Abstract

XB130, uma nova proteína adaptador, medeia a proliferação RET /PTC cromossomo relacionados com o rearranjo de células de câncer da tireóide e sobrevivência através fosfatidil inositol-3-quinase (PI3K) /Akt. Recentemente, XB130 foi encontrado em células de cancro diferentes na ausência de RET /PTC. Para determinar se RET /PTC é exigido de proliferação relacionados com o XB130 célula cancerosa e sobrevivência, as células cancerosas da tiróide WRO (com RET mutação /PTC) e as células cancerosas A549 pulmão (sem RET /PTC) foram tratados com XB130 siRNA, e múltiplo Akt para baixo foram examinados os sinais -Stream. Bater-down de XB130 inibida G progressão

1-S fase, e induziu apoptose espontânea e morte celular reforçada intrínseca e extrínseca de apoptose induzida por estímulo. Bater-baixo de XB130 reduzida fosforilação da p21Cip1 /WAF1, p27Kip1, FOXO3a e GSK3β, o aumento dos níveis p21Cip1 /WAF1protein e clivagens de caspase-8 e-9. No entanto, a fosforilação de FOXO1 e os níveis de proteína de p53 não foram afectados por XB130 siARN. Nós também descobrimos XB130 pode ser fosforilada por várias tirosina-cinases proteínas. Estes resultados indicam que XB130 é um substrato de múltiplas proteínas cinases de tirosina, e pode regular a proliferação e sobrevivência celular através da modulação da seleccionados sinais a jusante de PI3K /Akt. XB130 poderiam estar envolvidos no crescimento e sobrevivência das células cancerosas diferentes

Citation:. Shiozaki A, Shen-Tu G, Bai X, Iitaka D, De Falco V, Santoro M, et al. (2012) Proliferação celular XB130 Cancer medeia e Sobrevivência através de vários eventos de sinalização a jusante de Akt. PLoS ONE 7 (8): e43646. doi: 10.1371 /journal.pone.0043646

editor: Laszlo Buday, da Academia de Ciências da Hungria, Hungria

Recebido: 23 Março, 2012; Aceito: 24 de julho de 2012; Publicação: 23 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Shiozaki et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios operacionais (MOP-13270 e MOP-42546) do Canadian Institutes of Health Research, Research Fellowship Prêmios de Uehara Memorial Foundation e da Sociedade Internacional de Transplante Cardíaco para Dr. Atsushi Shiozaki e por Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

XB130 é uma proteína adaptador recém-descoberto para a transdução de sinal intracelular; Ele está envolvido na regulação de genes, a proliferação celular, sobrevivência celular, a migração celular e a tumorigénese [1]. Human

xb130

gene foi descoberto durante o processo de clonagem de

gene

AFAP humano [2], [3], [4]. Ele codifica 818 aminoácidos com um peso molecular aparente de aproximadamente 130 kDa. A estrutura geral do XB130 ações similaridade com AFAP, portanto, também é conhecido como AFAP1 como a proteína 2 (AFAP1L2). Como uma proteína adaptador, a região N-terminal de XB130 inclui vários sítios de fosforilação da tirosina e a sequência rica em prolina, que podem potencialmente interagir com proteínas contendo o domínio SH2 e SH3, respectivamente. A porção média abriga dois plecstrina-homologia (PH) domínios que podem direcionar as proteínas para membranas celulares por meio de interações com fosfolipídios específicos. A região C-terminal contém um domínio de filamento helicoidal, que pode estar envolvido na oligomerização de proteínas e DNA [4] de ligação. XB130 podem interagir e activar a tirosina-quinase c-Src, que conduz à fosforilação de tirosina elevada de múltiplas proteínas, incluindo XB130, e de transactivação AP-1 e SRE [4]. Durante a migração de células, XB130 regula o rearranjo do citoesqueleto de actina, como demonstrado pela sua translocação para a periferia celular em lamelip�ios. Silenciamento endógena XB130 pode causar uma diminuição na taxa de encerramento de feridas, inibir a invasão de matrigel, e reduzir a persistência lamellipodial e o espalhamento das células, o que sugere que desempenha um papel importante na motilidade celular e invasão [5].

XB130 está envolvido na proliferação de células de câncer de tireóide e sobrevivência [1]. O câncer de tireóide é um tipo de neoplasia endócrina, que envolve múltiplas alterações genéticas e epigenéticas que levam a MAPK e ativação da via de sinalização PI3K /AKT [6], [7], [8]. Uma mutação comum encontrado em câncer de tireóide é RET /PTC rearranjos cromossômicos. O produto RET /PTC é uma proteína produzida a partir do rearranjo cromossómico com a combinação da porção 3 ‘do gene de RET e 5’ de um gene secção parceira. Isso resulta em uma tirosina cinase constitutivamente activada, RET /PTC [9]. RET /PTC exposições transformando capacidade via efetuar diferenciação, potencial mitogênico e metastático em carcinoma da tiróide [10], [11]. RET /PTC provoca uma robusta fosforilação de tirosina de XB130, o que promove a sua associação com a subunidade p85α de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K). Este, por sua vez, ativa Akt. Down-regulação da XB130 em TPC1 células cancerosas da tireóide papilar, abrigando o RET /PTC quinase, atividade Akt fortemente reduzida, a progressão do ciclo celular e sobrevivência celular [12]. Além disso, em células WRO, outra linha de células de cancro de tiróide com RET /PTC mutação [13], as células transfectadas estavelmente com XB130 shRNA reduziu o crescimento do tumor em ratinhos nus. estudo de microarray identificou que vários genes regulados pelo XB130 estão relacionados com a proliferação celular ou sobrevivência, incluindo muitos reguladores de transcrição [14].

Desde XB130 é altamente expresso na tiróide, tem-se especulado que ser uma tirosina específica-tiróide substrato da quinase. Recentemente, temos encontrado expressão de XB130 em câncer de esôfago [15], e em outras linhas celulares de cancro. No presente estudo procurou-se determinar se XB130 desempenha um papel em células de cancro independente da presença de Ret /PTC. Além disso, embora a via PI3K /AKT tem sido identificados como sendo importantes para a proliferação de células mediada por XB130 e sobrevivência, os sinais a jusante de Akt são ainda indeterminada. Assim, estudamos estes eventos com células WRO, uma linha de células de cancro da tiróide humana com RET /PTC rearranjo, e A549, uma linha de células de adenocarcinoma de pulmão humano sem RET /PTC.

Materiais e Métodos

linhas celulares, anticorpos e outros reagentes

células WRO de carcinoma folicular de tireóide Humanos (estabelecidas pelo Dr. GJF Juillard, Universidade da Califórnia-Los Angeles School of Medicine, Los Angeles, CA, EUA) foram mantidas em RPMI 1640, suplementado com FBS a 10%, piruvato 1 mM e aminoácidos não essenciais (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, EUA) [13]. As células humanas de adenocarcinoma do pulmão A549, obtidas a partir de ATCC (CCL-185; Manassas, VA) [16], foram cultivadas em meio DMEM, suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, e 1% de glutamina. As células foram cultivadas numa incubadora humidificada padrão, a 37 ° C com 5% de CO

2.

vectores de expressão para RET /PTC3 versões activadas de ABL e SRC [17], ou com o EGFR e ERBB2 [18 ], que são activadas após a sobre-expressão, são descritos noutro local. O anticorpo monoclonal XB130 foi gerado como descrito anteriormente [4]. Os anticorpos para fosfo-Akt (Ser473), Akt, fosfo-GSK-3β (Ser9), p21Cip1 /WAF1, p27Kip1, p53, fosfo-FOXO3a (Thr32), FOXO3a, fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), SAPK /JNK, p38 MAPK fosfo-(Thr180 /Tyr182), p38 MAPK, fosfo-p44 /42 MAPK (Thr202 /Try204), phosho-Src (Try416) foram de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA); anticorpos monoclonais anti-fosfotirosina foram de Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY, EUA) e anti-c-myc (SC-40) eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Anticorpos para GAPDH, ERK1, fosfo-p21 (Thr145), caspase-8 e caspase-9 eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). O anticorpo anti-PCNA foi de Abcam (Cambridge, MA, EUA). Anti-Ki-67, clone Ki-S5, foi de Chemicon (Temecula, CA, EUA). Anti-Src (GD11) e mAb anti-Fas (clone CH11) eram da Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY, EUA). O anticorpo anti-fosfo-p27Kip1 (Thr157) foi de R D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, EUA). Anti-p85α de anticorpo foi de PI3K da BD Pharmingen (San Diego, CA, EUA). Estaurosporina era da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

Estudos de proteína

experiências

Immunoblotting foram realizadas de acordo com procedimentos padrão descritos anteriormente [2], [3]. Resumidamente, as células foram lisadas com tampão de ensaio de precipitação radioimune modificado (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, NaCl 150 mM, EGTA 2 mM, EDTA 2 mM e 1% de Triton X-100) contendo 10 ug /mL de cada um de aprotinina, leupeptina, pepstatina, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, Na 1 mM

3VO

4, e NaF a 10 mM. A concentração de proteína foi medida com um ensaio de Bradford modificado (Bio-Rad, Munique, Alemanha). Os lisados ​​celulares contendo a mesma quantidade de proteínas totais foram separadas por SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de nitrocelulose (Schleicher Schuell, Whatman, Middlesex, Reino Unido). As membranas foram então sondadas com os anticorpos indicados. As proteínas foram reveladas por um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfort, Reino Unido). densidades banda foram quantificados utilizando o software ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij/) depois de ser digitalizado a partir do filme. O protocolo de imunoprecipitação foi anteriormente descrito em detalhe [3], [19].

Transfection siRNA

Dois ARNsi foram concebidos de acordo com a sequência como descrito previamente XB130 [4], [12] . As células foram transfectadas com 50 nM de ARNsi XB130 reunidas usando o reagente oligofectamine (Invitrogen, San Diego, CA, EUA) de acordo com processos convencionais descritos anteriormente [4], [20]. O meio contendo siARN foi substituído com meio fresco após 24 h. O siSTABLE V2 não-segmentação siARN # 1 da Dharmacon (Lafayette, CO, EUA) foi usada como um controlo negativo. Para os estudos de proteína, as células transfectadas de siRNA foram colhidas 48 h após a transfecção.

RT-PCR quantitativo

iniciadores em tempo real específica da sequência para RET humano /PTC foram concebidos por Balogh et ai. : 5′-GTCGGGGGGCATTGTCATCT-3 ‘e 5′-AAGTTCTTCCGAGGGAATTC-3’ [21]. O ARN total foi extraído utilizando o estojo RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) e o ADNc foi sintetizado a partir de ARN total utilizando MuLV da transcriptase reversa (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Quantitativa de RT-PCR foi realizada utilizando o kit de SYBR Green PCR Master I em LightCycler480 (Roche, Indianapolis, IN). Cada ensaio incluiu uma curva padrão de cinco diluições em série e um controlo negativo não-molde. Todos os ensaios foram realizados em triplicado. Os níveis de expressão do gene foram normalizados para o nível de SdhA, um gene de manutenção [14].

análise do ciclo celular

a distribuição do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo [22]. Resumidamente, as células foram colhidas em solução salina tamponada com fosfo (PBS), e fixadas em 70% durante a noite etanol frio. As células fixadas foram lavadas duas vezes em PBS e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 e 2 mg /ml de RNase A em PBS durante 30 min. Eles foram então lavadas uma vez em PBS e coradas com 50 ug /ml de iodeto de propídio (PI) (Sigma-Aldrich). As células coradas foram analisadas com o fluxo Cytomix FC500 sistema de citometria de (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, EUA).

Análise de células em apoptose

Depois de tratadas com estaurosporina ou FasAb durante 24 h, as células foram colhidas e coradas com isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated Anexina V e PI utilizando o kit de Anexina V (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA), seguindo os protocolos do fabricante e analisadas pelo fluxo Cytomix FC500 citometria sistema.

análise estatística

a análise estatística foi realizada utilizando o teste t de Student. As diferenças foram consideradas significativas quando o valor de P foi inferior a 0,05. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software estatístico JMP versão 5 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

Resultados

XB130 Controls ciclo celular progressão das células cancerosas

Para explorar o papel do XB130 na progressão do ciclo celular de cancro que conduziram experiências de knockdown utilizando XB130 siRNA em células WRO carcinoma folicular da tiróide humana (com RET-PTC rearranjo) e em células A549 do adenocarcinoma do pulmão humano (a linha celular vulgarmente utilizada em estudos do cancro do pulmão [15]). Dois siRNAs dirigidos a diferentes locais de XB130 foram concebidos. Nós mostramos anteriormente que ambos reduzido eficazmente os níveis de proteína XB130 e fosforilação de Akt em células TPC-1 [12] e outros tipos de células (dados não apresentados). aplicação combinada destes dois siRNAs reduz a concentração de cada siRNA para metade, portanto, pode reduzir potenciais efeitos fora do alvo. Portanto, temos usado essa estratégia anteriormente [5], [12] e também nos presentes estudos. A citometria de fluxo mostrou que a sub-regulação de XB130 progressão do ciclo celular parcialmente bloqueado a partir de G

1 a fase S em ambas as células A549 e WRO como determinado por citometria de fluxo (Fig. 1A). Há um número significativamente maior de células nas fases G1 do que quer na S ou fase G2 /M (Fig. 1B). Enquanto, Western blots ilustram uma redução significativa em marcadores de proliferação celular, Ki-67 e PCNA, nas células tratadas XB130 siRNA (Fig. 1C). A presença de RET-PTC rearranjo foi confirmada em células TPC-1 (como controlo positivo) e em células WRO, que é, na ausência de células A549, conforme mostrado por RT-PCR (Fig. 1D). Estes resultados indicam que XB130 desempenha papéis importantes na regulação da proliferação celular do cancro, quer na presença ou na ausência de RET /PTC.

(A e B) A sub-regulação de XB130 inibida L

1- progressão da fase S em células WRO e A549. As células transfectadas com ARNsi de controlo ou XB130 foram coradas com PI e analisadas por citometria de fluxo. Média ± SEM.

n

= 6. *

p Art 0,05 (em comparação com o controle siRNA). (C) Redução níveis de Ki67 e PCNA em células A549 e tratada WRO XB130 siRNA, como determinado por Western blotting.

n

= 3. *

p Art 0,05 (em comparação com o grupo de controlo tratado com siRNA). (D) A presença de RET /PTC rearranjo foi confirmada tanto em células TPC-1 e WRO utilizando RT-PCR. As células A549 não contêm RET /PTC rearranjo.

XB130 Controles de sobrevivência de células cancerosas

Para determinar o papel de XB130 na sobrevivência da célula cancerosa, nós tratados WRO e células A549 com XB130 siRNA e do fluxo usado citometria de quantificar e de discriminar entre o (receptor de morte mediada) extrínseca via apoptótica, ea intrínseca (mitocondrial mediada) via apoptótica [23]. A regulação negativa da apoptose induzida XB130 precoce (Anexina V positiva /negativa PI) em células WRO às 48 h após transfecção de siARN (Fig. 2A). Além disso, XB130 siARN reforçada extrínseca (FasAb, clone CH11, 100 ng /ml) e intrínseca (estaurosporina, 200 nM) precoce induzida por estímulo e apoptose tardia de apoptose (anexina V /PI duplo positivo) (Fig. 2A). Por outro lado, em células A549 cultivadas em meio contendo FBS a 10%, a sub-regulação de XB130 não aumentou espontâneo nem a morte celular estaurosporina-ou induzida por FasAb, mesmo a 500 ng /ml de FasAb (Fig. S1A) . Além disso, a utilização combinada de FasAb (500 ng /ml) e IFN-γ (100 ng /mL), uma condição que tem sido previamente reportado que a morte celular induzida em vários outros tipos de células [24], [25], não fez induzir a apoptose em células A549 (Fig. S1B). Western blot revelou que a expressão de Fas endógeno em células A549 é ainda maior do que em células WRO (Fig. S1C). No entanto, sob condições isentas de soro, o tratamento com siRNA XB130 aumentada apoptose precoce induzida por estaurosporina em células A549 (Fig. 2B). Estas descobertas indicam que as células A549 são resistentes a ambos extrínseca e sinais apoptóticos intrinsecamente mediadas. No entanto, XB130 está envolvido na sobrevivência celular em ambas as linhas de células sob condições experimentais diferentes.

(A) A sub-regulação de XB130 melhorada morte celular induzida e espontânea de células WRO cultivadas com 10% de FBS. As células transfectadas com ARNsi de controlo ou XB130 foram tratadas com estaurosporina (STS, 200 nm), ou Fas (FasAb, CH11 clone, 100 ng /ml) durante 24 h. A apoptose foi determinada por citometria de fluxo utilizando PI /anexina V dupla coloração. (B) A sub-regulação de apoptose induzida XB130-estaurosporina reforçada sob condições isentas de soro em células A549. As células A549 transfectadas com ARNsi de controlo ou XB130 foram incubadas em meio isento de soro com ou sem 200 nM STS durante 24 h.

n

= 6. A média ± SEM. *

p Art 0,05 (em comparação com o controle siRNA). (C) XB130 pode ser fosforilada por outras de RET /PTC proteína tirosina quinases. A imunoprecipitação com anticorpo anti-myc em células HEK293 transfectadas com XB130 marcado com myc, juntamente com RET /PTC3, EGFR, Src, Abl, ou erbB2, mostrou um aumento da fosforilação da tirosina XB130 utilizando anticorpo anti-fosfotirosina.

Mesmo que as células A549 não tem RET /PTC, outras PTK endógenos podem fosforilar XB130. Por conseguinte, temos mostrado fosforilação da proteína tirosina dramática em células A549, que pode ser eficazmente reduzida pela inibidor SRC, PP2 [26]. Para testar se se outras cinases de proteína pode fosforilar XB130 em tirosina, células HEK293, uma linha celular vulgarmente usado para testar a interacção proteína-proteína, foram transfectadas com XB130 juntamente com RET /PTC3 como um controlo, ou outra ligada à membrana (marcado com myc EGFR, ERBB2) ou citosólica (SRC, ABL) tirosina-quinases. Os lisados ​​celulares foram imunoprecipitados com anticorpo anti-myc e colocados a hibridar com anticorpo anti-fosfotirosina. Embora a diferentes níveis, todas as tirosina-quinases de proteína de co-expressas com XB130 aumentou a sua fosforilação da tirosina (Fig. 2C).

XB130 se liga a p85α Subunidade de PI3K e Akt Controla Actividade em células cancerosas

os dois cascata de sinalização bem conhecido, que estão implicados na regulação da progressão e sobrevivência celular através da fosforilação de proteínas são a via PI3K /Akt e p38 MAPK vias [7]. Testamos os principais componentes de sinalização nestas duas vias e descobriram que a fosforilação de Src, JNK e ERK não foi afectada em XB130 siARN células tratadas (Fig. S2). Além disso, a fosforilação da p38 foi ainda significativamente aumentada após o tratamento XB130 Siran em células WRO (Fig. S2), o que exclui ainda mais a possibilidade de p38 como um sinal a jusante que medeia XB130 relacionadas com a proliferação celular e sobrevivência.

Demonstrámos anteriormente que XB130 regular a progressão do ciclo celular de cancro da tiróide e sobrevivência através da sua interacção com PI3K, que conduz à activação de Akt. XB130 tem um motivo YxxM no terminal-N a partir de tirosina 54 que se pode ligar, quer ao domínio de SH2 C terminal de p85α-subunidade de PI3K (Fig. 3A) N-ou, como demonstrado por puxar a proteína de fusão-GST ensaios -Down, co-imunoprecipitação, concorrência de fósforo-peptídeo, e uso de XB130 mutantes [12]. Recentemente, a ligação entre XB130 e p85 também foi relatado por Yamanaka et al. em ratos tireóide FRTL 5 células com Moldi-TOF MS ensaio [27]. Em ambas as células A549 e WRO, a ligação entre XB130 e subunidade p85α de PI3K foi mostrada por co-imunoprecipitação (Fig. 3A). Akt é um alvo a jusante de PI3K, e a sua fosforilação no Sor 473 é um indicador sensível da actividade de Akt [28]. XB130 siRNA reduziu efetivamente XB130 níveis de proteína; um fenómeno associado à diminuição da fosforilação de Akt em ambos os WRO e A549 células (Fig. 3b).

(A) Representação esquemática de estruturas de proteínas de XB130 e subunidade p85α de PI3K. Interacções de XB130 com p85α foram detectados por co-imunoprecipitação de células WRO e A549. (B) XB130 siRNA reduziu eficazmente os níveis de proteína XB130 e fosforilação de Akt em células WRO e A549. As células transfectadas de siRNA foram colhidas 48 h após a transfecção.

n

= 5. *

p Art 0,05 (em comparação com o controle siRNA)

progressão do ciclo

XB130 Controls Cancer Cell e Sobrevivência através de múltiplos Akt de Down Stream. moléculas

e p27Kip1 p21Cip1 /WAF1 estão envolvidos na regulação da progressão do ciclo celular através da inibição de quinases dependentes de ciclina CDK1 e CDK2. O dependente da ciclina quinase inibidor p27Kip1 translocação nuclear pode causar parada G1; Akt é capaz de fosforilar p27Kip1, e, assim, bloquear a sua função de translocação e [29], [30], [31]. O inibidor da quinase dependente de ciclina p21Cip1 /WAF1 pode modular negativamente a progressão do ciclo celular por inibição da activação do complexo ciclina /Cdk2 [32]. A activação de Akt também pode fosforilar p21Cip1 /WAF1 e mantê-lo no citoplasma, que pode ser crucial para a sobrevivência celular [33]. Após o tratamento XB130 siRNA, a fosforilação de p27Kip1 e p21Cip1 /WAF1 foram significativamente reduzidos em ambas as células A549 e WRO (Fig. 4A e B).

(A e B) A sub-regulação da fosforilação de p21 XB130 diminuiu e p27, e aumento da expressão de p21 em células WRO e A549. Expressões de p27 e p53 não foram afetados pela regulação negativa dos XB130. (C e D) Down-regulação da XB130 diminuiu fosfolarização de FOXO3a e GSK3β em células WRO e A549.

n

= 4. *

p

. 0,05 (em comparação com o controle siRNA)

Down-regulação da XB130 também aumentou significativamente o nível de proteína total de p21Cip1 /WAF1 (Fig. 4A e B). FOXO3a pode ligar-se e activar o promotor de p21Cip1 /WAF1, que tem forkhead elementos de ligação adjacentes a um elemento de ligação SMAD. PI3K /Akt fosforilação FOXO3a mediada pode levar à sua exportação a partir do núcleo e posteriormente impedir a expressão do gene p21Cip1 /WAF1 [34]. O knockdown XB130 reduziu a fosforilação de FOXO3a (Thr32), sem afectar os níveis totais FOXO3a (Fig. 4C e D). Esta diminuição da fosforilação de FOXO3a pode ajudar a aumentar a expressão p21Cip1 /WAF1. Entre os membros da família FOXO, FOXO1 é conhecido por estimular a transcrição de p27Kip1 [35]. O knockdown XB130 foi incapaz de alterar a fosforilação de FOXO1 (Thr24) e FOXO1 (Ser256) (dados não mostrados). Coincidentemente, o tratamento XB130 siRNA não teve efeito sobre os níveis de proteína p27kip1 em ambas as linhas celulares (Fig. 4A e B).

Outro mecanismo pelo qual Akt pode promover a proliferação celular é para fosforilar e inactivar GSK3β, protegendo, assim, a ciclina D1 , aumento da actividade /CDK6 CDK4, e facilitar a entrada de células na fase S do ciclo celular [36]. A fosforilação de GSK3β foi diminuída após o tratamento XB130 siRNA (Fig. 4C e D). A proteína p53 supressor de tumores é um factor de transcrição que pode induzir quer a paragem do crescimento ou a apoptose. Seus níveis e atividades são controladas principalmente por MDM2, que pode ligar p53 diretamente e promover a sua ubiquitinação e degradação. Akt pode fosforilar a MDM2 e p53, assim, aumentar a degradação [37]. Down-regulação da XB130 com siRNA, no entanto, não afetou p53 níveis.

Akt pode inibir a apoptose por meio de vários mecanismos. Por exemplo, Akt é capaz de fosforilar a pro-caspase-9, impedindo a sua clivagem para a caspase-9 pró-apoptótica, o que medeia a apoptose iniciada sinal intrínseca [38]. A inibição da activação induzida por TRAIL Akt melhorada da caspase-8, que medeia a apoptose iniciada extrínseca sinal [39]. A sub-regulação de XB130 aumento da clivagem de caspase-8 e caspease-9 em células WRO (Fig. 5A e B). Nas células A549, a sub-regulação de diminuição do nível XB130 pro-caspase-8 e caspase aumentou-9 (Fig. 5A e B). Activation (clivagem) de caspase-8 e caspase-9 são passos essenciais para vias extrínsecas e intrínsecas de morte celular, respectivamente [23]. Isto pode explicar porque tanto a morte celular induzida sinal extrínseco e intrínseco foi reforçado por tratamento XB130 siRNA.

(A e B) fragmentos clivados tanto de caspase-8 e-9 foram claramente aumentou a bater-down de XB130 em células WRO. Nas células A549, a sub-regulação de diminuição XB130 pro-caspase-8 e caspase-aumentou 9.

n

= 4. A média ± SEM. *

p

. 0,05 (em comparação com o controle siRNA)

A fosforilação de p21Cip1 /WAF1 por Akt pode resultar em sua acumulação citoplasmática e promove a sobrevivência de células [40]. factores de transcrição da família forkhead podem desencadear apoptose através da indução da expressão de genes que são essenciais para a morte celular, tais como Bim e ligando Fas [41], [42]. Akt pode fosforilar FOXO3a, para bloquear a sua translocação desde o citoplasma para o núcleo [41]. Assim, a regulação negativa de XB130 com siRNA reduziu a fosforilação de p21Cip1 /WAF1 (Fig. 4A e B) e FOXO3a (Fig. 4C e D). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que XB130 está envolvido na regulação da proliferação celular e sobrevivência através de várias moléculas a jusante de PI3K /Akt.

Discussão

XB130 foi encontrado para ser um substrato e parceiro de ligação de RET /PTC, uma proteína-tirosina-quinase oncogénica [12]. Recentemente, verificou-se expressão de XB130 numa variedade de linhas celulares derivadas da tiróide, pulmão, esófago, pâncreas, e cancro do cólon. No presente estudo, demonstramos que XB130 está envolvido na proliferação e sobrevivência de células cancerosas da tiróide WRO (com RET mutação /PTC) e células de carcinoma A549 pulmão (sem RET mutação /PTC). A sub-regulação de XB130 com ARNsi também reduziu a proliferação e sobrevivência de células de cancro esofágico (dados não mostrados). Estes resultados indicam que, além de RET /PTC XB130 podem mediar a actividade de outras proteínas tirosina quinases. Com efeito, quando co-expressa com XB130, várias tirosina-quinases receptoras e cinases de tirosina não-receptoras foram capazes de aumentar significativamente a fosforilação de XB130. Foi demonstrado recentemente que os inibidores da família Src, a PP1 PP2 ou, aboliu a fosforilação da tirosina induzida por cAMP de XB130 e a sua interacção com p85 de PI3K [27]. Portanto, é plausível que XB130 pode ser um substrato de várias proteínas tirosina quinases, e que pode mediar a progresso do ciclo celular e sobrevivência em vários tipos de células de cancro.

XB130 se liga especificamente subunidade p85α de PI3K, que subsequentemente activar Akt. Akt desempenha um papel essencial na proliferação celular e sobrevivência. Down-regulação da XB130 com siRNA afetada várias moléculas a jusante de Akt. Isto sugere que XB130 é um regulador importante na proliferação de PI3K /Akt relacionada célula cancerosa e sobrevivência.

Na última década, tem havido um crescente foco sobre a via PI3K /Akt como um do centro vias para a proliferação celular e sobrevivência [43], [44], [45]. O

classe Ia

PI3K são heterodímeros com uma subunidade reguladora (p85α, p85β ou p55δ) e uma subunidade p110 catalítica (p110α, p110β ou p110δ) [46]. resíduos fosfotirosina específicas sobre os receptores do factor de crescimento activados ou em proteínas adaptadoras podem ligar-se aos domínios SH2 de p85, o que aumenta a actividade enzimática da subunidade catalítica p110 e também recruta a enzima de membrana, em que catalisa a formação de segundo mensageiro lipídico, PIP3, por fosforilam phosphoatidylinositol-4,5-bifosfato (PIP2) na posição 3 ‘no seu anel de inositol [47] (Fig. 6). Encontraram-se um local de ligação consenso p85 (YxxM) na extremidade N-terminal de XB130 que se pode ligar, quer ao domínio de SH2 C terminal de p85α determinada por ensaios de pull-down proteína de fusão com GST N-OR, e que XB130 é co-imunoprecipitada com p85α em células de carcinoma da tiróide humana TPC-1. Fosfo-péptidos contendo a sequência YxxM de XB130 (mas não a sua forma nenhuma fosforilada) reduziu XB130 interação /p85 e supressão de N-terminal abolida interação entre XB130 e p85 [12]. Num estudo recente, Yamanaka et al. encontrado rato XB130 foi associada a subunidade p85 de PI3K, e nomeou-o como PI3KAP. Essa interação é essencial para aumentar a amplificação induzida por cAMP da actividade mitogénica do IGF em FRTL-5 células da tireóide [27]. No presente estudo, a interação entre XB130 e p85 foi encontrada em ambas as células de câncer de pulmão e tireóide. É importante ressaltar que a regulação negativa da XB130 afetou muitas proteínas a jusante de PI3K /Akt. Estas evidências indicam que XB130 é um importante regulador da PI3K percurso através da sua ligação com p85 específico.

A ativação da Akt é uma característica dos cancros da tiróide [48], [49], [50]. Os tumores de pulmão também mostram um nível elevado de Akt fosforilada [51]. O tratamento da tireóide ou câncer de pulmão de células com inibidores de PI3K, LY294002 ou vortmanina, resultou em diminuição do crescimento celular ou viabilidade [48], [49], [50], [52], [53], [54]. Devido ao seu papel crítico na regulação da transcrição de genes, a progressão do ciclo celular, e a sobrevivência, Akt tem sido implicada em muitos tipos de cancro [47], [55]. Identificação de XB130 como um regulador a montante eficaz da via PI3K /Akt pode revelar novos alvos terapêuticos para a terapêutica do cancro.

As oncoproteínas pode aumentar o crescimento do tumor, alterando a progressão do ciclo celular e /ou modulação da morte celular. A regulação da XB130 com siRNA não só a progressão do ciclo celular reduzida, mas a morte celular também aumentou, indicando que XB130 é um regulador a montante chave de ambos os processos celulares. Os nossos resultados indicam que XB130 regula a progressão do ciclo celular e sobrevivência através de várias moléculas, incluindo p21Cip1 /WAF1, p27Kip1, FOXO3a, GSK3β, caspase 8 e caspase 9 (Fig. 6). Apesar de não examinar todos os substratos conhecidos de Akt, os nossos resultados sugerem fortemente que XB130 exerce a sua função reguladora da proliferação e sobrevivência celular através da via PI3K /Akt. Além disso, a sub-regulação de XB130 não afectou a jusante reguladores FOXO1 e p53, indicando que, para além XB130 actividade de Akt relacionadas, estas moléculas podem ainda ser regulada por outros mecanismos de sinalização, o qual por sua vez assegura especificidade de funções relacionadas com o XB130.

em resumo, mostramos que XB130 poderia regular a proliferação e sobrevivência celular através da modulação da PI3K /Akt em células de câncer de pulmão e tireóide. XB130 poderia ser uma oncoproteína romance em vários tipos de câncer. interferência de RNA tornou-se uma ferramenta poderosa para modular a função do gene ambos

in vitro

e

in vivo

[56], [57]. Segmentação expressão XB130 com esta técnica poderia ser uma opção atraente para a terapia do cancro.

Informações de Apoio

Figura S1.

A sub-regulação de XB130 com ARNsi não afectou a apoptose em células A549 na presença de 10% de FBS. As células A549 foram cultivadas em DMEB mais 10% de FBS. (A) A sub-regulação de XB130 não aumentou a morte celular induzida e espontânea. As células A549 foram tratadas com 200 nM STS, ou 500 ng /ml de FasAb durante 24 h. (B) FasAb (500 ng /ml) com IFN-γ (100 ng /ml) não induziu apoptose, tal como analisado por citometria de fluxo utilizando PI /anexina V dupla coloração.

n

= 3. A média ± SEM. (C) A expressão de Fas foram confirmados em A549 e células WRO por transferência Western

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043646.s001

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Figura S2. níveis

fosforilação de Src e MAPK em células WRO e A549 transfectadas com controlo ou XB130 siRNA. Fosfolarização de Src, ERK e JNK não foram afetados pela regulação negativa dos XB130 em células WRO e A549, enquanto phosphrylation de p38 foi aumento de células WRO.

N

= 4. As análises foram realizadas através de Western blotting. Média ± SEM. *

p Art 0,05 (em comparação com o controle siRNA)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043646.s002

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