Abstract
O câncer colorretal (CRC) é um dos principais cancros malignos com um rápido aumento na incidência e mortalidade. As recorrências de CRC após a ressecção curativa são inevitáveis e muitas vezes ocorrem dentro do primeiro ano após a cirurgia. MicroRNAs podem servir como biomarcadores para prever recorrência precoce da CRC, mas identificando-os a partir de mais de 1.400 microRNAs humanos conhecidos é desafiador e caro. Uma abordagem alternativa é analisar dados de expressão existentes de RNA mensageiro (mRNA), porque de um modo geral os níveis de microRNAs e seus mRNAs alvo de expressão são inversamente correlacionados. Neste estudo, foram extraídas seis dados de CRC de expressão de mRNA em quatro estudos (GSE12032, GSE17538, GSE4526 e GSE17181) a partir da expressão do gene omnibus (GEO). Nós inferir perfis de expressão microRNA e realizada análise computacional para identificar microRNAs associados com CRC recorrência usando o método IMRE com base no banco de dados do microcosmo que inclui 568,071 conexões microRNA-alvo entre 711 microRNAs e 20.884 genes alvos. Dois microARNs, miR-29a e miR-29C, foram divulgadas e ainda mais meta-análise dos conjuntos de dados de expressão de seis ARNm mostra que estes dois microARNs foram altamente significativas com base na combinação de p-valor de Fisher (p = 9,14 x 10
– 9 para miR-29a e p = 1,14 × 10
-6 para miR-29c). Além disso, estes dois microRNAs foram testadas experimentalmente em 78 amostras de CRC humanos para validar o seu efeito sobre recidiva precoce. Os resultados empíricos mostram que os dois microARNs foram significativamente regulada para baixo (p = 0,007 para o miR-29a e p = 0,007 para o miR-29c) nos pacientes no início de recidiva. Este estudo mostra a viabilidade da utilização de perfis de mRNA para indicar microRNAs. Nós também mostra miR-29a /c poderia ser potenciais biomarcadores para CRC início recorrência
Citation:. Kuo TY, Hsi E, IP Yang, Tsai PC, Wang JY, Juo S-HH (2012) Análise computacional de Perfis de mRNA expressão Identifica MicroRNA-29a /c como preditor de câncer colorretal precoce de recorrência. PLoS ONE 7 (2): e31587. doi: 10.1371 /journal.pone.0031587
editor: Steve Horvath, da Universidade da Califórnia, em Los Angeles, Estados Unidos da América
Recebido: 16 de julho de 2011; Aceito: 09 de janeiro de 2012; Publicação: 13 de fevereiro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Kuo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Hospital Kaohsiung Medical University (KMUH98-8I04) (https://www.kmuh.org.tw/), Excelência para Cancer Research Center Grant através de financiamento pelo Departamento de Saúde, Yuan Executivo, Taiwan, República da China (DOH100-TD-C-111-002), o Conselho Nacional de Ciência da República da China (NSC (https://science.doh.gov.tw/) e 99-2320-B-037-014- MY3 e NSC 94-2314B037-104) (https://www.nsc.gov.tw/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CRC) é um dos principais cancros malignos com mais de 500.000 mortes no mundo a cada ano [1], [2]. A incidência e mortalidade da CRC em chinês têm vindo a aumentar rapidamente nas últimas décadas [3]. Actualmente, o tratamento eficaz para CRC é curativa ressecção do tumor com a quimioterapia, mas as recidivas são inevitáveis [4]. Entre os pacientes com recidiva, 40% -50% deles ocorrem no primeiro ano após a ressecção cirúrgica inicial, e mais de 90% acontecem dentro de quatro anos [5]. O estágio do tumor e características patológicas são comumente utilizados para prever o prognóstico e facilitar o tratamento de pacientes de CRC na prática. Até o momento, não há biomarcadores disponíveis para prever a recorrência de CRC.
Recentemente, microRNAs foram mostrados para ser fatores importantes para regular várias funções genéticas em cancros humanos [6], e microRNAs têm sido propostos como romance biomarcadores para os cânceres [7]. Estudos anteriores mostraram que a expressão microARN é alterado em vários tipos de cancros, incluindo CRC [8], [9]. MicroRNAs são endógenos RNAs não-codificantes curtos que se podem ligar a regiões não traduzidas a 3 ‘(UTRs) dos seus ARNs alvo mensageiro (ARNm). Eles actuam como reguladores de pós-transcricional da expressão de genes [10] através da repressão de translação e /ou degradação do mRNA em muitos processos biológicos, incluindo o desenvolvimento, diferenciação celular, proliferação celular, apoptose e metabolismo [11], [12]. Estes processos estão geralmente envolvidos na tumorigénese [13]. Embora vários estudos têm relatado uma associação entre microRNAs e desenvolvimento CRC [14], [15], [16], [17], o papel dos microRNAs na previsão CRC recorrência mal foi investigado.
Até outubro 2011, mais de 1.400 microARNs humanos foram relatados [18], [19]. É um desafio, demorado e dispendioso para avaliar a consequência funcional de cada microARN em relação ao CRC recorrência. abordagens computacionais foram desenvolvidos para a obtenção de mais informações a partir dos dados de expressão de ARNm [20], [21], [22], [23]. Acredita-se geralmente que os níveis da maioria dos microARNs e os seus alvos de ARNm de dirigir a expressão estão inversamente correlacionados porque microARNs exercer repressão translacional ou mecanismo de degradação de [21], [24]. Consequentemente perfis de expressão de microRNA pode ser inferida a partir de dados de expressão de mRNA por abordagens de bioinformática. Recentemente, o método IMRE foi proposto [22] para prever microARN expressão através da utilização de conjuntos de dados e bases de dados de mRNA-alvo microRNA. Neste estudo, foram obtidas seis conjuntos de dados de pacientes de CRC de expressão de ARNm a partir da expressão do gene omnibus (GEO). Utilizou-se análise computacional e meta-análise para prever microRNAs relacionados a CRC recorrência, especialmente recidiva precoce. Além disso usamos nossas amostras CRC humanos para validar esses microRNAs candidatos.
Materiais e Métodos
Estratégia de busca para conjuntos de dados de mRNA de GEO
Em Outubro de 2010, que procurou o GEO ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) para estudos que forneceram dados de expressão de mRNA de pacientes com CCR. Os termos de pesquisa foram “cancro colo-rectal” ou “CRC” em combinação com “humana [organismo]”. No total, foram inicialmente identificados 110 estudos. Em seguida, limitou o número de estudos por parte das palavras-chave de “recorrência” e “recaída” em seus resumos, entre os quais foram extraídos quatro estudos (GSE12032, GSE17538, GSE4526 e GSE17181). Usamos a recorrência definido originalmente nesses quatro estudos. A recorrência foi comumente definida como uma recorrência local ou metástases à distância de CRC durante o período de seguimento, e os comprimentos de acompanhamento desses estudos variou entre 45,9 e 68,6 meses. Os dados GSE17181 e GSE4526 relataram apenas metástases à distância, mas os outros dois conjuntos de dados não especificou qual o tipo de recorrência em seus dados. Nós baixado os seus dados expressão de mRNA normalizado e informações de amostra do GEO. Os estudos GSE17538 e GSE4526 usou a mesma plataforma de expressão gênica (HG-U133Plus 2.0), enquanto que os outros dois estudos usaram dois mais distintas (AceGene Oligo Humano Chip 30 K e Agilent-014950 CGH Microarray). Informação detalhada destes conjuntos de dados transferidos é resumida na Tabela 1.
A filtragem de sujeitos do estudo e sondas em conjuntos de dados
Os conjuntos de dados baixados incluídos pacientes com CCR com vários estágios tumorais: estágio II em GSE17181 , fase III em GSE4526 e fases I-IV em GSE12032 e GSE17538. Nós só selecionados os pacientes com tumor estádio II e fase III, porque eles juntos representaram a maioria dos pacientes de CRC (~ 70%) [25], e aqueles com a fase I e IV forneceram poucas informações. Portanto, um total de seis conjuntos de dados específicos do estádio (três fase II e fase III de três conjuntos de dados) foram criados para posterior análise. Uma vez que estes conjuntos de dados plataformas usados com diferentes sondas para detectar a expressão de mRNA, foi realizado o controle de qualidade para esses conjuntos de dados usando os seguintes dois critérios. Em primeiro lugar, as sondas descartado com o intervalo entre quartil (IQR) menor do que a mediana de IQR da sonda-conjunto total, a fim de remover as sondas menos expressos diferencialmente. Em segundo lugar, se um gene foi interrogado por sondas múltiplas, uma com o valor mais alto IQR foi retido e o restante foi removido. Após o procedimento de filtragem, mais de metade dos genes foram filtrados em cada um desses conjuntos de dados (Tabela 1)
Análise computacional de Imre inferir microRNAs putativos
O método IMRE (http:. //www.lussierlab.org/IMRE) foi desenvolvido para imputar níveis de expressão microARN de dados de expressão de ARNm com base nos níveis de expressão ponderados e classificados e alvos putativos microRNA [22]. Este método assume uma correlação inversa entre a expressão de microRNAs e seus alvos de mRNA directos [26], [27]. Embora a aplicação de método IMRE para cada dados, identificamos um conjunto de microRNAs, quer para cima regulamentados ou para baixo-regulados. Usando este método, uma pontuação que representa nível de expressão de microRNA foi calculado com base em seis conjuntos de dados de expressão de mRNA baixado e Metas microcosmo que é um banco de dados alvo microRNA (consulte a seção abaixo de “banco de dados de previsão Target” para mais detalhes). Os procedimentos detalhados foram como se segue: (1) ARNm em cada objecto de estudo foi classificada pelo seu nível de expressão, e em seguida, classificados de acordo com a sua classificação usando o método orderedlist [28] de Bioconductor [29], e (2) a pontuação expressão de cada microRNA em cada sujeito foi imputado pelo cálculo da diferença entre a média das pontuações de classificação ponderada de seus genes-alvo e genes não-alvo.
alvo de banco de dados de previsão
para prever genes alvos para um determinado microRNA, baixamos o último banco de dados de previsão de destino a partir metas microcosmo, anteriormente chamados alvos miRBase [30], [31] (microcosmo alvos versão 5; https://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/) e recuperados 568.071 previu conexões microRNA-alvo entre 711 microRNAs humanos e 20.884 genes alvos. Alvos microcosmos utiliza o algoritmo miRanda que é uma das primeiras miARN alvo e algoritmos de previsão de um dos algoritmos mais amplamente utilizados. O algoritmo foi baseado num programa dinâmico para pesquisar alinhamentos de complementaridade máximas locais. Para validar o banco de dados microcosmo, foram comparados os resultados entre alvos microcosmo e miRNome que foi usado no estudo GSE6631 [22]. Além disso, também usamos miRanda [32] e TargetScan [33] para validar os microRNAs candidatos sugeridos pelo banco de dados do microcosmo. O banco de dados microcosmo produziu a maioria dos microRNAs (incluindo o causal) que foram encontrados pelo estudo original [22] (Tabela S1). Outra vantagem de usar Metas microcosmo foi que a versão mais recente (alvos lançamento da versão v5) contém mais microRNAs que o miRNome (gerado em 2007). Por conseguinte, foi utilizado o banco de dados do microcosmo para os estudos posteriores.
Estatística análise
Depois de calcular a pontuação que representa os níveis de cada microRNA expressão para cada objeto de estudo, listamos potenciais microRNAs que poderiam distinta a recorrência de não-retorno dos pacientes com CCR. Para cada microRNA, um valor de p empírica foi obtida utilizando 1000 permutações. O valor de p de corte para seleccionar potenciais microARNs foi definida para ser igual ou inferior a 0,1. Utilizou-se este valor liberal, a fim de reduzir um erro de tipo II na análise inicial. A análise foi realizada utilizando o pacote estatístico R com o pacote Bioconductor crepúsculo [34], [35].
Para reduzir um erro de tipo I, nós combinamos ainda mais os resultados dos seis conjuntos de dados usando meta-análise para o início microRNAs selecionados. Estatística de Q do Cochran foi usado para testar a heterogeneidade entre estes conjuntos de dados. A meta-análise foi realizada com base no tamanho do efeito (a diferença na pontuação previstos entre a recorrente e os pacientes de CRC não recorrentes) e erro padrão. Um tamanho de efeito global eo intervalo de confiança de 95% (95% IC) foram relatados. Para identificar o microRNA mais significativo com o menor valor global de P e para aumentar ainda mais o poder, foi realizada uma análise conjunta, combinando valores de p matérias baseado em combinação de Fisher de valores de p [36] com o valor p de corte de 5 × 10
-5 (~0.05 /711, 711 microRNAs).
experimentos de bancada para confirmar as descobertas
para verificar os microRNAs candidatos indicados pelo método computacional cima e meta-análise, ainda recolhidos 78 CRC tecidos tumorais no Hospital Médico Universitário Kaohsiung. As características clinicopatológicas destes 78 pacientes são mostradas na Tabela S2. Estas amostras foram obtidas a partir dos pacientes cirurgicamente CRC com UICC estágios I-III e congeladas rapidamente em azoto líquido a -80 ° C. Para evitar a influência potencial do tratamento neoadjuvante na expressão microRNA, todos os pacientes não foram submetidos a tratamento neoadjuvante, quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. Um consentimento informado foi obtido de cada paciente e do protocolo do estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Hospital Médico Universitário Kaohsiung. Estes 78 pacientes foram agrupados em recidiva precoce (43 casos) e os grupos de recorrência não-iniciais (35 controles). Não há nenhuma diferença significativa na idade e sexo entre os dois grupos. A recidiva precoce foi definida como recidiva (crescimento do tumor restrito à anastomose ou a região da operação primária) local ou metástases distantes (metástases distantes ou difusa semeadura peritoneal) dentro de 1 ano após a ressecção radical [5], [24], [37] . recorrência não-início foi definida como nenhuma recidiva dentro de 1 ano. Notavelmente, alguns dos pacientes recorrentes não precoces podem ter recorrência como o follow-up continua.
Aproximadamente 100 mg de tecido foi homogeneizado usando um homogeneizador de bancada (Polytron PT1600E, Kinematica AG, Lucerna, Suíça) em 1 ml de reagente TRIzol (Invitrogen) e purificados com colunas Qiagen RNAeasy (Qiagen). Foram extraídos e purificados RNAs totais a partir de cada tecido do tumor, e os ensaios de TaqMan microARN RT-qPCR (Applied Biosystems) foram usadas para quantificar o nível de expressão microARN. PCR em tempo real foi realizado utilizando o 7500 Sequence Detector Sistema de Applied Biosystems. Todas as reacções de PCR em tempo real foram efectuadas em triplicado. U6b foi usado como controlo interno, dado que é um controlo interno para normalização utilizada expressão microARN e também porque U6b foi mostrado relativamente estáveis com base nos nossos dados in-house. O nível de expressão relativa de um microRNA foi calculada usando a equação, faça o login
10 (2
-ΔCt), onde ΔCt = (CT
miR-CT
U6b). A média de log
10 (2
-ΔCt) e seu desvio padrão (SD) também foram calculados. Nós comparamos a diferença nos níveis de expressão de microRNA entre os grupos recorrentes precoces e não precoces por t-teste independente e análise ANCOVA múltipla com ajuste para idade, sexo e estágio do tumor. Nossos dados experimentais foram divididos em dois grupos de acordo com a mediana de cada miR-29a e os dados de miR-29c. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para detectar a relação entre o tempo de recidiva após a cirurgia e miARNs dicotomizados expressão. O nível de significância foi fixado em 0,05. As análises estatísticas foram realizadas utilizando SAS9.1.
Resultados
Identificação de miR-29a e miR-29c como microRNAs candidatos à CRC recorrência
Ao aplicar o método IMRE para os seis conjuntos de dados independentes de microarranjos de mRNA CRC, foram identificados quatro microRNAs (miR-29a, miR-29C, miR-100 e miR-627) na fase de conjuntos de dados II e três microRNAs (miR-29a, miR-29C e miR-363) na fase III conjuntos de dados com um valor de p ≦ 0,1 (Tabela 2). Entre eles, o miR-29a e miR-29c foram indicados tanto em estágio II e III conjuntos de dados. A Figura 1 mostra que o miR-29a teve uma pontuação mais elevada nos pacientes recorrentes (indicado como: 1) do que os pacientes não-recorrentes (indicados como 0), em todos os seis conjuntos de dados. Porque a pontuação foi calculada a partir de um conjunto de valores de expressão de miR-29a genes-alvo “, uma pontuação mais elevada significa que esses genes alvo foram up-regulamentada do grupo recorrência. Em outras palavras, a correlação inversa entre um microRNA e do seu gene alvo indicado que o miR-29a foi regulada para baixo no grupo de recorrência e, assim, podem desempenhar um papel como supressor de tumores de CDC. O padrão similar foi também observado para miR-29C (dados não mostrados). Neste estudo, não identificamos qualquer microRNA-regulada alcançar o nosso ponto de corte definido (P ≦ 0,1) entre os pacientes recorrentes e não-recorrentes em todos os seis conjuntos de dados.
O eixo y é uma pontuação que representa a níveis de miR-29a e o eixo x de expressão são os grupos com e sem recorrência da CRC. O grupo “1” refere-se ao grupo de recorrência e “0” refere-se ao grupo de não-retorno. A pontuação foi calculada a partir de um conjunto de valores de expressão “genes miR-29a-alvo, uma pontuação mais elevada significa que estes genes-alvo eram up-regulamentada do grupo recorrência” 1 “.O padrão similar foi encontrado para miR-29c.
meta-análise de miR-29a e miR-29c
Foram realizadas meta-análise para avaliar a intensidade das associações entre os dois microRNAs e recorrência de CRC (Figura 2) . Utilizar meta-análise, esperávamos obter resultados globais e mais confiáveis. O modelo de efeito aleatório mostrou um tamanho de efeito de 213,36 (95% CI: 147,38-279,34) para miR-29a e um tamanho de efeito de 176,91 (95% CI: 111,63-242,18) para miR-29c. Na verdade, o modelo de efeito fixo também produziu resultados idênticos. combinação de valores de p de Fisher mostrou p = 9,14 × 10
-9 para miR-29a e p = 1,14 × 10
-6 para miR-29c. Não houve significativa heterogeneidade entre-conjunto de dados para os dois microRNAs (p = 0,59 para miR-29a e p = 0,69 para miR-29c).
Na meta-análise, o tamanho do efeito (a diferença na pontuação previstos entre o recorrente e pacientes de CRC não recorrentes) e erro padrão foram calculados para cada estudo. Um tamanho total efeito e intervalos de confiança de 95% (95% IC) foram relatados com valores de p estimado com base na combinação de Fisher de valores de p [36].
Em seguida, analisamos ainda mais os mRNAs e sua caminhos em relação ao CRC recorrência para ter mais conhecimento para a patogênese da doença. Primeiro, listamos 10 melhores caminhos enriquecidos com genes alvo miR-29a /29c (Tabela S3). Em seguida, listamos os genes-alvo superiores que são mais significativamente associados com CRC recorrência no conjunto de dados GEO (Tabelas S4). CDC42, que está envolvida em 3 vias principais (ver Tabela S3), foi significativamente diferente entre os pacientes recorrentes e não-recorrentes (combinado p = 0,00053).
miR-29a e miR-29c nível de expressão em amostras de CRC
Nós ainda recolhidos 43 pacientes CRC de recidiva precoce e 35 pacientes de recorrência não cedo para validar miR-29a e miR-29c em conta a previsão da CRC início de recorrência. Descobrimos que tanto miR-29a e miR-29c tinha níveis de expressão significativamente mais baixos no grupo de recidiva precoce do que o grupo de recorrência não-precoce (ambos os valores p foram 0,007, após ajuste para sexo, idade e estágio do câncer). Ambos os microRNAs permaneceu significativa mesmo após a exclusão dos 10 indivíduos (8 non-primeiros assuntos e 2 primeiros assuntos) de cancro fase I (Tabela 3). Os resultados empíricos concordaram com as conclusões da análise computacional baseado em conjuntos de dados de microarranjos mRNA, indicando que os dois microRNAs desempenhar um papel importante na recidiva precoce da CRC. Na análise de Kaplan-Meier, mostramos que quer um alto nível de miR-29a ou miR-29c tiveram uma melhor sobrevida em 12
th mês, mas apenas miR-29a poderia prever significativamente a recorrência precoce (Figura S1). O fracasso da previsão de miR-29c na análise de Kaplan-Meier pode ser devido a um curto follow-up ou um corte inadequado devido a um pequeno tamanho da amostra.
Discussão
o estudo dos microRNAs começou uma nova era para a melhor compreensão dos mecanismos da doença. No entanto, o papel de microRNAs na recorrência de CRC ainda não é clara. Neste estudo, identificamos miR-29a e miR-29C candidatos como importantes, empregando um método engenhoso que priorizava microRNAs candidatos a partir de conjuntos de dados de expressão de genes do genoma publicamente disponíveis. Utilizar meta-análise de conjuntos de dados publicamente disponíveis e confirmação experimental, medido diretamente e validado miR-29a e miR29c como preditores para CRC início de recorrência. Para o nosso conhecimento, estes dois microRNAs não foram relatados para ser relacionado à recidiva precoce do CRC.
Para inferir expressão microRNA, foi aplicado o método IMRE pela combinação de previsão alvo microRNA e dados de expressão de mRNA. A principal vantagem deste método é o acesso bases de dados públicas de expressão de mRNA para a identificação de putativos microARNs relacionados com as doenças de interesse. No entanto, uma estimação robusta para a expressão microARN também depende de uma base de dados de previsão fiável alvo. Aqui usamos Metas microcosmo para a predição de genes alvo de microRNA. Nós não utilizar a união de combinação de diferentes algoritmos de previsão, tais como miRNome, porque é susceptível de reduzir o poder devido a muitos alvos falsamente previstos. Além de Metas microcosmo, também usamos outros dois bancos de dados de previsão, Miranda [32] (agosto de 2010 lançamento com boa pontuação mirSVR, conservada microRNA) e TargetScan [33]. miR-29a e miR-29c também foram indicados por estas duas microARN software preditivo para ser envolvidos na recorrência de CRC, os quais indicaram a robustez do método IMRE. No entanto, o nível de significância foi menor usando Miranda (p = 0,0173 para o miR-29a e p = 0,00197 para miR-29c em combinação valor p) do que Targets microcosmo (p = 9,14 × 10
-9 para miR-29a e p = 1,14 × 10
-6 para miR-29c). A razão pode ser devido a metas mais preditos por Miranda que Targets microcosmo.
Um grande progresso foi feito para identificar as associações entre microRNAs e várias doenças comuns, mas ainda é caro para conduzir a expressão do genoma matriz de divulgar microARNs doenças relacionadas. Embora o uso de ferramentas de bioinformática, tais como o método IMRE pode reduzir o número de candidatos e priorizar esses candidatos, um grande número de falsos positivos são inevitáveis. No presente estudo, verificou-se que alguns microRNAs altamente significativas previu através desta análise computacional em um conjunto de dados não poderia ser replicado em outros conjuntos de dados. Em vez de usar a correcção de Bonferroni conservadora, analisou-se vários conjuntos de dados para identificar as microARNs consistentes para reduzir o erro de tipo I. O experimento de amostras humanas confirmou ainda mais a conclusão de silício.
Os nossos resultados indicam que a sub-regulação de miR-29a e miR-29c está associada com o início de recidiva da CRC. A sub-regulação da família miR-29 foi avaliado em vários cancros humanos, incluindo cancro do pulmão [38], o cancro da próstata [39] e do cancro da mama invasivo [40]. Um estudo recente mostrou que o miR-29 está envolvida na via de p53, um supressor de tumor importante regulador [41]. MiR-29 p53 activa e induz a apoptose através da supressão de CDC42 e p85α [41]. A nossa análise para miR-29 alvos sugeriu que CDC42 (valor p = 0,00053 combinada na Tabela S4) e outros mRNAs são susceptíveis de ser envolvido na via potencial de desenvolvimento de CRC. Além disso, observou-se a forma mutante de p53 em 51-74% de todos CRC e outros tumores humanos [42]. Os estudos acima oferecem uma plausibilidade biológica para apoiar o papel da família miR-29 em suprimir CRC recorrência.
Além de microRNAs, a recorrência de CRC pode ser também influenciada pelos estágios tumorais e o período de acompanhamento acima. Na análise computacional, temos apenas focada nos pacientes com CCR com tumor estádio II e fase III porque representavam a maioria dos pacientes com CCR. Apenas alguns pacientes em estágio I desenvolveu recorrência ea maioria dos pacientes no estágio IV desenvolveu recorrência após a cirurgia levando a informação menos útil para o nosso estudo. Embora nosso estudo empírico utilizado recidiva precoce (isto é, a recorrência ocorre dentro de 1 ano após a cirurgia) como o fenótipo de interesse, relatórios recentes indicam que 40-50% das recorrências tornam-se aparentes no primeiro ano após a ressecção inicial, e o tempo desde o inicial tratamento de recorrência está fortemente relacionada à sobrevivência [43] os resultados experimentais das amostras humanas de recidiva precoce concordou com a conclusão da análise computacional que foi baseado em pacientes para um follow-up de 3-6 anos, o que indica que a nossa experimental constatação é menos provável de ser influenciado pelo comprimento de acompanhamento.
Nós validado miR-29a e miR-29c como biomarcadores para CRC início de recorrência. Os outros três microRNAs (miR-100, miR-627 e miR-363) também foram identificados pela análise computacional, mas eles só foram significativas em pacientes de qualquer estágio II ou estágio III. Por isso, eles não foram ainda investigadas no presente estudo devido a uma prioridade menor do que miR-29. O nosso número limitado de amostras experimentais também não pode oferecer uma potência suficiente para analisar estes dois microRNAs que só são significativos em um estágio do câncer. Dado que o nosso principal objectivo deste estudo é mostrar a viabilidade desta abordagem computacional para identificar microRNAs úteis, sem analisar estes três microRNAs potenciais não reduziria significativamente a contribuição científica do nosso estudo.
Em conclusão, este estudo mostrou uma estratégia eficiente, combinando a análise in silico e a experiência empírica para sugerir microRNA-29a e microRNA-29c como potenciais biomarcadores para prever recorrência precoce da CRC. Usando estes biomarcadores podem permitir que os profissionais de saúde e pacientes a tomar uma forma mais eficiente para evitar CRC recorrência. Além disso, nosso estudo também fornece uma direção para uma investigação mais aprofundada com o mecanismo da CRC recorrente.
Informações de Apoio
Figura S1.
indivíduos foram dicotomizados a ter níveis elevados ou baixos de microRNA acordo com a mediana de 1,39 para miR-29a e 0,58 para miR-29c. A linha sólida indica que o grupo de alto nível e linha do traço significa grupo de nível baixo
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031587.s001
(DOC)
Tabela S1.
microRNAs significativas com p-valores e taxa de descoberta de falsas (FDR) [1], [2] por miRNome e metas microcosmo em GSE6631. A maioria dos microRNAs significativas (incluindo a causal, miR-204, indicado pela linha sublinhado) foram mostrados por ambos da base de dados de previsão de dois alvo, miRNome eo microcosmo metas, nos GSE6631
doi:. 10.1371 /journal.pone. 0031587.s002
(DOC)
Tabela S2.
características clínico-patológicas de 78 pacientes com câncer colorretal.
doi: 10.1371 /journal.pone.0031587.s003
(DOC)
Tabela S3.
Top 10 vias com miR29a ou genes alvo miR29c analisados por MetaCore sistema de análise de caminho enriquecido.
doi: 10.1371 /journal.pone.0031587.s004
(DOC)
Tabela S4.
Associação significativa de genes alvo /29c mir-29a com recorrência de CRC nos conjuntos de dados.
doi: 10.1371 /journal.pone.0031587.s005
(DOC)