Abstract

Um estudo de associação do genoma recente de câncer de pulmão entre as mulheres não-fumadores na Ásia demonstrou que o polimorfismo rs2736100 no

TERT-CLPTM1L

lócus no cromossomo 5p15.33 foi fortemente e significativamente associados com o risco de adenocarcinoma do pulmão. O gene telomerase

TERT

é uma transcriptase reversa que é essencial para a replicação dos telômeros e estabilização, controlando o comprimento dos telômeros. Nós já descobriram que mais o comprimento do telômero medido em DNA de células brancas do sangue periférico foi associado com um risco aumentado de câncer de pulmão em um estudo de coorte prospectivo de fumar homens na Finlândia. Para acompanhar esse achado, foi realizado um estudo de caso-controle de 215 casos de câncer de pulmão do sexo feminino e 215 controles do sexo feminino, 94% dos quais eram nunca fumaram, na prospectivo de coorte Estudo de Saúde das Mulheres de Xangai. Houve uma relação dose-resposta entre tercis de comprimento dos telômeros e risco de câncer de pulmão (odds ratio (OR), 95% intervalo de confiança [CI]: 1.0, 1.4 [0,8-2,5], e 2,2 [1,2-4,0], respectivamente ; P tendência = 0,003). Além disso, a associação estava inalterada por o período de tempo de colheita de sangue para diagnóstico caso. Além disso, o alelo rs2736100 G, que previamente tenham demonstrado estar associado com o risco de câncer de pulmão nesta coorte, foi significativamente associada com maior comprimento dos telômeros nestes mesmos indivíduos do estudo (P tendência = 0,030). Nossos resultados sugerem que os indivíduos com maior comprimento dos telômeros em células brancas do sangue periférico podem ter um risco aumentado de câncer de pulmão, mas requerem a replicação em coortes prospectivos adicionais e populações

Citation:. Lan Q, Cawthon R, Gao Y, Hu W, Hosgood HD III, Barone-Adesi F, et al. (2013) Longer comprimento dos telômeros nas células periféricas brancas do sangue está associada a risco de cancro do pulmão e do rs2736100 (

CLPTM1L-TERT

) Polimorfismo em um estudo prospectivo de coorte entre as mulheres na China. PLoS ONE 8 (3): e59230. doi: 10.1371 /journal.pone.0059230

editor: Olga Y. Gorlova, da Universidade do Texas M. D. Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de setembro de 2012; Aceito: 12 de fevereiro de 2013; Publicação: 26 de março de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos intramural do National Cancer Institute (Bethesda, MD). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

gene telomerase

TERT

é uma transcriptase reversa que é essencial para a replicação dos telômeros e estabilização, controlando o comprimento dos telômeros. Os telômeros são complexos DNA-proteína que a CAP as extremidades dos cromossomos e promover a estabilidade cromossômica. Até à data, as associações entre o comprimento dos telômeros eo risco de câncer são inconclusivos. A maioria dos estudos iniciais usou um desenho de caso-controle e relatou que o comprimento dos telômeros mais curtos medida em células brancas do sangue periférico foi associado com aumento do risco de câncer [1]. Em contraste, algumas publicações recentes utilizando um desenho prospectivo coorte sugeriram que mais do comprimento de telómeros podem estar associadas com o aumento do risco de determinados tumores, incluindo o pulmão, linfoma, carcinoma hepatocelular, melanoma e [2] – [5]. Recentemente, dois estudos caso-controle relataram que mais o comprimento dos telômeros foi associada com colorretal, câncer de mama e cancro da mama sobrevivência [6] – [9]. Menor comprimento dos telómeros está associado com o envelhecimento e tanto do comprimento de telómeros mais curtos e mais têm sido associados com o risco de um número de doenças crónicas [10], [11], embora essa heterogeneidade pode ser explicado em parte pelo caso-controlo vs prospectivo desenhos de estudo. Além disso, o comprimento dos telómeros está fortemente mediada por factores genéticos com uma hereditariedade estimada variando de 44% a 80% [12], [13]. Vários estudos identificaram um número de polimorfismos que foram associados com o comprimento dos telômeros [8], [14] – [17]., Mas uma compreensão abrangente da contribuição genética para o comprimento dos telômeros ainda não emergiu

Nós recentemente realizaram um estudo de associação do genoma (GWAS) de câncer de pulmão entre as mulheres não-fumadores na Ásia e demonstrou que o polimorfismo rs2736100 no

TERT-CLPTM1L

lócus no cromossomo 5p15.33 foi fortemente e significativamente associada com o risco de adenocarcinoma do pulmão (tendência P = 10

-20) e é replicado por outros estudos GWAS [18] – [20]. Além disso, há uma evidência adicional sugerindo que este local está associada a outros cancros, incluindo o cancro da bexiga, da próstata, colo do útero, pâncreas, mama, ovário, testículos, cérebro, e pele [21] – [26]. Estes achados sugerem que o

TERT-CLPTM1L região dos 5p15.33 poderia desempenhar um papel no desenvolvimento de um amplo espectro de cancros com diferentes etiologias.

Nós relatado anteriormente que mais o comprimento dos telômeros foi associada com o risco de câncer de pulmão no grupo alfa-tocoferol, Beta-caroteno cancer Prevention (ATBC) prospectivo [4], que é composta de fumar homens na Finlândia. Para dar seguimento a este relatório em uma população distintamente diferente e explorar ainda mais as nossas descobertas genéticas, foi realizado um estudo de caso-controle dos casos de câncer de pulmão e controles no potencial Shanghai Mulher coorte Estudo de Saúde (SWHS).

Materiais e métodos

os sujeitos do estudo

os métodos detalhados para a SWHS foram descritos anteriormente [27]. Resumidamente, 74,942 mulheres chinesas com idades entre 40 e 70 anos e residentes em sete comunidades urbanas de Shanghai foram recrutados para o estudo de coorte de 1997 a 2000 com uma taxa de participação de 92,7%. Dos participantes do estudo, 56.831 (75,8%) forneceram uma amostra de sangue, que foi recolhida durante a inscrição para a coorte. O estudo foi aprovado pelos conselhos de revisão institucionais de todas as instituições colaboradoras. Cada objeto de estudo fornecido um formulário de consentimento no momento da inscrição e preencheram um questionário padronizado incluindo informações sobre as características demográficas, história médica, história familiar de câncer, tabagismo, história residencial incluindo o uso de óleo de cozinha e combustível, ea exposição à fumaça ambiental do tabaco de seu marido ou de colegas no local de trabalho. Follow-up de incidência e mortalidade por câncer foi realizado através de visitas domiciliares, bem como ligação ao Registro de Câncer de Xangai de base populacional. Para as mulheres que foram diagnosticadas com câncer, prontuários médicos foram revisados ​​e características do tumor foram registrados. Para os inquéritos de acompanhamento, as taxas de acompanhamento para três entrevistas diferentes eram 99,8% (2000-2002), 98,7% (2002-2004), e 96,7% (2004-2007) de membros da coorte ou de seus familiares.

Foi utilizado o delineamento caso-controle para este projeto. Os casos consistem em casos de câncer de pulmão incidente. Controles foram selecionados entre os participantes do estudo SWHS que estavam vivos e livres de câncer no momento do diagnóstico caso, e foram pareados individualmente para casos na data de nascimento (± 2 anos) e data de coleta da amostra de sangue (± 3 meses). No total, 215 casos de câncer de pulmão e 215 controles pareados foram incluídos no estudo atual.

Telomere Ensaio

O DNA foi extraído a partir de crostas inflamatórias usando o método de fenol-clorofórmio. Um ensaio de PCR quantitativo monocromático multiplex foi utilizado para determinar as medições do telomere [28]. Todos os ensaios foram realizados no laboratório do Dr. Richard Cawthon utilizando o Sistema de Detecção de PCR Bio-Rad CFX384 em tempo real. amostras idênticas mascarados foram intercaladas dentro e através de lotes de ensaio para avaliar ensaio de reprodutibilidade. Casos e seus controles foram testadas consecutivamente dentro de lotes. O coeficiente global de variação (CV) das amostras replicadas foi de 11% eo coeficiente de correlação intraclasse (ICC) foi de 87%. Em resumo, os reagentes no 10 pL de PCR foram de 10 mmol /L de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mmol /L de KCl, 3 mmol /L de MgCl2, 0,2 mmol /L de cada dNTP, 1 mmol /l de DTT, 1 mol /L betaína, 0,75 × SYBR Green I, e polimerase de ADN AmpliTaq ouro, 0,625 U. Os quatro iniciadores foram (5 ‘para 3’): telg (a 100 nmol /L), ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT; Telc (a 900 nmol /L), TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA; albugcr2 (a 700 nmol /L), CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGCCATGCTTTTCAGCTCTGCAAGTC; e albdgcr2 (a 500 nmol /L), GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGAGCATTAAGCTCTTTGGCAACGTAGGTTTC.

de 5 a 10 ng de DNA genómico humano foram adicionados por cavidade de reacção. Três diluições seriadas de uma amostra de ADN genómico de referência foram utilizados para gerar duas curvas padrão para cada placa de PCR (cinco concentrações com um máximo de 40 ng /reacção e uma baixa de 0,49 ng /reacção). ciclos térmicos consistiu de um ciclo de 15 min a 95 ° C; 2 ciclos de 2 s a 98 ° C, 30 s a 49 ° C; 36 ciclos de 2 s a 98 ° C, 30 s a 59 ° C, 15 s a 74 ° C, com a aquisição de sinal, 30 s a 84 ° C, e 15 s a 85 ° C, com a aquisição de sinal. A 74 ° C lê desde que os limiares de ciclo (CTS) para telômeros; a 85 ° C leituras desde o CTS para o gene de cópia única (albumina). Após a corrida estava completa, o Gestor de CFX Software Bio-Rad foi usado para determinar a T (telomere) e os valores para cada amostra experimental pelo método curva padrão S (gene de cópia única).

Todas as amostras foram ensaiadas em triplicado. A razão entre os sinais dos telómeros de PCR para o gene de cópia única (no nosso caso, β-globina) sinal de PCR (isto é, a razão T /S) é proporcional ao comprimento dos telómeros média de todas as células de uma amostra. valores T /S são comprimentos médios relativos a telómeros, expressa em relação ao valor /S T da amostra de DNA padrão de referência, o qual, por definição, é de 1,00. A amostra de ADN padrão utilizada para os nossos estudos tem um comprimento de telómeros médio efectivo de aproximadamente 3300 pares de bases [28]. Para uma dada amostra experimental, o valor T é o número de nanogramas do ADN de referência que corresponde à amostra experimental para número cópia do modelo do telómero, e o valor de S é o número de nanogramas do ADN de referência que corresponde à amostra experimental para número de cópia do modelo de gene de cópia única. T /S, por conseguinte, é um valor relativo e adimensional. As amostras com um T /C 1,0 têm um comprimento médio dos telómeros maior do que o ADN normal; amostras com um T /S 1,0 têm um comprimento médio dos telómeros mais curto do que a do ADN padrão. Multiplex PCR quantitativa elimina uma importante fonte de variação presente na PCR quantitativa monoplex. Na PCR quantitativa monoplex, a variação na quantidade de ADN pipetados para os T e S os poços de reacção resulta em variação de T /S, enquanto que na PCR quantitativa multiplex, tanto o t e S são medidos em cada cavidade de reacção, de modo que a variação de pipetagem entre poços não faz afetam T /S.

a genotipagem

a genotipagem foi realizada utilizando um ensaio TaqMan otimizado (ABI, Foster City, CA), no Instituto Nacional do Câncer Cancer Genomics Research (CGR), como descrito anteriormente [ ,,,0],19].

Análise estatística

Uma vez que os rácios de T /S derivadas dos dados de comprimento dos telômeros não foram distribuídos normalmente, os dados foram log transformados. O teste de sinais com posto de Wilcoxon foi utilizado para testar a diferença de comprimento dos telômeros entre os casos quando comparados aos controles. Os pontos de corte para os tercis de comprimento dos telómeros foram derivados a partir da distribuição nos controlos. odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (95% IC) foram estimados usando modelos de regressão logística condicional. o comprimento dos telômeros foi modelado tanto como uma variável contínua e categórica. Os testes de tendências foram calculados utilizando log transformado comprimento dos telômeros como uma variável contínua. A idade foi usado em todos os modelos condicionais e representam potencial de confusão residual, e tabagismo foi incluído em todos os modelos que incluíam sempre-fumantes. Variáveis ​​que resultaram em uma mudança de 10% ou mais na β-coeficiente da variável comprimento dos telômeros no modelo de base foram consideradas fatores de confusão e incluídas nos modelos finais, multivariados. Todos os valores P são 2 faces. Também realizamos uma análise secundária utilizando polinômios fracionários para investigar uma possível associação não-linear entre o comprimento dos telômeros eo risco de câncer de pulmão. O grau óptimo de alisamento foi escolhida utilizando um procedimento de selecção do modelo proposto por Royston e Sauerbrei [29]. Para determinar se a associação pode ser impulsionado em parte pelo comprimento dos telômeros elevada entre os casos com câncer de pulmão não diagnosticada no momento da coleta de sangue, e para determinar se a associação persistiu por mais de 5 anos, nós estratificada as análises pelo tempo de coleta de sangue para o diagnóstico de caso (0- = 2, 2-5, e 5 anos) ou data de referência que o controle foi selecionado. Analisou-se a influência do genótipo rs2736100 no comprimento dos telômeros log-transformada por meio de regressão linear, atribuindo o ordinal valores 1, 2 e 3 para o TT, GT, e os genótipos GG, respectivamente, e ajuste para a idade.

resultados de

as características basais dos sujeitos do estudo são apresentados na Tabela 1. A idade dos casos e controles foi comparável e 93% dos casos e 95% dos controles foram nunca fumaram. o comprimento dos telômeros foi inversamente correlacionada com a idade em ambos os casos (correlação de Spearman r = -0,39 P 0,0001) e os controles (correlação de Spearman r = -0,41 P 0,0001). Nenhuma correlação significativa foi encontrada entre o comprimento médio dos telômeros e parâmetros demográficos apresentados na Tabela 1. Além disso, a distribuição do comprimento dos telômeros foi estatisticamente significativamente maior entre os casos do que nos controles [p = 0,032].

A riscos de câncer de pulmão por tercis de comprimento dos telômeros são apresentados na Tabela 2. os indivíduos no meio e maiores tercis apresentaram maior risco do que aqueles no menor tercil (OR 1,4, IC 95% 0,8-2,5 para o tercil médio; 2.2, 1.2 -4.0 para o tercil mais alto, P tendência = 0,003, Tabela 2, ajustado para idade e nunca fumar). Ajuste adicional para o tabagismo passivo e história familiar de câncer de pulmão teve um impacto insignificante sobre os resultados (OR 1,4, IC 95% 0,8-2,4 e 2,2, 1,2-4,0 para o meio e maiores tercis, respectivamente, P tendência = 0,004). Remoção dos casos nunca fumantes e controles obtiveram resultados semelhantes (OR 1,7, IC 95% 0,9-2,9 para o tercil médio; 2,5, 1,3-4,7 para o tercil mais alto, P tendência = 0,003). Modelos, incluindo polinômios fracionários não condizia com os dados melhores do que o modelo linear simples (probabilidade teste da razão p = 0,44). Este último foi, assim, retidas no chão da parcimônia. As associações observadas foram semelhantes entre os diferentes tempos de seguimento (Tabela 2) (ou seja, o tempo a partir da data de phlebotomy a data do diagnóstico), e um teste de heterogeneidade de associações em todo estratos de tempo de seguimento não foi significativa (P = 0,15 ). No entanto, devido ao pequeno número de indivíduos em alguns estratos e as estimativas de risco imprecisos, replicação em estudos com tamanhos de amostras maiores são necessários para avaliar o potencial heterogeneidade. Além disso, não havia nenhuma evidência de que a associação entre o comprimento dos telômeros eo risco de câncer de pulmão variou por idade de doação de sangue (teste para heterogeneidade: P = 0,96).

Nós relatado anteriormente que rs2736100 no cromossoma 5p15.33 foi fortemente associado com o risco de adenocarcinoma do pulmão entre os que nunca fumaram nesta coorte. Por isso, estudaram a relação entre os dados genéticos e do comprimento de telómeros nesta população. O comprimento dos telómeros significa em associação com rs2736100 (

CLPTM1L-TERT) é mostrado na Tabela 3. O alelo rs2736100 G, que já foi previamente demonstrada estar associada com o risco de cancro do pulmão nesta coorte [19], foi significativamente associada com maior comprimento dos telômeros (tendência P = 0,03) (Tabela 3).

Discussão

neste estudo prospectivo de coorte de principalmente as mulheres nunca fumadores na China, descobrimos que mais o comprimento do telômero medida em células brancas do sangue periférico foi significativamente e positivamente associado com aumento do risco de cancro do pulmão e essa associação não foi alterada pela duração do tempo de coleta de sangue para diagnóstico caso. Além disso, o alelo rs2736100 G, que anteriormente demonstrado estar associado com risco de câncer de pulmão nesta coorte [19], também foi significativamente associada com maior comprimento dos telômeros.

A nossa constatação de que mais o comprimento do telômero está associado com o risco de câncer de pulmão é consistente com nosso relatório anterior na prospectivo de coorte ATBC Prevenção do Cancro [4] em fumantes do sexo masculino. Ambos os dois estudos são prospectivos por design e são os únicos estudos de coorte de comprimento dos telômeros e câncer de pulmão publicados até à data, para o melhor de nosso conhecimento. Por outro lado, alguns estudos de caso-controle relataram associações entre menor comprimento dos telômeros eo risco de câncer de pulmão [30] – [32], onde o comprimento dos telômeros foi medida em células brancas do sangue recolhidos no momento da ou após o diagnóstico de câncer. É interessante que um relatório da mesma coorte encontraram uma associação em forma de U entre o comprimento dos telômeros eo risco de câncer colorretal, sugerindo que a relação entre o comprimento dos telômeros medida em leucócitos do sangue periférico e risco de vários tipos de cancro podem apresentar diferentes tipos de dose relações de resposta.

a inconsistência entre os achados em estudos de caso-controle e coorte pode ser devido a uma série de razões. Em primeiro lugar, o comprimento dos telómeros nas células brancas do sangue periférico pode ser alterado pela presença de doenças malignas. Portanto, a associação observada entre o comprimento dos telômeros encurtados e doença em estudos caso-controle poderia ser um resultado de polarização reversa causalidade [16], [33]. Em segundo lugar, a quimioterapia ou radioterapia antes da coleta de sangue pode causar danos ao DNA e pode afetar o comprimento dos telômeros [34], [35]. Vários dos estudos de cancro de caso-controlo não transmita o estado do tratamento de casos. Pooley et ai. compararam resultados de comprimento dos telômeros a partir de amostras de ambos os estudos caso-controle retrospectivo e estudos prospectivos de coorte de pacientes da mama e cancro do cólon e descobriu que mais curto o comprimento dos telômeros foi associada com um risco aumentado nos estudos de caso-controle, mas não nos estudos prospectivos de coorte [16 ], [33]. Amostras de sangue de indivíduos em nosso estudo foram recolhidos entre um a 10 anos antes do diagnóstico, e os efeitos que relatam persistiu durante o maior período de follow-up (ou seja, mais de 5 a 10 anos). Em terceiro lugar, exactidão e precisão na medição do comprimento dos telômeros é fundamental para calcular o risco de câncer [36] e variação estes podem contribuir para resultados inconsistentes. Por exemplo, a placa ea localização de amostra em uma placa tiveram uma influência significativa nas medidas de comprimento dos telômeros, embora eles são altamente correlacionadas entre as placas dentro de um determinado indivíduo [36]. O método PCR quantitativa monocromático multiplex usado neste relatório, que foi desenvolvido pelo Dr. Richard Cawthon [28], fornece maior consistência em comparação com outros métodos [8]. Em nosso estudo, o laboratório do Dr. Cawthon conduziu as análises com um coeficiente de variação (CV) de 11%. Além disso, temos melhorado a precisão na medição do comprimento dos telômeros, colocando o DNA de casos e seus controles ao lado do outro em um determinado prato.

Em princípio, quer longas ou curtas telomeres pode aumentar os riscos de câncer, dependendo história da célula de mutações somáticas e microambiente da célula. Quando o ponto de controlo do ciclo celular, senescência celular e apoptose redes de genes estão intactos, os telómeros curtos nas células em divisão são esperados ser protectora contra o cancro, uma vez que mais de encurtamento dos telómeros causada por divisão celular breve provoca, quer a senescência celular ou a apoptose, impedindo a célula de desenvolver em uma célula cancerosa. Por outro lado, longas telômeros pode aumentar o risco de câncer, porque as rodadas adicionais de divisão celular oferecidas pelas longas telômeros fornecer a célula (e suas células-filhas) a oportunidade de acumular sucessos genéticas (mutações somáticas) que bloqueiam as vias à senescência e apoptose e promover tumorigênese. Alternativamente, entre células nas quais os caminhos para a senescência celular e apoptose já estão bloqueados, aqueles com telômeros mais curtos são propensos a fusões end-to-end cromossômicas e consequente instabilidade cromossômica, um contribuinte para a carcinogênese [37], [38]. Um estudo anterior sugeriu que o equilíbrio entre o alongamento por telomerase e encurtamento do telómero é importante para produzir um comprimento estabilizado “ideal” que é crítico para a proliferação celular, a senescência, e controle [39].

O achado de uma associação entre o

TERT

SNP rs2736100 e dos telômeros de comprimento é intrigante. Rafnar et ai. descobriu que dois SNPs sobre os alelos

gene TERT, rs401681C e rs2736098A, ambos foram significativamente associados com menor comprimento dos telômeros em mulheres nunca fumadores entre 85 e 95 anos de idade em caucasianos. No entanto, estas associações foram na direção oposta quando limitado a mulheres mais jovens não-fumadores, embora as associações não foram significativas [23]. Mirabello et ai. Não houve associação entre rs2736100 e comprimento dos telômeros em caucasianos [40]. Notamos que a associação rs2736100 e câncer de pulmão foi mais forte entre as mulheres nunca fumadores em asiáticos do que em caucasianos [19], [41]. Além disso, o risco também é maior se comparado a um GWAS de câncer de pulmão em japoneses e coreanos, que eram em sua maioria fumantes e masculino [42]. Como tal, é possível que a relação entre rs2736100 e da própria comprimento dos telômeros pode variar de acordo com a etnia, gênero e /ou comportamento de fumar. Curiosamente, em uma análise preliminar, que foi limitado pelo pequeno número, encontramos alguma evidência de que o efeito de maior comprimento dos telômeros e maior risco de câncer de pulmão foi limitado àqueles indivíduos portadores do genótipo em risco (GT /GG) de rs2736100 (dados não mostrando). Ao mesmo tempo, o nosso estudo é relativamente pequena e os resultados têm de ser avaliadas em populações adicionais, usando o comprimento dos telómeros medido pelo mesmo método usado aqui. Além disso, o trabalho funcional é necessária para identificar a variante que responde diretamente para a associação subjacente, bem como para estudar o mecanismo pelo qual esta variante genética medeia o comprimento dos telômeros.

Em resumo, nosso estudo prospectivo de coorte descobriu que mais telômero comprimento medido em DNA de células brancas do sangue periférico foi fortemente associado com o risco de câncer de pulmão em mulheres chinesas, e é o segundo estudo de coorte para relatar uma associação entre maior comprimento dos telômeros e maior risco de câncer de pulmão. No entanto, estes resultados são baseados em amostras de tamanho relativamente modesto e necessitam de replicação em coortes e populações adicionais.