Abstract

Fundo

MLL3 é uma histona 3- lisina 4 metiltransferase com propriedades supressores de tumores que pertence a uma família de genes reguladores da cromatina potencialmente alterados de neoplasia. Mutações no MLL3 foram encontrados em uma análise do genoma inteiro do câncer colorretal, mas não foram confirmados por um estudo separado.

Métodos e Resultados

Foram analisadas as mutações de codificação região e metilação do promotor em MLL3 usando 126 casos de cancro colo-rectal. Encontramos duas isoformas de MLL3 e sequenciamento de DNA revelou frameshift e outras mutações que afetam ambas as isoformas de MLL3 em células de câncer colorretal e 19 de 134 (14%) amostras colorretal primário analisado. Além disso, as mutações frameshift foram mais comuns em casos de instabilidade de microssatélites (31%), tanto em linhas celulares de CRC e tumores primários. A maior isoforma de MLL3 é transcrito a partir de um promotor associado CpG-island que tem altamente homologia com uma pseudo-gene no cromossoma 22 (psiTPTE22). Usando um ensaio que mede ambos os locos simultaneamente encontramos proeminente idade metilação relacionados no cólon normal (de 21% em indivíduos com menos de 25 anos para 56% em indivíduos com mais de 70, R = 0,88, p 0,001) e hipermetilação frequente (83 %) em ambas as linhas celulares de CRC e tumores primários. A seguir, estudou os dois loci separadamente e descobriram que a metilação idade e câncer relacionado era apenas uma propriedade do CpG ilha pseudogene e que o loci MLL3 foi não metilado.

Conclusões

Nós descobriram que mutações frameshift de MLL3 em ambas as células CRC e tumor primário que eram mais comum em casos de instabilidade de microssatélites. Além disso, mostrámos CpG promotor associado a ilha de gene MLL3 não tem a metilação do DNA em células de CRC, mas também do tumor primário e de cólon normal, e esta região tem um alto grau de homologia de pseudogene (psiTPTE22) que foi idade relacionar a metilação de DNA.

Citation: Watanabe Y, Castoro RJ, Kim HS, North B, Oikawa R, Hiraishi T, et al. (2011) alteração freqüente de MLL3 deslocação do quadro de mutações em microssatélites Deficiente câncer colorretal. PLoS ONE 6 (8): e23320. doi: 10.1371 /journal.pone.0023320

editor: Esteban Ballestar, Instituto Bellvitge Biomedical Research (IDIBELL), Espanha |

Recebido: 10 de fevereiro de 2011; Aceito: 15 de julho de 2011; Publicação: 11 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Watanabe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Grants Saúde # CA098006 e CA105346. J-PJI é Professor de Pesquisa Clínica American Cancer Society apoiada por uma oferta generosa do M. Kirby Foundation F.. sequenciamento de DNA no serviço de sequenciação do núcleo no M. D. Anderson Cancer Center é suportado pela Core Grant # CA16672 do National Institutes of Health. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

no cancro colorectal (CRC), uma análise sistemática de 13,023 genes codificadores de proteínas humanas bem anotados revelou mutações em 69 genes candidatos [1]. Entre estes, o gene da metiltransferase histona de linhagem mista leucemia 3 (MLL3) foi mutado em 6 casos. MLL3 é um membro da família de genes TRX /MLL e mapas para 7q36.1 cromossomo. Ele codifica uma proteína prevista de 4911 aminoácidos contendo dois homeodomains plantas (PhD), uma assinatura ATPase alpha /beta, um grupo de alta mobilidade, um conjunto (supressor de diversidade, Enhancer de zeste, Trithorax) e dois FY (tirosina fenilalanina) ricos domínios. proteínas domínios PHD e SET são reguladores de cromatina e vários deles são alteradas no câncer [2]. Inactivação de MLL3 em ratos resulta na formação de tumores epiteliais, sugerindo que funciona como um gene supressor de tumor [3]. Além disso, tem sido relatado MLL3 de ser frequentemente suprimida em leucemias mieloides [4], [5]. Além disso, outros relatórios indicam mutações somáticas no gene MLL3 no glioblastoma e o adenocarcinoma ductal pancreático [6]. No entanto, relatórios subsequentes ainda não confirmados mutações MLL3 em câncer de cólon [7]. Assim, o papel da MLL3 na patogênese da neoplasia colorectal permanece completamente definida.

Neste trabalho, investigamos alterações MLL3 no câncer de cólon e encontraram duas isoformas de MLL3 da qual a isoforma mais longa tem um CpG não reconhecida anteriormente ilha sobrepondo-se ao promotor. Além disso, encontramos novas alterações genéticas em linhagens celulares de CRC e também tumores primários.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pela Universidade do Texas MD Anderson Cancer center e Yonsei University Wonju Christian Hospital Institutional Review Board, e consentimento informado por escrito foi obtido.

linhagens celulares e amostras

Oito linhas celulares de cancro colorrectal (DLD1, SW48, RKO, HCT116, CaCo2, SW620, LoVo e SW480) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Todas as linhas celulares foram mantidas em meio apropriado contendo soro fetal bovino a 10% em placas de cultura de plástico. O ADN foi extraído utilizando o método do fenol clorofórmio padrão, e os ARN totais foram extraídos a partir das células colhidas usando o Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) [8]. Foram estudados 72 amostras de tumores colorectais primários obtidos a partir de Yonsei Wonju University Hospital Christian (Wonju, Coreia do Sul) e 54 amostras de tumores colorectais primários e 8 normal- aparecendo tecidos adjacentes a partir de pacientes com M.D. Anderson Cancer Center (Houston, Texas). Nós também estudou amostras de biópsia de cólon a partir de 21 indivíduos sem história familiar de câncer colorretal e sem lesões do cólon na triagem colonoscopia total.

DNA Mutação e DNA análise de metilação

isolado de cancros grosseiramente microdissecadas foi analisada para determinar a mutação somática de MLL3 usando sequenciação directa, e ambos estado de metilação de MLL3 e psiTPTE22 pseudogene (pseudo-gene da fosfatase transmembranar com homologia angiotensina no cromossomo 22) usando pyrosequencing bisulfite [9]. análise de sequenciação directa foi realizada para identificar as mutações em todos os 59 MLL3 exões utilizando tanto ADN genómico e ADNc de oito linhas celulares de cancro colorrectal, e confirmar estas sequências de regiões de mutação utilizando ADN genómico de dois conjuntos diferentes de CRCs primárias (Tabela 1). As sequências dos iniciadores foram descritos na Tabela S1. Todos os iniciadores foram sintetizados pela Invitrogen (San Diego, CA). A PCR foi realizada em 22,5 ul Platinum PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen, San Diego, CA), 5 uM para a frente e 5 uM iniciadores reversos e 10 ng de ADN genómico. As reacções foram realizadas em 96 termocicladores MJ poços (MJ Research, Waltham, MA) utilizando 30 ciclos do protocolo de amplificação por PCR (desnaturação 94c durante 30 segundos; recozimento 55C durante 30 segundos; estender 68C durante 60 segundos). Os produtos de PCR foram sequenciados directamente na Unidade de MD Anderson Núcleo Sequencing.

A análise de metilação do DNA separado entre MLL3 e psiTPTE22 gene ilhas CpG foram confirmados por bisulfate-sequenciação directa após TOPO-TA clonagem ambas as linhas celulares de cancro colorrectal e CRCs primárias. A informação sobre o reparo incompatibilidade (MMR) deficiência em linhas de células foram coletadas a partir de artigos publicados [10], [11] e o banco de dados do Projeto do Genoma do Câncer Sanger Institute (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/MSI /msi_page.shtml). Nas amostras de câncer colorretal primário, determinou-se a deficiência de reparo incompatível por análise de instabilidade de microssatélites (MSI), conforme relatado anteriormente [12]. Todas as sequências dos iniciadores e condições de PCR são descritas na Tabela S1.

Transcrição Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase

O ADNc da primeira cadeia foi preparado por transcrição reversa de 1 ng de amostras de ARN total utilizando Superscript III inversa transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Em tempo real quantitativa de transcrição reversa-PCR foi realizada utilizando ensaios de expressão de genes Taqman [MLL3 exão 1 de contorno -2, Hs01005501_m1 (sonda A); MLL3 exão limite 38 -39, Hs01005520_m1 (Probe B); MLL3 limite exão 58 -59, Hs01005539_m1 (sonda C) e da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato, Hs_00266705_gl (Applied Biosystems)] em linhas celulares de cancro colorrectal. (Figura 1). ADNc de cólon humano (Biochain, Hayward, CA) foram utilizados como controlos normais; foram preparados a partir de cólon normal, mucosas reunidos a partir de indivíduos saudáveis.

MLL3 é transcrito a partir de dois promotores separados (setas), e o promotor para o transcrito maior contém uma ilha CpG, enquanto não há nenhum na forma truncada. Os locais de mutações encontradas neste e em relatórios anteriores são indicadas por setas. Cada seta corresponde a um único caso com uma mutação, excepto para a uma região com múltiplos setas, que corresponde ao troço poliA. gene MLL3 codifica uma proteína prevista de 4911 aminoácidos contendo dois homeodomains plantas (PhD), uma assinatura ATPase alpha /beta, um grupo de alta mobilidade, um conjunto (supressor de diversidade, Enhancer de zeste, Trithorax) e dois FY (tirosina fenilalanina) domínios ricos. Cada uma das mutações em amostras primárias foram mostrados no esquema estrutura do genoma na Figura 1.

Western Blot

anticorpo anti-MLL3 coelho policlonal (SAB1300328 Sigma-Aldrich, St. Louis , MO)) foi usado para imunoblotting. Os lisados ​​celulares totais foram preparado raspando monocamadas celulares em tampão de ensaio sem SDS [contendo 150 mmol /l de NaCl, 50 mmol /l de Tris-HCl (pH 7,2), 1% de ácido desoxicólico, 1% de Triton X-100, 0,25 mmol /L EDTA (pH 8,0), inibidores de protease e fosfatase, 5 ug /mL de leupeptina, 5 ug /mL de aprotinina, 1 ug /mL de pepstatina A, 1 mmol /l de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 5 mmol /l de NaF, e 100 umol /l de ortovanadato de sódio ] foram determinados, e as concentrações de proteína (Lowry reagente, Bio-Rad, Hercules, CA). Quantidades iguais de proteína foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Análise estatística

os níveis de metilação obtido por pirossequenciao (%) foram analisados ​​como um contínuo variável para comparação de metilação do gene MLL3 com características clínico-patológicas; média e 95% intervalos confidenciais (IC) foram calculados. Frente e verso

P Art 0,05 foi considerado significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando PRISM 4 software (GraphPad Prism, Inc., San Diego, CA).

Resultados

Neste estudo, descobrimos inativação frequente de MLL3 por uma mutação frameshift em microssatélite CRCs deficiente e sem a metilação do DNA na loci MLL3 em quaisquer amostras de cólon.

Para a análise de mutação, nós analisamos 8 linhas celulares de CRC utilizando PCR e sequenciamento de todos os 59 exons de codificação. Nós encontramos mutações em 5º lugar entre as linhas 8 celulares (63,0%). MLL3 tem uma poli-A (A)

9 tracto dentro da sequência de codificação do exão 38, que está incluído no transcrito processado; mutações frameshift homozigóticas foram encontrados em RKO e HCT116, enquanto que mutações heterozigóticas foram encontrados em linhas de células SW48 microssatélites instáveis ​​e LoVo. Estas são todas as linhas de células instáveis ​​microssatélites. Além disso, verificou-se que SW48 e DLD1 têm mutações somáticas separadas de outras regiões de codificação de MLL3 (Figura 1, 2A). Estes resultados da análise de mutação podia confirmar utilizando ADNc (dados não mostrados). Em seguida, analisamos as 3 regiões mutação somática (c.8382delA (frameshift), c.10313G A (p.G3438D), c.13630C T (p.R4544W)) em um conjunto inicial de 72 CRCs primários e encontrou frameshift mutações dentro de (a)

9 trato em 10 amostras (MSI-H, 22,9% (8/35); MSS, 5,4% (2/37)) (Tabela 1). Em seguida, analisamos 9 regiões mutação somática, incluindo os 3 locais encontramos e 6 sites encontrados por Sjoblom et al. [1] em um conjunto separado de 54 CRCs primárias e 21 amostras de pacientes saudáveis ​​(Tabela 1). Nós encontramos mutações frequentes no (A)

9 trato em microssatélites CRCs instáveis ​​(28,6%, 4/14, veja exemplos na Figura 2B), mas há outras mutações nestas amostras. Assim, em geral, encontramos mutações em 19/134 casos analisados ​​(14%). Estas mutações são detectáveis ​​numa vasta gama de a sequência de codificação, com o agrupamento em poli (A) do aparelho, confirmado por análise da nossa tumores instáveis ​​microssatélites.

(A) MLL3 tem uma poli-A (A)

9 tracto dentro da sequência de codificação do exão 38. mutações frameshift homozigóticas foram encontrados em RKO e HCT116, enquanto que mutações heterozigóticas foram encontrados em linhas de células SW48 microssatélites instáveis ​​e LoVo. mutações somáticas separadas foram encontrados em SW48 e DLD1 c.10313G A (p.G3438D), c.13630C T (p.R4544W). (B) as mutações heterozigóticas foram encontrados no mesmo poli-A (A)

9 tracto dentro da sequência de codificação do exão 38.

Para estudar a metilação do DNA, que primeiro notar-se que é transcrita MLL3 a partir de dois promotores separados, um dos quais resulta em uma versão truncada da proteína (Figura 1). O promotor para o transcrito maior contém uma ilha CpG não reconhecida anteriormente, mas não está presente na forma truncada. Analisou-se a metilação de CpG utilizando esta ilha pyrosequencing bisulfite- quantitativa (exemplos na Figura 3A). No entanto, verificou-se que a ilha de CpG de área MLL3 é altamente homóloga (~92%) a uma ilha CpG, o qual se sobrepõe ao promotor de um gene pseudo no cromossoma 22 (psiTPTE22, pseudo-gene de fosfatase transmembranar com homologia tensina no cromossoma 22 : NR_001591). De facto o ensaio pyrosequencing bissulfito foi capaz de amplificar esta região, assim indicando a possibilidade de falsos positivos. Encontramos metilação denso em todas as linhas de 8 células examinadas por pyrosequencing (HCT116, 74%: RKO, 66%: LoVo, 77%: SW48, 50%: CaCo2, 79%: SW480, 65%: DLD1, 72%: SW620, 74%), e um elevado grau de metilação em CRCs primárias (45 de 54 analisados ​​ou 83,3%, Figura 3A). Metilação da ilha CpG no câncer não foi associado com características clínico-patológicas comuns, incluindo idade, sexo, localização e estágio clínico. Um grau mensurável de metilação estava presente na mucosa que aparece adjacente normal da maioria dos pacientes analisados, sugerindo que este lócus pode ser um alvo de metilação relacionada com a idade [13]. De fato, em saudável aparecendo amostras normais de cólon mucosa, encontramos uma forte metilação relacionada com a idade desta ilha CpG (

r

= 0,88,

p

= 0,0001).

(a) Exemplo de resultados usando pyrogram CpG island (região do iniciador para pyrosequencing foi mostrado na Figura 1), com a posição polimórfica C /T em destaque. Sequência lê TC /TGTC /TGGAGGAGGATAAGAG, Pyrogram no cólon shows.normal lado esquerdo e CRC primário (lado direito). (B) O resultado da expressão relativa em linhas de células do cólon e do cancro do cólon normais analisadas por qPCR para o transcrito de comprimento total (Sonda A: Hs01005501_m1) e uma mistura do comprimento total e transcritos truncados (sonda B e C: Hs01005520_m1, Hs01005539_m1) . A expressão relativa na sonda A foi regulada para baixo em 5 das 6 linhas de células examinadas. E as outras duas sondas (Probe B e C) demonstram mínima infra-regulação (ou mesmo sobre-regulação) nestas linhas celulares.

A seguir, procurou compreender melhor a metilação do DNA dos dois homólogos loci através da realização de ensaios de sequenciação directa bissulfito que poderia discriminam os dois loci. Por causa do gene psiTPTE22 é de 10 pares de bases do gene menor do que MLL3 em que a região (Figura 4A). Curiosamente, a metilação do gene MLL3 variou de 0-5% na mucosa e celulares de CRC linhas normais, com excepção para a RKO (14,7%). No entanto, o, gene psiTPTE22 era altamente metilada em amostras de cólon, tanto em linhas celulares de CRC e tumores primários. Adicionalmente, a metilação dos loci psiTPTE22 foi associada a metilação relacionada com a idade na mucosa do cólon normal (Figura 4J).

(A-I) Bissulfito directa sequenciação foi realizada utilizando os iniciadores que cobrem a região promotora de ambos (MLL3 forma maior) e psiTPTE22 usando a idade diferente de epitélios de cólon normais (idade: 24, 31, 38 41, 48, 52, 68 e 82 anos de idade). (J) Dots plotagem associação mostra entre a metilação do DNA em psiTPTE22 e cada idade da amostra. Os resultados mostram que psiTPTE22 metilação foi correlacionada com o envelhecimento, mas não MLL3 (

r

= 0,830,

p

= 0,015).

Para examinar o perfil de expressão MLL3 , foi utilizado qPCR (quantitativo da reacção em cadeia da polimerase) e três sondas Taqman diferentes para cobrir o transcrito de comprimento total (NM 170606) e o transcrito truncado (NM 021230) (Figura 1). Tal como mostrado na Figura 3B, o transcrito de comprimento completo (sonda A) é substancialmente regulado negativamente em 5 de 6 linhas celulares examinadas, sugerindo uma origem genética para este silenciamento (Figura 3B). Por outro lado, as duas outras sondas (sonda B e C), que detectam os dois transcritos truncados e de comprimento completo, demonstrar a mínima diminuição da regulação (ou mesmo sobre-regulação) nestas linhas celulares. Colectivamente, os dados mostram que as mutações somáticas especialmente mutações frameshift no cancro silencia o transcrito de comprimento total, enquanto deixando o transcrito truncado intacta.

próxima analisados ​​dois tamanhos diferentes de proteína de MLL3 em células (tanto de tipo selvagem /desvio de enquadramento mutação). análise de proteínas foi realizada por Western blot para determinar se estas células podem produzir a proteína MLL3 apropriado (Figura 3C). MLL3 tem uma forma truncada na extremidade 3 ‘. Assim, analisamos o nível de proteína utilizando anticorpos MLL3 (este anticorpo foi concebido a partir da fronteira centro MLL3 (Sigma-Aldrich, Cat. # SAB1300328 (St. Louis, MO)). Isso irá detectar apenas isoforma longa do produto de proteína MLL3.

Nós achamos a banda apropriada no CaCo2 e SW480, tipo selvagem do MLL3 e LoVo e SW48, heterozigoto para a mutação frameshift, pelo anticorpo MLL3. em contraste, não houve banda detectável na RKO e HCT116, tanto homozigotos para a mutação frameshift. Estes resultados correlacionados com os níveis de expressão de genes e análise de proteínas de MLL3 (Figura 3B, C).

Discussão

neste estudo, descobrimos inativação frequente de MLL3 por frameshift mutações que não tinham sido previamente relatados.

Nós mostramos que as

9 trato no MLL3 é mutado em tumores deficientes em reparação de incompatibilidade. Um estudo anterior [1] tumores deficientes (a) excluídos de reparo incompatível e ainda mutações encontradas em 2,2% dos casos (6/37). em tumores primários, no entanto, nós selecionados para mutações nas regiões afetadas reportados anteriormente e encontrou apenas as mutações do trato poliA. assim, temos subestimado a taxa de mutação precisa do gene uma vez que nós não sequenciar todos os 59 exons em todos os tumores. No entanto, é evidente que as mutações MLL3 se assemelham aos de outra importante gene supressor tumoral em CRC – TGFBRII. Para ambos os genes, a maioria das mutações observadas em CRC são mutações do tracto poliA em casos deficientes em reparação de emparelhamentos incorrectos [14], mas algumas das mutações também são encontradas fora do tracto poliA, incluindo nos casos sem deficiência de reparação de emparelhamentos incorrectos. Melhorias nas tecnologias de sequenciação e os custos devem permitir uma estimativa precisa das mutações MLL3 em CRCs primários no futuro próximo.

Combinação de epigenética e silenciamento genético caracteriza vários supressor de tumor e genes-predisponentes do câncer, como P16, MLH1, BVS e outros. MLL3 mostrou enganosamente hipermetilação DNA em células de CRC, mas também em tumores primários por análise pyrosequencing bisulfite quantitativa. Para este ensaio analisadas metilação de ADN de locais CpG 224 pb a partir do TSS que indicavam a metilação em linhas celulares de CRC, os tumores primários e de cólon normal. No entanto, verificou-se que em todo o TSS de MLL3 há um alto grau de homologia (~92.0%) a um pseudogene no cromossoma 22, o qual é denominado psiTPTE22 (pseudo-gene de fosfatase transmembranar com homologia tensina no cromossoma 22). TPTE (fosfatase transmembranar com homologia angiotensina) está localizado no cromossomo humano 21 e tem muitas cópias homólogas /pseudogenes no cromossomo 13, 15, 21, 22 e Y [15].

A seguir, analisou estes sítio CpG utilizando bissulfato sequenciamento direto após TOPO-TA clonagem em linhas celulares de CRC (Figura S1A-I)) e as amostras de cólon normais primárias (Figura 4A-J)). ensaio de sequenciação directa bissulfito foi capaz de distinguir o psiTPTE22 de MLL3 após sequenciação, porque a região do promotor do gene psiTPTE é 10 pb mais pequeno do que MLL3 gene (Figura 4A). Descobrimos que MLL3 mostrou apenas 0-5% metilação exceto para RKO, que foi metilado em 13,0%. Por outro lado, foi metilado psiTPTE22 entre 65-90% em todas as linhas celulares de CRC (Figura 4B-I). Addtionally, psiTPTE22 tinham níveis de metilação em tecidos de cólon normais semelhantes ao que nós previamente observado por vários genes [16].

Pseudogenes são parentes extintos de genes conhecidos que perderam a sua capacidade de codificação de proteínas ou de outra forma deixar de se exprimir na célula [17]. Embora alguns não têm íntrons ou promotores, a maioria tem algumas características genéticas semelhantes (tais como promotores, ilhas CpG e locais de splicing), eles não deixam de ser consideradas não-funcional, devido à sua falta de capacidade de codificação de proteínas resultantes de vários desabilitações genéticos ( códons de parada, quadro de leitura, ou a falta de transcrição) ou a sua incapacidade para codificar RNA. Pseudogenes são caracterizados por uma combinação de homologia com um gene conhecido e nonfunctionality. Isto é, embora cada pseudogene tem uma sequência de ADN que é semelhante a alguma gene funcional, eles estão no entanto incapazes de produzir produtos finais funcionais [18].

Curiosamente, Liang et ai descreveram que psiTPTE22-HERV é silenciado por metilação do DNA não somente em cancros gastrointestinais, mas também renal, hepática e câncer de pulmão [19]. E as sequências relacionadas com a HERV em psiTPTE22-HERV são principalmente spliced ​​out como intrões dos transcritos, e a sequência de aminoácidos da proteína de 15 kDa não é um homólogo de quaisquer proteínas retrovirais. Estes fazem o gene psiTPTE22-HERV relacionados com HERV um gene somática normal.

Em resumo, informamos que MLL3 é inativado no CRC por alteração genética. Em particular, descobrimos que liness instável células CRC microssatélite têm mutações frameshift frequentes dentro de uma (A)

9 trato região de MLL3 codificação causando uma perda da função da proteína, e um estudo anterior comunicados sobre mutações fora desse trato no microssatélite cânceres estáveis . Além disso, o CpG island promotor MLL3 é altamente homóloga a uma ilha de CpG da região promotora de um psiTPTE22 pseudogene. psiTPTE22 metilação estava densamente em ambos os CRCs primárias e correlacionada com o envelhecimento em epitélio normal, mas não MLL3 (Figura 4A-J). MLL3 perda de função pode ser uma característica fundamental de desenvolvimento de neoplasias início CRC.

Informações de Suporte

Figura S1.

análise do sequenciamento direto Bissulfito de ambos MLL3 e psiTPTE22 estado de metilação em 6 linhas celulares de CRC. (A-I) Encontrámos 0-5% de metilação MLL3 em todas as linhas celulares. Em contraste, o pseudo-gene (psiTPTE22) foi metilado entre 65-90% em todas as linhas celulares

doi:. 10.1371 /journal.pone.0023320.s001

(EPS)

Tabela S1. sequências

iniciadores utilizados para bisulfite-pyrosequencing e análise de sequenciação directa.

doi: 10.1371 /journal.pone.0023320.s002

(DOC)