma sonda de ADN marcado radioactivamente contendo o gás de elementos semelhante da IP-10 promotor, e submetidos a teste de desvio de mobilidade electroforética (EMSA). complexos de sonda de proteína-Shifted são indicadas pela seta. O aumento da expressão da proteína PML em lisados ​​de células completas (WCL) transfectadas com o vector de expressão de PML IV foi verificada por imunotransferência. A quantidade de histona em NE é mostrado como controlo. (B) NEs de células NIH3T3 transfectadas transientemente com quer

Pml

ou ARNsi de controlo e tratadas com IFN-γ (10 ng /ml) durante 30 min foram incubadas na presença de sondas de ADN marcado radioactivamente contendo a GAS- como elemento do promotor PI-10, ou uma sequência de consenso de STAT-1, e, em seguida, submetidos a EMSA. especificidade de ligação foi testada através da adição de concentrações crescentes de sonda fria (competidor). supressão mediada por siRNA eficaz de expressão da proteína PML foi verificada para cada ensaio por immunoblotting. (C) SNU-638 células de cancro gástrico foram transfectadas transientemente com quer

Pml

ou ARNsi de controlo e tratadas com IFN-γ (10 ng /ml) durante 30 min. NEs foram obtidos, incubadas na presença de sondas de ADN marcadas radioactivamente que contêm uma sequência de consenso de STAT-1, e, em seguida, analisadas por EMSA como descrito em B. Os níveis de PML e STAT-1 em expressão de proteína WCL e a extensão de STAT-1 de tirosina fosforilação no NE foram verificadas por immunoblotting. Os dados apresentados são representativos de pelo menos três experiências.

Discussão

estudos histopatológicos têm mostrado que o microambiente inflamatório de tumores é caracterizada pela presença de infiltrados de células mononucleares, tanto no apoio regiões do estroma e tumorais. No entanto, os mecanismos precisos pelos quais as células mononucleares infiltrar para dentro e são sustentados dentro de tecidos de câncer são não foi totalmente esclarecida. No presente estudo, nós oferecer evidência de que a perda de expressão da proteína supressora de tumor, PML, contribui para o aumento da infiltração de linfócitos no tecido do cancro gástrico,

através

regulação da expressão de IP-10.

Nós examinamos a função da PML no que diz respeito ao recrutamento de linfócitos utilizando amostras de tecido de cancro gástrico humano,

Pml

+ /+ e

Pml

– /- MEFs, e PML knockdown em ambas as células NIH3T3 e SNU-638. Dados obtidos a partir de ambos os testes de tecidos humanos e os ensaios de migração transpo� mostrou que a perda de PML promove o tráfico de linfócitos; Assim, buscamos mecanismos que possam eventualmente explicar estas observações. Mostra-se que um aumento em níveis de IP-10 em células de cancro que expressam níveis baixos de LMP contribui para o recrutamento de linfócitos.