Abstract

Fundo

Neste estudo, nós investigamos se a expressão da proteína PKR está correlacionada com níveis de mRNA e biomarcadores moleculares também avaliou que estão associados a PKR, como PKR fosforilada (p-PKR) e fosforilada eIF2α (p-eIF2α).

Metodologia e Descobertas

Nós determinamos os níveis de expressão da proteína PKR e ARNm em 36 tecidos de tumor primário do pulmão frescos usando análise de transferência de Western e PCR em tempo real da transcriptase reversa (RT-PCR), respectivamente. Foram utilizados microarrays de tecido para avaliação imunohistoquímica da expressão das proteínas P-P-eIF2α PKR e. Demonstrou-se que os níveis de mRNA de PKR estão significativamente correlacionados com os níveis de PKR proteína (Rho de Spearman = 0,55,

P

0,001), o que sugere que os níveis de proteína PKR em amostras tumorais são regulados por ARNm PKR. Também foi observado que os pacientes com alto p-PKR ou expressão p-eIF2α tiveram uma sobrevida significativamente maior média do que aqueles com pouca ou nenhuma p-PKR ou expressão p-eIF2α (

p

= 0,03 e

p

= 0,032, respectivamente). Foram avaliados ainda mais o efeito prognóstico da expressão combinada de p-PKR mais PKR e p-eIF2α mais PKR e descobriu que ambos eram fortes combinações de marcadores prognósticos independentes para a sobrevida global paciente em estágio I e todos os pacientes em estágio.

Conclusões

Nossas descobertas sugerem que a expressão da proteína PKR pode controlado pelo nível de transcrição. Os níveis de expressão combinados da PKR e p-PKR ou p-eIF2α pode ser novos marcadores para prever o prognóstico de pacientes com NSCLC

Citation:. Ele Y, Correa AM, Raso MG, Hofstetter WL, Fang B, Behrens C, et ai. (2011) O papel da PKR /eIF2α via de sinalização no prognóstico de Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 6 (11): e24855. doi: 10.1371 /journal.pone.0024855

Autor: John D. Minna, University of Texas Southwestern Medical Center em Dallas, Estados Unidos da América

Recebido: 25 Março, 2011; Aceito: 22 de agosto de 2011; Publicado: 10 Novembro, 2011 |

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento: Este trabalho é apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde, através do MD Anderson Cancer Center suporte Grant CA-016672 – Programa Lung, um Specialized. programa de Investigação de Excelência (SPORE) Grant CA-070907 (para IW), e um R01 Grant CA-124591 (a BF). Um apoio adicional veio do Departamento de Defesa conceder W81XWH-07-1-0306 (a IW), a National Science Foundation Natural da China (30600611, 81071912) (para YH) e “projeto 1510” da Third Military Medical University of China (para YH) e do Fundo de Homer flor Gene Therapy, a Rogers Fundo Gene Therapy Charles, a Wiess Elkins Fundo de Investigação Endowed Margaret, a Flora e Stuart Mason Cancer Research Fund Lung, o Thoracic Fundo Gene Therapy Phalan, eo George P. Sweeney Fundo de Investigação do esôfago (a SS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos. LY é um funcionário da Ziren Research LLC. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A proteína quinase (PKR) é uma serina treonina quinase interferon-inducible /que medeia a síntese de proteínas, um processo bem regulado que é crítico na proliferação celular e diferenciação [1] – [3]. O aumento da expressão de PKR foi mostrado para correlacionar com melhor prognóstico no cancro da cabeça e pescoço e do cólon [2], [3], e evidências acumuladas demonstra que a PKR pode actuar como um supressor de tumor no tratamento da leucemia e outras malignidades hematopoiéticas [4], [ ,,,0],5]. A ligação de ambos os ARN de cadeia dupla (ARNcd) ou ARN de cadeia simples estruturados podem mediar a fosforilação de PKR [6], [7]. Activado PKR fosforila o seu alvo a jusante bem documentada, a subunidade alfa do factor de iniciação de síntese de proteínas eIF2 (eIF2α), que conduz à inibição da síntese de proteínas e desencadear actividades antivirais e antitumorais [8], [9]. Em adição ao seu papel no controlo da tradução, PKR tem sido implicado na imunidade inata antiviral, apoptose, proliferação celular, e a sinalização de stress [10]. Além disso, a expressão PKR e autofosforilação estão aumentadas em vários tipos de cancro, incluindo melanoma, cancro do cólon e cancro da mama [11], [12]. Os resultados de vários estudos demonstraram a importância de eIF2α fosforilado (p-eIF2α) na terapia do cancro [10], [13], [14]: A activação da via de fosforilação de PKR-eIF2a é essencial para as funções antiproliferativos e pró-apoptóticas do gene supressor de tumor [15].

recentemente, descobrimos que a baixa expressão de dsRNA dependente PKR foi significativamente associada com menor sobrevida em pacientes com NSCLC, sugerindo que as funções biológicas da PKR ou suas moléculas a jusante poderia ser fatores prognósticos valiosos em NSCLC [1]. Neste novo estudo, nosso objetivo foi determinar se a expressão da proteína PKR está associada com seus níveis de mRNA e se os seus alvos a jusante, tais como PKR fosforilada (p-PKR) e p-eIF2a, também são fatores prognósticos em NSCLC. Em primeiro lugar, determinou a níveis e proteína expressão do mRNA da PKR no tecido NSCLC fresco congelado e encontrou uma correlação positiva entre a expressão da proteína PKR e níveis de mRNA. Em seguida, usando coloração imuno-histoquímica, foi investigada a expressão de p-PKR e seu bem caracterizada molécula a jusante p-eIF2α em amostras de tissue microarray arquivados. Nossos resultados mostram que p-PKR e p-eIF2α são biomarcadores preditivos de resultados NSCLC e que quando a expressão da PKR foi combinado com expressão de p-PKR ou p-eIF2α, o efeito sobre a previsão de sobrevida do paciente foi reforçada.

Resultados

expressão da proteína PKR está correlacionada com os níveis de mRNA

Para investigar se a expressão da proteína PKR está associada com níveis de mRNA, determinou-se os níveis de expressão de proteína PKR e p-PKR e mRNA PKR em 36 fresco tecidos de tumor primário do pulmão, usando análise de transferência de Western e em tempo real de RT-PCR, respectivamente. A expressão da proteína de β-actina e os seus níveis de ARNm foram também determinadas e utilizadas como controlos. Os resultados das análises de transferência de Western mostrou que as amostras de tumor expressa diferentes níveis de PKR em ambos os níveis de ARNm (Figura 1A e 1B) e de proteína. A análise estatística revelou uma correlação significativa entre a expressão da proteína PKR e os seus níveis de mRNA. (Rho de Spearman = 0,55,

p Art 0,001; Figura 1C). Estes resultados sugerem que a expressão do gene PKR pode causar os diferentes níveis de expressão da proteína PKR em tumores.

A. A análise de transferência de Western de proteína PKR e p-PKR em amostras de tumor. A análise densitométrica da proporção de PKR ou de PKR para p-actina é representa os níveis de proteína normalizados. Cada pista representa uma amostra de tumor de um doente individual. B. níveis de ARNm de amostras correspondentes foram determinadas utilizando quantitativa PCR em tempo real. Os níveis de proteína β-actina e o seu ARNm da mesma amostra foram utilizados como controlos. C. Scatter plot da expressão da proteína PKR correlacionada com a expressão de mRNA (rho de Spearman = 0,55,

p Art 0,001).

Correlação entre p-PKR e expressão da proteína p-eIF2α em tumores NSCLC com características clínico-patológicas

uma vez que a função biológica da PKR está intimamente associada com a sua fosforilação, e eIF2α fosforilação é uma característica da activação PKR, o próximo avaliaram a expressão de proteínas p-eIF2α p-PKR e em TMA espécimes usando coloração imuno-histoquímica. A Tabela 1 resume as relações entre a P-PKR ou p-eIF2α expressão e outras características clinicopatológicas. elevada expressão de p-PKR foi associada com o subtipo de adenocarcinoma (

P

0,001). Não houve correlação entre a expressão de p-PKR e sexo sexo, estágio TNM ou tabagismo. Nós também não encontraram correlação entre a expressão de p-eIF2α e características clínico-patológicas. Imagens representativas de resultados de coloração de imuno-histoquímica da P-PKR e p-eIF2α são mostrados na Figura 2. O p-PKR e proteínas p-eIF2α foram expressas no citoplasma das células tumorais

.

High-expressando casos (A e C). casos de baixo expressando (B e D). A expressão de p-PKR e p-eIF2α foi detectada no citoplasma.

Correlação entre p-PKR e expressão da proteína p-eIF2α em tumores NSCLC com a evolução das doenças

para melhor avaliar se a expressão da proteína p-PKR ou p-eIF2α correlaciona-se com os resultados clínicos de pacientes com NSCLC, análise de Kaplan-Meier revelou que para a fase I e todas as fases, os pacientes com relativamente elevada p-PKR tinham significativamente maior sobrevida do que aqueles com pouca ou nenhuma expressão de p-PKR (Figura 3A e 3C). Para todos os pacientes em estágio, o tempo médio de sobrevivência foi de 105 meses para pacientes com alta expressão de p-PKR e 51 meses para aqueles com pouca ou nenhuma expressão p-PKR. A associação significativa também foi observada entre a expressão elevada p-eIF2α proteína e maior sobrevida no estágio I e todas as fases (Figura 3D e 3F). Não há nenhuma associação significativa foi observada entre alta p-PKR ou alto p-eIF2α expressão da proteína e maior sobrevida em fases II-IV (Figura 3B e 3E).

A-F. As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de acordo com as diferenças de (A, B, C) p-PKR e (D, E, F) a expressão de p-eIF2-α em doentes com estádio I (A, D), em estágios II-IV ( B, e) e todas as fases (C, F) NSCLC. As taxas de sobrevivência foram significativamente piores nos pacientes com baixo p-PKR ou expressão p-eIF2α do que naqueles com alta p-PKR ou expressão p-eIF2α (Fase I:

p

= 0,01 e

p

= 0,02; todas as etapas:.

P

= 0,03 e

p

= 0,03, respectivamente)

em uma análise univariada, um Cox riscos proporcionais modelo indicaram que a P-PKR e p-eIF2α tinha significado prognóstico (Tabela 2). Em uma análise multivariada, verificou-se que p-PKR e expressão p-eIF2α foram estatisticamente significativos associados com a sobrevivência (Tabela 2). Estes resultados indicam que p-PKR e expressão p-eIF2α são biomarcadores independentes de sobrevida dos pacientes.

Nós também examinou as associações entre os níveis de PKR, p-PKR, e p-eIF2α expressão. Nossos resultados indicam que a expressão p-PKR significativamente correlacionada com a expressão de p-eIF2a (rho de Spearman = 0,48,

p Art 0,001). expressão PKR também significativamente correlacionada com a expressão de p-PKR (rho de Spearman = 0,31,

p

= 0,004) e p-eIF2α (rho de Spearman = 0,45,

p Art 0,001). Foram avaliados ainda mais o efeito prognóstico da expressão combinada de p-PKR mais PKR e p-eIF2α mais PKR e descobriu que ambos combinações eram fortes marcadores prognósticos independentes para a sobrevida global paciente em estágio I (Figura 4A e 4B) e todos os pacientes em estágio (Figura 4C e 4D). Para todos os pacientes em estágio, os pacientes com alta PKR e alto p-PKR expressão tinha um tempo médio de sobrevivência de 132 meses, que foi significativamente maior do que a de pacientes com alta PKR e baixa expressão de p-PKR (sobrevivência média, 80 meses; Figura 4C ). Os pacientes com pouca ou nenhuma expressão de PKR e p-PKR tiveram uma sobrevivência significativamente mais curto mediana (43 meses; Figura 4C). Há uma diferença nos resultados para a PKR (H) /p-PKR (H) vs PKR (L) /em pacientes Figura 4A P-PKR (H). A nossa gama de pontuação IHC é 0-300 para PKR e p-PKR. No estudo atual, nós estamos usando mediana de corte (150 para PKR e 70 para p-PKR). Na Figura 4A, I pacientes 106 estágio divididos em quatro grupos, 43 pacientes com alta PKR e alto p-PKR, 21 pacientes com alta PKR e baixa expressão de p-PKR, 32 pacientes com baixa PKR e expressão p-PKR e 10 pacientes com baixo PKR e alta expressão de p-PKR. Estes 10 pacientes têm p-PKR intervalo de pontuação 80-120, estão muito perto de ponto de corte mediano (70), e pode também pertencem à baixa PKR baixo grupo p-PKR. Para todos os pacientes fase, os pacientes com elevada PKR e alta P-eIF2α expressão teve um tempo de sobrevivência médio de 132 meses, o que foi significativamente mais longa do que os pacientes com elevada PKR mais baixo de expressão de p-eIF2α (sobrevivência mediana, 80 meses) e aqueles com baixa PKR mais alta expressão de p-eIF2α (sobrevivência média, 47 meses; Figura 4D). Finalmente, os pacientes com pouca ou nenhuma expressão de ambos PKR e p-eIF2α tiveram uma sobrevida significativamente curto (sobrevivência média, 35 meses; Figura 4D) mediano.

A e C. taxa de sobrevida foi de pacientes significativamente mais baixos com baixa PKR ou baixa expressão p-PKR do que naqueles com alta PKR ou expressão elevada p-PKR no palco I (a) e todas as fases (C) (

p = 0,001

e

p

= 0,001, respectivamente). B e D. taxa de sobrevivência também foi significativamente menor nos pacientes com baixa PKR ou baixa expressão p-eIF2α do que naqueles com alta PKR ou expressão elevada p-eIF2α no palco I (B) e todas as fases (D) (

p

= 0,001

p

= 0,001, respectivamente).

Discussão

Os resultados deste estudo mostram que os níveis de mRNA PKR estão associados com a proteína PKR expressão em tumores NSCLC primária. Nossos resultados sugerem que a expressão da proteína PKR pode controlar os níveis de transcrição. Além disso, os nossos dados sugerem que o tempo real de RT-PCR, um método sensível para analisar quantitativamente os níveis de mRNA, pode ser utilizado para determinar os níveis de ARNm em amostras de biópsias e pode, portanto, ser útil para prever a sobrevivência do paciente. Nós também descobrimos que os pacientes com alta expressão de p-PKR tiveram sobrevivência significativamente maior média do que aqueles com a expressão da proteína pouca ou nenhuma p-PKR. Os resultados de vários estudos de tumores malignos humanos sugeriram que a alta expressão de PKR indica bom prognóstico para pacientes com carcinoma de células escamosas da cabeça ou do fígado [2], [16], sugerindo, assim, que a PKR pode desempenhar um papel importante na supressão da progressão tumoral e afectando apoptose [17]. Estudamos também as vias PKR e descobriram que eles sejam claramente necessário para induzir apoptose em algumas células cancerosas, incluindo o cancro do pulmão, depois de determinados tratamentos, como melanoma gene associado a diferenciação 7 (

MDA7

), E2F-1 , e TNFa [18], [19]. Mais recentemente, e outros demonstraram que alguns pequenos compostos podem induzir a apoptose dependente de PKR em ambas as células de cancro e os fibroblastos murinos embrionárias [20], [21], indicando que modular a actividade de PKR pode ser uma abordagem interessante para terapia do cancro. A nossa descoberta de que as células tumorais de CPCNP que expressam um alto nível de p-PKR correlacionar com um prognóstico favorável é consistente com as observações anteriores de que a activação de PKR está associada com a indução de apoptose.

Os nossos resultados também demonstraram que os pacientes com elevada expressão de tanto PKR e p-PKR tinham significativamente maior sobrevida do que aqueles com outras combinações de níveis de expressão, incluindo aqueles positivo para PKR e negativo para p-PKR e aqueles negativo tanto para PKR e p-PKR. A nossa observação de que 53% das amostras de tumores NSCLC altamente expresso PKR e que 61% deles altamente expressa p-PKR [dados não mostrados] Estes resultados levaram-nos a especular que a expressão de PKR (ou seja, a PKR) e a activação da PKR (ou seja, p -PKR) são influenciados por diferentes expressão do activador ou inibidor de PKR PKR. Outros investigadores relataram que a função de PKR pode ser regulada por proteínas celulares, quer positivamente (por exemplo, MDA-7 /interleucina-24 e PKR-proteína de activação [PACTO]) ou negativamente (por exemplo, p58IPK, nucleofosmina e choque térmico as proteínas de 90 e 70) [18], [19]. Em estudos futuros, vamos procurar determinar quais ativadores e inibidores da PKR afetar a via de sinalização PKR em amostras de tumores NSCLC.

Foi observado que tumores com alta expressão de p-eIF2α tiveram uma sobrevida significativamente mais longa mediana. Em adicional, foi demonstrado que os pacientes com altas expressões de ambos PKR e p-eIF2α também tinham significativamente maior sobrevida do que aqueles com outras combinações de níveis de expressão. A nossa constatação de que 47% das amostras de tumor teve baixa expressão PKR e 27% tiveram alta expressão p-eIF2α [dados não mostrados]. Estes resultados sugerem que a fosforilação eIF2α em alguns tumores NSCLC ocorre independentemente da via de PKR. Além PKR, três quinases eIF2α diferentes que podem fosforilam eIF2α em resposta a diversas condições de stress têm sido identificados: inibidor de heme-reguladas, o homólogo de

Saccharomyces cerevisiae

proteína quinase controlo geral não derepressible-2, e RNA- dependente da proteína-quinase como retículo endoplasmático (ER) quinase (PERK, também conhecido como pâncreas eIF2α quinase) [13]

Em conclusão, nossos dados sugerem que os /eIF2α fosforilados PKR /fosforilada PKR via de sinalização. desempenha um papel importante no prognóstico de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). atividades via PKR pode ser útil para prever resultados NSCLC, e modulando atividades via PKR pode ser um potencial tratamento opção NSCLC.

Métodos

Pacientes e tecidos

pacientes com NSCLC que estavam submetidos a ressecção radical de seu câncer primário da Universidade do Texas MD Anderson cancer Center, entre 2007 e 2008 foram utilizadas para este estudo com base na disponibilidade. Os pacientes foram excluídos do estudo se eles foram previamente submetidos à radioterapia ou quimioterapia para o câncer. Os pacientes, todos com consentimento informado por escrito para o uso de seus tecidos, eo estudo foi aprovado pelo nosso Conselho de Revisão Institucional (University of Texas, MD Anderson Cancer Center). Depois de ser removida por cirurgia, cada tumor fresco foi imediatamente dividido em duas porções; um foi imediatamente congeladas e armazenadas em azoto líquido para a extracção de proteínas e ARN, e o outro foi fixado com formalina e embebidos em parafina para avaliação histopatológica de rotina e diagnóstico. Os tecidos com um teor de célula de tumor estimado de 70% ou mais, foram utilizados para análises moleculares. Além de tecidos dos nossos pacientes, obtivemos 193 NSCLC microarray de tecido (TMA) espécimes (114 adenocarcinomas, e 74 carcinomas de células escamosas) entre 1997 e 2001 a partir do Componente Especializado Câncer de Pulmão de Investigação de Excelência Banco de Tecidos no MD Anderson Cancer Center (Houston , TX). Todos os espécimes foram histologicamente examinados e classificados usando o sistema de classificação da Organização Mundial da Saúde de 2004 [22]. Na maioria dos casos, a informação clínica e patológica detalhada, incluindo os dados dos pacientes demográficos, história de tabagismo e sobrevida global mais o estadiamento da doença TNM e tempo de recorrência, estava disponível (Tabela 1).

Western Blot Analysis

tecidos tumorais congelados foram inicialmente preparared por ser lavados duas vezes em PBS frio. Aproximadamente 20 mg de tecido a partir de cada amostra de fresco foi homogeneizado em 0,5 ml de tampão arrefecido com gelo de lise (1% de NP40, 50 mM de HEPES [pH 7,4], NaCl 150 mM, MgCl 1,5 mM

2, NaF 100 mM, 1 mM EGTA, 1 mM de Na

3VO

4, 10% glicerol, e 10 mM de pirofosfato de Na [Roche Applied Science]), adicionado de fresco contendo protease e fosfato de inibidor. Os lisados ​​foram centrifugados a 14000 g numa microcentrífuga, a 4 ° C durante 10 min, e os sobrenadantes resultantes foram utilizadas como extractos de tecidos. Os extractos, o equivalente a 60 pg de proteína total, foram separados usando um gel de 10% SDS-poliacrilamida e, em seguida, transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com TBS contendo 5% de leite em pó desnatado e depois testadas em PBS contendo soro de bovino a 5%. Foram utilizados os seguintes anticorpos: de coelho anti-PKR (K-17; Santa Cruz Biotechnology), de coelho anti-p-PKR (pT446) (Epitomics), de coelho anti-p-eIF2a (Epitomics), e de ratinho anti-β-actina (Sigma). bandas imuno foram detectadas e quantificadas utilizando um sistema de imageamento infravermelho Li-Cor Odyssey.

transcrição reversa e em tempo real Absolute quantitativa transcrição reversa-Polymerase Chain Reaction (Real-Time AqRT-PCR)

o ARN total (1 ug) de cada amostra clínica congelado foi extraído usando um kit de extração de Trizol (Invitrogen) e a transcrição reversa num volume de reacção de 20 ul por utilização de reagentes Taqman transcrição reversa (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. Os cDNAs foram diluídos e quantificados para a expressão de PKR usando em tempo real de RT-PCR (SYBR Green I) (realizada por Ziren Research LLC, Irvine, CA). Um padrão único foi incorporado para determinar a proporção absoluto de expressão de cada gene alvo e de referência, tal como previamente descrito [23]. As sequências dos iniciadores para a PKR foram como se segue: para a frente, 5′-TCTTCATGTATGTGACACTGC-3 ‘, e reverso, 5′-CACACAGTCAAGGTCCTT AG-3’

Coloração imuno-histoquímica e Avaliação

os anticorpos utilizados. para a análise de transferência de Western foram também utilizados para coloração imuno-histoquímica. secções histológicas de tecido embebido em parafina (5-m de espessura) e fixados em formalina foram desparafinadas, hidratadas e aqueceu-se num vapor durante 10 min com 10 mmole /L de citrato de sódio (pH 6,0) para a recuperação de antigénio. A peroxidase foi bloqueada com 3% H

2O

2 em metanol à temperatura ambiente durante 15 min, seguido por incubação em 10% de albumina de soro bovino em TBS-T durante 30 min. As lâminas foram em seguida incubadas com anticorpo primário a 1:100 diluições durante 65 minutos à temperatura ambiente. Depois de ter sido lavada com PBS, as lâminas foram incubadas com anticorpo secundário marcado com biotina durante 30 minutos. Finalmente, as amostras foram incubadas com estreptavidina-peroxidase a uma diluição de 1:40 durante 30 min. As amostras foram então coradas com 0,05% de 3 ‘, tetracloridrato de diaminobenzidina-3 preparado em 0,05 mol /L de tampão Tris (pH 7,6) contendo 0,02% H

2O

2 e subsequentemente contrastadas com hematoxilina. Como um controlo positivo, foram utilizados tecidos de pulmão embebidos em parafina com epitélios bronquiais normais-fixadas com formalina e. Como um controlo negativo, foram utilizadas amostras de tecido não incubadas com o anticorpo primário. coloração imuno-histoquímica foi quantificada por dois patologistas independentes (Drs. Raso e Pataer) com uma pontuação de intensidade de quatro valor descrito anteriormente [1].

Análise Estatística

A mediana foi usada como ponto de corte para p-PKR e p-eIF2a. Os biomarcadores foram dicotomizadas em grupos de baixo e alto nível como segue: p-PKR: baixo (score≤70), alta (pontuação 70); e p-eIF2a: baixo (score≤150), alta (pontuação 150). Na análise univariada, amostra independente

t

e

X

2

testes foram utilizados para analisar variáveis ​​contínuas e categóricas, respectivamente. Sobrevivência a probabilidade como uma função do tempo foi calculada usando o estimador de Kaplan-Meier. O teste de log-rank foi utilizado para comparações entre os grupos de tempo de sobrevida do paciente. O modelo de riscos proporcionais de Cox foi utilizado para calcular a influência de p-PKR e expressão p-eIF2a no tempo de sobrevivência, com os ajustes feitos para os parâmetros clínicos e histopatológicos (idade, sexo, estado de fumar e tumor subgrupo histológico. O teste de dois lados era usado para testar igual proporção entre os grupos em tabelas de contingência de duas vias a abordagem equação de estimativa generalizada foi utilizada para estimar as diferenças nos meios para os dados de significância estatística foi fixado em P … 0,05

Reconhecimentos

Agradecemos Markeda Wade para revisão editorial. Agradecemos Denise M. Woods e Lakshimi Kakarala por sua assistência técnica.