Abstract

CD133 (prominin-1), uma glicoproteína 5-transmembranar, foi recentemente considerado ser um marcador importante que representa a população subconjunto de células-tronco cancerosas-like. Aqui nós relatamos o isolamento de células CD133-positive (LC-CD133

+) e células CD133-negativo (LC-CD133

-) a partir de amostras de tecido de dez pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas (LC) e cinco linhas celulares de LC. LC-CD133

+ exibido maiores Oct-4 expressões com a capacidade de auto-renovação e pode representar um reservatório com potencial proliferativo para a geração de células de câncer de pulmão. Além disso, a LC-CD133

+, ao contrário de LC-CD133

-, altamente co-expressa o ABCG2 marcador resistente aos fármacos múltiplos e apresentaram uma resistência significativa a agentes de quimioterapia (isto é, cisplatina, etoposido, doxorrubicina, e paclitaxel) e radioterapia. O tratamento da Oct-4 siRNA com vector lentiviral pode bloquear especificamente a capacidade de LC-CD133

+ para formar esferas e pode facilitar ainda mais a LC-CD133

+ para se diferenciar em LC-CD133

-. Além disso, knock-down de Oct-4 expressão na LC-CD133

+ pode inibir significativamente a capacidade de invasão tumoral e formação de colônias, e aumentar actividades apoptóticos de caspase 3 e poli (ADP-ribose) polimerase (PARP). Finalmente,

in vitro

e

in vivo

estudos confirmam ainda que o efeito do tratamento com quimioradioterapia para LC-CD133

+ pode ser melhorada pelo tratamento de Oct-4 siRNA. Em conclusão, demonstramos que Oct-4 expressão desempenha um papel crucial na manutenção das propriedades de auto-renovação, o câncer tronco-like, e chemoradioresistant de LC-CD133

+. A pesquisa futura é justificada em relação à expressão regulada para cima de Oct-4 na LC-CD133

+ e câncer de pulmão maligno

Citation:. Chen YC, Hsu HS, Chen YW, Tsai TH, como CK, Wang CY, et al. (2008) Oct-4 Expressão Mantido-tronco como câncer Imóveis em células CD133-positiva Lung Cancer Derivados. PLoS ONE 3 (7): e2637. doi: 10.1371 /journal.pone.0002637

editor: Ming You, da Universidade de Washington, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Março, 2008; Aceito: 8 de junho de 2008; Publicação: 09 de julho de 2008

Direitos de autor: © 2008 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas de investigação do Conselho Nacional de Ciência (NSC-96-3111-B-075-001-MY3, 95-2314-B-075-055-MY2, 96-2628-B-010-006-MY3, 96 -2314-B-075-024), Taipei Veterans general Hospital (V96C1-151, V96E1-004, V96ER2-016, V96E2-010), os projectos conjuntos de UTVGH (VGHUST96-P1-07), Yen-Tjing-Ling Fundação médica, Taipei City Hospital (96001-62-014, 96001-62-018, 96002-62-092) e Universidade Nacional Yang-Ming (Ministério da Educação, o objectivo para o Plano Universidade Top), Taiwan.

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer nos países industrializados [1], [ ,,,0],2]. A radioterapia e a quimioterapia desempenham papéis importantes e fundamentais em tratamento clínico anti-cancro do pulmão para alcançar a sobrevivência prolongada paciente [3], [4]. No entanto, uma elevada taxa de insucesso e baixa taxa média de sobrevivência são observadas em pacientes submetidos à quimioradioterapia com recorrentes, o cancro do pulmão intratável [5]. Para melhorar a taxa de sobrevivência do paciente, a investigação para elucidar o mecanismo de é necessário tumorigênese do câncer de pulmão [5]. Dados recentes demonstraram que os tumores contêm uma pequena subpopulação de células, isto é, do cancro de células estaminais-like (CSCs) ou células iniciadoras de cancro (CICs), que exibem uma capacidade de auto-renovação e são responsáveis ​​pela manutenção tumoral e metástase [6] . As células estaminais foram isolados pela sua capacidade de efluxo de corante Hoechst 33342 e são referidos como o “lado população (SP)” [7]. Ho e colegas isolado e caracterizado a partir de células de SP de seis linhas celulares de cancro de pulmão humano e mostraram que uma expressão elevada de ABCG2, bem como outros transportadores da cassete de ligação a ATP foram positivamente correlacionada com a resistência a múltiplos fármacos quimioterapêuticos [8]. Além disso, Gutova e colegas têm CSCs uPAR-positivos purificados a partir de linhas celulares de cancro de pulmão de três. Estas células positivas uPAR-co-expressa com CD44 e MDR1, e tinha a capacidade de promover malignidade avançada e quimiorresistência [9].

CD133 (prominin-1), uma glicoproteína transmembranar-5, foi reconhecido pela primeira vez CD34

+ populações progenitoras de sangue adulto, medula óssea, fígado fetal e células [10]. Recentemente, CD133 tem sido considerada um marcador importante para representar a população subconjunto de CSCs em leucemia, tumores cerebrais, retinoblastoma, tumores renais, tumores do pâncreas, carcinoma do cólon, carcinoma da próstata, e o carcinoma hepatocelular [11] – [19]. Com base em achados imuno-histoquímicos, Hilbe e colegas sugeriram que as células progenitoras CD133-positivas (CD133

+) desempenham um papel no desenvolvimento da vasculatura do tumor em doentes com cancro do pulmão de células não pequenas, (NSCLC) [20]. Mais recentemente, um estudo bem desenhado por Eramo e colegas mostraram que o câncer de pulmão contém uma população de CD133

+ CSCs capaz de se auto-renovar e gerar uma prole ilimitado de células não tumorigénicas. Estes

células CD133 + também são resistentes à quimioterapia convencional [21]. No entanto, os mecanismos de regulação do gene na manutenção da auto-renovação e propriedades resistentes aos medicamentos em câncer putativo de células estaminais-como de tumores pulmonares ainda não estão claros.

Oct-4, um membro da família de POU-domain factores de transcrição, é expresso em células-tronco pluripotentes embrionárias (ES) e células germinais [22] – [23]. mRNA Oct-4 é normalmente encontrado em células estaminais totipotentes e pluripotentes de embriões pregastrulation [24]. Nocauteando o

Oct-4 gene

em ratos provoca letalidade precoce devido à falta de formação de ICM, indicando que Oct-4 tem uma função crítica para a auto-renovação das células ES [25]. Oct-4 activa a transcrição através de motivos octâmero, e locais de ligação Oct-4 têm sido encontrados em vários genes, incluindo

fgf 4

(factor de crescimento de fibroblastos 4) e

PDGF

α

r

(derivado das plaquetas-receptor de factor de crescimento α) [26], [27]. Isto sugere que Oct-4 funciona como um interruptor principal durante a diferenciação através da regulação dos potenciais pluripotentes da célula-tronco, e Oct-4 desempenha um papel fundamental no desenvolvimento dos mamíferos [24], [25].

Neste estudo, as células CD133-positivo (LC-CD133

+) e células CD133-negativas (LC-CD133

-) foram isolados a partir de amostras de tecido de cancro do pulmão pacientes (LC) e linhas de células de LC. Estes LC-CD133

+ células possuíam ambas as características de células estaminais-like e tumores malignos. Os nossos dados demonstram ainda que Oct-4 expressão na LC-CD133

+ está envolvido na malignidade do tumor dos cancros do pulmão e exibe propriedades refratárias para quimioradioterapia no câncer de células estaminais-like. Estes resultados sugerem que a expressão de Oct-4 desempenha um papel crucial na manutenção de propriedades cancer stem-like e chemoradioresistant em

células do câncer pulmonar derivados CD133 +.

Materiais e Métodos

isolamento de CD133

+ celular subconjunto

Esta pesquisa seguiu os princípios da Declaração de Helsinki e todas as amostras foram obtidas após pacientes forneceram consentimento informado. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional /Revisão Institucional Conselho de Taipei Veterans General Hospital. As células dissociadas a partir de amostras dos pacientes não-pequenas de cancro do pulmão de células (Tabela 1) e o cancro (LC) linhas celulares de pulmão foram marcadas com 1 mL CD133 /l grânulos micromagnéticas por 1 milhão de células utilizando o kit de isolamento de células CD133 (Miltenyi Biotech , Auburn, CA). CD133

+ células foram cultivadas num meio que consiste em livre de soro de DMEM /F12 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), suplemento N2 (R D Systems Inc., Minneapolis), 10 ng /ml de bFGF recombinante humano ( R D Systems) e 10 ng /ml de EGF (R . D Systems) [28]

determinar a viabilidade celular por Colorimetria Ensaio

O isolado CD133

+ e CD133

– células foram cultivadas em um cluster de cultura de células de 96 poços (Corning Costar, Acton, MA) a uma densidade de 3 x 10

3 células bem com meio de cultura /100 ul. Em pontos de tempo específicos durante o cultivo, o meio foi descartado e substituído com um volume igual (100 uL) de meio fresco contendo 0,2 mg /ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil ) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS, Promega, Madison, WI) e 0,038 mg /ml de metossulfato de fenazina (PMS; Promega) e incubaram-se durante mais 1,5 horas em 37 ° C, 5% de CO

2. A viabilidade celular proporcional à densidade óptica (OD) foi medida pelo ensaio colorimétrico, em termos de actividade de mitocôndrias para converter o sal de tetrazólio em formazano um produto solúvel de cor no meio. Os valores de DO foram medidos no comprimento de onda de 490 nm com um contador 1420 multilabel VICTOR de Wallac (PerkinElmer Wallac, Turku, Finlândia).

em tempo real Transcrição Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)

Para análise em tempo real de RT-PCR, o ARN total de células foi extraído usando o RNA

fácil kit (Qiagen, Valencia, CA). Resumidamente, o ARN total (1 ug) de cada amostra foi transcrito reversamente em 20 ul usando 0,5 ug de oligo dT e 200 U de Superscript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA). A amplificação foi realizada num volume total de 20 uL contendo 0,5 uM de cada iniciador, MgCl 4 mM de

2, 2 ul do LightCycler FastStart DNA mestre SYBR Green I (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) e 2 ul de 1: 10 cDNA diluído. A quantificação das amostras desconhecidas foi realizada por meio do software do LightCycler quantificação relativa, versão 3.3 (Roche Diagnostics). Em cada experimento, o gene GAPDH de limpeza foi amplificada como um padrão de referência. primers GAPDH foram concebidos: GAPDH (f): GCCAAAAGGGTCATCATC (nt 448-465, GenBank NM_002046 sem.), GAPDH (r): ATGACCTTGCCCACA GCCTT (nt 745-765), Oct-4-A (f): CGCAAGCCCTCATTTCAC (nt 5- 22, GenBank não NM_002701), Oct-4-A (r):. CATCACCTCCACCACCTG (nt 98-115, GenBank não NM_002701).. As reacções de PCR foram preparadas em duplicado, e aqueceu-se a 95 ° C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 10 segundos, emparelhamento a 55 ° C durante 5 segundos, e extensão a 72 ° C durante 20 segundos. Todas as reacções de PCR foram realizadas em duplicado. curvas padrão (valores de limite de ciclo em função da concentração template) foram preparadas para cada gene alvo e para a referência endógena (GAPDH) em cada amostra.

imunofluorescência para marcadores Stem Cell

Um avidina-biotina complexo método foi utilizado para a coloração de imunof luorescência no esferóide e diferenciada das células neuronais semelhante. Em resumo, as células foram plaqueadas em lamelas de vidro com poli-L-ornitina-revestido e fixadas com paraformaldeído a 4% durante 15 a 20 minutos à temperatura ambiente, e, em seguida, foram lavadas duas vezes (10 minutos cada) com 1 x PBS. As células foram permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 /PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente, e depois duas vezes (10 minutos cada) com 1 x PBS. As células foram então bloqueadas com uma solução de bloqueio durante 30 minutos e foram incubadas com anticorpos primários (Oct-4, Chemicon, Temecula, CA) durante 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, lavou-se as células três vezes (10 minutos cada) com 1 × PBS. sinais imunorreactivas foram detectadas com uma mistura de coelho biotinilada anti-rato IgG e Fluorsave (Calbiochem, San Diego, CA). As células foram posteriormente sondados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) tagged anticorpos secundários. As imagens de fluorescência foram visualizados com um microscópio de fluorescência. Para analisar quantitativamente a intensidade de fluorescência, que as imagens gravadas com um microscópio de fluorescência invertido equipado com uma câmera CCD. A percentagem de fluorescência sinal por campo fotografado foi analisada por software de processamento de imagem (imagem Pro-Plus, MediaCybernetics, Inc., Silver Spring, MD).

Análise FACS

Para a identificação marcador da superfície celular , uma suspensão única célula de sixth- às células oitava passagem de esferas tripsina foi corado com anti-CD133, CD117 (c-Kit), ou ABCG2 e fluoresceína secundário (ITCF) -ou ficoeritrina (PE) anticorpos -coupled (Dako, Carpinteria). As células foram fixadas com paraformaldeído 2% e foram analisados ​​com um aparelho BD FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ).

Radiação tratamento para celular Análise de Viabilidade

A radiação gama ( irradiação ionizante; IR) foi emitido por uma unidade de cobalto Theratronic T-1000 (Theratronic International, Inc., Otava, Canadá) a uma taxa de dose de 1.1Gy /min (SSD = 57,5 ​​centímetros). Para avaliar a taxa de proliferação de células foi semeado as células em placas de 24 poços a uma densidade de 2 × 10

4 células /poço. As células foram semeadas 24 horas depois de IR e, em seguida, eles foram analisados ​​por méthyle tiazol ensaio de tetrazólio (MTT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MN). A quantidade de MTT formazon produto foi determinada usando um leitor de microplacas e a absorvência foi medida a 560 nm (SpectraMax 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

agentes quimioterapêuticos

cisplatina, etoposido (VP16), e paclitaxel foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich e foram dissolvidos em DMSO (Sigma-Aldrich) a 100 mM de uma solução de estoque.

In Vitro

celular Análise da invasão e agar mole Colony ensaio

foi utilizado o sistema Transwell placa de 24 cavidades com um filtro de membrana de policarbonato de tamanho de poro de 8 um (Corning Costar, Corning, Nova Iorque). A membrana do filtro foi revestida com Matrigel (BD Biosciences, San Diego) diluiu-se com meio isento de soro e incubadas durante a noite a 37 ° C. As suspensões de células foram semeadas ao compartimento superior da cara Transwell à densidade celular de 1 x 10

5 em 100 ul de meio isento de soro. Após 24 horas, o meio foi removido e o filtro de membrana foi fixado com formalina a 4% durante 1 hora. A superfície oposta da membrana de filtro voltado para a câmara inferior foram corados com Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) durante 3 minutos e as células que migraram foram então visualizados sob um microscópio invertido. O protocolo de ensaio de colónia em agar mole é descrito como se segue. Cada poço (35 mm) de uma placa de cultura de seis poços foi revestido com 2 ml de uma mistura de agar de fundo (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,6% (w /v) de agar). Depois de a camada inferior solidificada, 2 ml topo mistura de ágar-meio (DMEM, 10% (v /v) de FCS, 0,3% (w /v) de agar) contendo 2 × 10

foi adicionado 4 células, e os pratos foram incubada a 37 ° C durante 4 semanas. As placas foram coradas com 0,5 ml de violeta de cristal de 0,005% durante 1 hora e em seguida um microscópio de dissecção foi utilizado para contar o número de colónias [29].

Lentivirus mediada por ARNi

O vector pLVRNAi e pCDH-MCS1-EF1-copGFP vector foram adquiridos a Biosettia Inc. (Biosettia, San Diego, CA). O método de clonagem da sequência de cadeia dupla shRNA é descrito no protocolo do fabricante. O oligonucleótido 5′-siRNA CCGGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCGAGTACAGTGC AGTGAAGTGAGGGTTTTT-3 ‘segmentação humano Oct-4 (NM_002701, nt 1035-1055) foi sintetizado e clonado em pLVRNAi para gerar um vector de expressão de lentivírus. O ADNc Oct-4 foi amplificada e purificada por meio de RT-PCR e clonadas num vector pCDH-MCS1-EF1-copGFP. Produção viral foi feito por transfecção de células 293T utilizando Lipofectamina 2000 (LF2000, Invitrogen). Os sobrenadantes foram recolhidos 48 horas após a transfecção e depois foram filtrados; os títulos virais foram então determinados por FACS a 48 horas após a transdução. As células subconfluentes foram infectadas com lentivírus a uma multiplicidade de infecção de 5, na presença de 8 ìg /ml de polibreno (Sigma-Aldrich).

In Vivo

análise do crescimento de tumores e metástases

Todos os procedimentos envolvendo animais estavam em conformidade com as directrizes de protecção dos animais institucionais de Taipei Veterans general Hospital. 1000, 3000, e 10

4 células foram injectadas na veia da cauda de ratinhos SCID e /ou ratinhos nus (BALB /c) cada um com 8 semanas. Na geração de imagens GFP vivo foi visualizado e medido por um dispositivo de iluminação (LT-9500 Illumatool TLS equipado com excitação iluminando fonte [470 nm] e placa de filtro [515 nm]). O tamanho do tumor foi medido com compassos de calibre, e o volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula (comprimento x largura

2) /2. A densidade óptica integrada de intensidade de fluorescência verde foi capturado e, em seguida, analisados ​​pelo software Image Pro-plus [29].

Análise Estatística

Statistical Package de software Ciências Sociais (versão 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) foi utilizado para a análise estatística. O Student independente

t

-teste ou ANOVA foi utilizado para comparar as variáveis ​​contínuas entre os grupos, enquanto que a χ

2 teste foi aplicado para a comparação de variáveis ​​dicotômicas. A estimativa de Kaplan-Meier foi utilizado para a análise de sobrevivência, eo teste de log-rank foi utilizado para comparar as durações de sobrevivência cumulativos em diferentes grupos de pacientes. O nível de significância estatística foi fixado em 0,05 para todos os testes.

Resultados

Isolamento e caracterização de células CD133-positive Lung Cancer derivados

Usando o método do grânulo magnético, isolamos CD133

+ células (Fig. 1A) a partir de amostras de tecido de dez cancro de não pequenas células do pulmão (NSCLC) pacientes (Tabela 1) e cinco cancro do pulmão (LC) linhas de células (Tabela S1). A percentagem elevada (97%) de CD133

+ (LC-CD133

+) subconjunto foi isolado nos tecidos e linha de células de LC LC parental (Fig. 1A). Tem sido relatado que células estaminais do tipo de cancro podem ser cultivadas em suspensão para gerar corpos esferóides-like (SB) em meio isento de soro com bFGF EGF [30]. Descobrimos que a LC-CD133

+ isolado a partir destas dez pacientes (Tabela 1) e cinco linhagens de células LC (Tabela S1) pode formar SB em DF-12, meio isento de soro com bFGF e EGF (Figura 1B;. No. 1 [PLC] e No.2 [LLC]). (Fig. 1D) Além disso, a capacidade de formar SB (Fig. 1C) e taxa de proliferação em LC-CD133

+ foram significativamente maiores do que em LC-CD133

– (p 0,05). Além disso, para determinar o

in vivo

atividade tumorigénico do LC-CD133

+ e LC-CD133

-, nós injetado respectivos valores de 1000, 3000, e 10

4 células em as veias da cauda de ratos SCID. Os resultados mostraram que 10

4 LC-CD133

– não induzir a formação de tumores, mas 3.000 LC-CD133

+ a partir de tecidos de câncer de pulmão de dez pacientes e cinco linhas de células LC em camundongos xenotransplantadas podem gerar visível tumores 4 semanas após a injeção (Tabela 1 e Tabela S1).

(a) Usando um método talão magnético, nós ordenamos CD133

+ células de amostras de tecido de pacientes com câncer de pulmão (LC), e caracterizada -los por ensaio de FACS. (B) LC-CD133

+ classificadas de duas paciente com No.1 (PLC-CD133

+) e No.2 (LLC-CD133

+) foram cultivadas em bFGF e EGF com DMEM sérica meio livre. (C) Avaliação das habilidades de formação de corpos esferóides-like (SB) de LC-CD133

+ e LC-CD133

– em meio livre de soro com bFGF EGF. (D) As curvas de crescimento de LC-CD133

+ e LC-CD133

– foram medidos por hemocitômetro. Barra: 100 fim. Os dados apresentados aqui são a média ± DP de três experiências.

aumento da expressão ABCG2 e capacidade invasiva de LC-CD133

+

In Vitro

Para caracterizar nosso isolado LC-CD133

+, análise de FACS foi utilizada para detectar o perfil de marcadores de superfície de células de expressão. Como mostrado na Figura 2A, a maioria dos isolados de LC-CD133

+ foram coradas com maiores níveis de expressão de CD133, CD117 (c-kit), e em comparação com ABCG2 LC-CD133

-. Este resultado demonstrou que isolado LC-CD133

+ eram células quase ABCG2-positivos (Fig. 2B). Para melhor avaliar o reforço da tumorigenicidade de LC-CD133

+, examinamos

in vitro

Matrigel-combinadas Transwell invasão e ensaios de formação de colónias em agar mole. Comparado com LC-CD133

-, LC-CD133

+ derivado de NSCLC pacientes No.1 (PLC) e No. 2 (LLC) demonstraram maior atividade invasão através de ensaio de invasão Matrigel Transwell (

p

0,001; Fig. 2C). Da mesma forma, a capacidade de formação de focos de LC-CD133

+ do PLC (No.1) e LLC (No.2) foi maior quando comparada com a LC-CD133

– desses dois pacientes (

p

0,001; Fig. 2D)

(a) e (B) Os níveis de CD133, CD117 (c-kit), e ABCG2 expressão foram analisados ​​por ensaio de FACS em LC-CD133

+ e LC-CD133

-. As capacidades de (C) a migração /invasão e (D) os focos de tumor (colónia de agar mole) formação em LC-CD133

+ foram significativamente aumentados em comparação com LC-CD133

– (*

p

0,001). Os dados apresentados aqui são a média ± DP de três experiências.

O aumento da

In Vivo

Tumor-restauração e proliferativa Habilidade em LC-CD133

+

Foram avaliados ainda mais o

in vivo

tumor-restauração e capacidade proliferativa das LC-CD133

+ e LC-CD133

– por análise tumorigenicidade xenotransplantadas (Fig. 3A). Quatro semanas após 10

4 células foram injectados na veia da cauda de ratinhos SCID, um aumento significativo nos nódulos múltiplos de formação de tumor na superfície do pulmão foi observado no LC-CD133

+ – grupo injectado (Figuras 3A4. grupo (Fig 3A1) – 3A7) mas não no LC-CD133

; 3A3.). Nós investigamos ainda mais o

in vivo

taxa de crescimento do tumor em 10

4 LC-CD133

+ células, 10

6 LC-CD133

– células, e 5 × 10

6 células de tumor progenitor a partir do mesmo paciente. A descoberta demonstraram que a taxa de crescimento do tumor do 10

4 LC-CD133

+ grupo (a partir de pacientes n ° 1, 2, 4, e 7; Tabela 1) foi significativamente mais elevada do que a do 10

6 LC-CD133

– grupo e 5 × 10

6 grupo de células de tumor parental (Fig 3B.). Além disso, 10

4 LC-CD133

+ isolado de tumores secundários pode gerar ainda mais novos (segundo) tumores de camundongos SCID transplantados. Os resultados de citometria de fluxo mostrou que uma percentagem elevada (60%) de células CD133-positivo foi detectado em o segundo tumor (Fig. 3C). Além disso, mil LC-CD133

+ isolado a partir do segundo tumor também pode gerar um novo tumor (terceiro) em ratinhos SCID transplantados (Fig. 3C). Para resumir, os nossos dados indicam que a LC-CD133

+ presentes auto-renovação e de repovoamento capacidades tanto

in vitro

e

in vivo

.

(A) As i

n vivo

tumorigenicidade de LC-CD133

+ e LC-CD133

– em ratos injectados com veia da cauda foi analisada por exame macroscópico e histológico. A1-3: LC-CD133

-; setas: estrutura alveolar normal de pulmão. A4-6: LC-CD133

+; Setas: a formação de tumores. A7-9: LC-CD133

+; setas: neovascularizção e trombose. Barra: 200 fim. (B) O

in vivo

tumor-restauração e capacidade proliferativa de 10

4 LC-CD133

+, 10

5 LC-CD133

– e 5 × 10

5 total de células tumorais de um paciente N °, 2, 4, e 7 foram examinados por análise de tumorigenicidade xenotransplantadas. (C) A capacidade de repovoamento do tumor de LC-CD133

+ foi estudada em ratinhos SCID transplantados. Os níveis de expressão de CD133 foram determinados por análise de FACS de LC-CD133 primário

+, segundo tumor, e o terceiro tumor. Os dados apresentados aqui são a média ± DP de três experiências

Avançado quimioterapia e radiação resistência na LC-CD133

+

Foi avaliada a múltiplas drogas (quimioterapia). – habilidades resistentes de LC-CD133

+ e LC-CD133

-. Testamos mais quatro agentes quimioterápicos comuns, incluindo cisplatina, VP16 (etoposídeo), doxorrubicina, o paclitaxel. Comparado com LC-CD133

-, LC-CD133

+ são significativamente resistentes aos agentes quimioterapêuticos testados quatro (

P

0,01; Fig. 4A). Para determinar ainda o efeito de radiação sobre a taxa de crescimento do tumor, foi utilizada uma radiação ionizante (IR) da dose de 0 a 10 Gy para tratar tanto LC-CD133

+ e LC-CD133

-. Como mostrado na Fig. 3B, após o tratamento IR, a taxa de sobrevivência e número de LC-CD133

+ foram significativamente maiores do que as de LC-CD133

– (

p Art 0,01). Descobrimos ainda que a LC-CD133

+ células possuem um grau mais elevado de radiorresistência (

P

0,01; Fig. 4B). Além disso, investigamos o efeito do tratamento combinado de radioquimioterapia em LC-CD133

+. As experiências foram realizadas com cisplatina (10 uM) sozinho, VP-16 (10 ^ M) sozinho, ou combinado com cisplatina e VP-16 no IV (2 Gy) tenha sido tratada com LC-CD133

+. Como mostrado na Figura 3C, os dados revelaram que a taxa de sobrevivência de células na IR-tratada LC-CD133

+ não foi significativamente reduzida pelo tratamento IR combinado com cisplatina, com ou sem o VP-16 (

p

0,05). Pelo contrário, a sobrevivência celular diminuiu significativamente após a quimioterapia com cisplatina combinada com VP-16 em-IV tratados LC-CD133

– (

P

0,01; Figura 4C.). Estes resultados sugerem que LC-CD133

+ pode desempenhar um papel vital na capacidade do tumor para resistir a radiação e quimioterapias.

(A) Ambos 10.000 LC-CD133

+ e LC-CD133

– foram plaqueadas numa placa de 96 poços e tratadas com várias concentrações de cisplatina e VP-16, doxorrubicina, e paclitaxel durante 24 horas em meio 10% de FBS /DMEM /F-12. A taxa de sobrevivência foi determinada pelo ensaio de MTT. (B) Para determinar o efeito de radiação sobre a taxa de crescimento do tumor, uma radiação ionizante (IR) da dose de 0 a 10 Gy, foi utilizado para tratar a LC-CD133

+ e LC-CD133

-. *

p Art 0,01: LC-CD133

+ comparação com LC-CD133

-. (C) O efeito do tratamento combinado de radioquimioterapia em LC-CD133

+ e LC-CD133

– foram ainda avaliados. A quatro protocolos de radiação (2 Gy) somente, radiação com cisplatina (10 uM), a radiação com VP-16 (10 pM), e a radiação com paclitaxel (10 nM) -foram usadas. *

p Art 0,01. Os dados apresentados aqui são a média ± DP de três experiências.

Papel da Oct-4 Expressão em LC-CD133

+

resultados Microarray sugeriu que o nível de outubro de expressão -4 auto-renovação e gene stemness na LC-CD133

+ foi significativamente up-regulada do que em LC-CD133

-. Para validar esta conclusão, examinamos expressão de Oct-4, tanto transcrição e translação. As quantidades de Oct-4 transcrição e proteínas de isolados LC-CD133

+ (Pacientes No.1 [PLC] e No.2 [LLC]) foram significativamente maiores em comparação com as de LC-CD133

– pelo Real -tempo de RT-PCR e análise de transferência de western (fig. 5A e 5B). Para investigar se Oct-4 expressão desempenha um papel na manutenção da auto-renovação ou câncer propriedades estaminais-como na LC-CD133

+, foi utilizado o método de siRNA com vector lentiviral para knockdown de Oct-4 expressão na LC-CD133

+. Descobrimos que é importante que o tratamento de Oct-4 siRNA na LC-CD133

+ pode interferir significativamente com as capacidades de corpos esferóides-like (SB) formação (

p Art 0,001; A Fig. 5C ). Após 7 dias da Oct-4 tratamento siRNA, o SB de LC-CD133

+ não poderia manter esferas flutuantes, mas diferenciadas em células epiteliais-como anexos (Fig. 5C). Em contraste, o tratamento de controlo precipitação siRNA não influenciou a capacidade de formação de SB em LC-CD133

+ (Fig. 5C). O SB da LC-CD133

+ expressa endogenamente sinais positivos fortes para Oct-4 e CD133 (Fig. 5D). Além disso, os resultados de imunofluorescência demonstrou que tanto a CD133 e Oct-4 expressões em LC-CD133

+ foram bloqueados significativamente após 7 dias de tratamento Oct-4 siRNA (Fig. 5D). ensaio FASC confirmou que a quantidade de CD133 foi drasticamente diminuída em Oct-4 LC-CD133 tratados com siRNA

+ e as percentagens de LC-CD133

– foram aumentadas significativamente em LC-CD133

+ após 7 dias de Oct-4 tratamento siRNA (

p Art 0,001; Fig. 5E). Estes dados sugerem que Oct-4 podem manter as propriedades das células-tronco primitivas e inibir a tendência para a diferenciação no LC-CD133

+.

(A) As quantidades de Oct-4 transcrições de LC- isolado CD133

+ foram aumentou significativamente em comparação com os de LC-CD133

– pelo tempo real RT-PCR analisa. (B) dados Blott ocidentais mostrou que os níveis de proteína de Oct-4 em LC-CD133

+ isolado a partir do PLC e LLC foram também significativamente regulada positivamente em comparação com os de LC-CD133

-. (C) A expressão da proteína de Oct-4 na LC-CD133

+ foram efetivamente bloqueado por Oct-4 siRNA. Tratamento de Oct-4 siARN em LC-CD133

+ pode impedir as capacidades de formação de SB SB e facilitar ainda mais a se diferenciarem em células epiteliais do tipo anexado. Barra: 100 fim. (D) Usando coloração de imunofluorescência, mostramos que os níveis de expressão de proteína de ambos Oct-4 e CD133 em LC-CD133

+ foram significativamente diminuída após Oct-4 tratamento siRNA. Barra: 30 um. (E) A proporção de LC-CD133

– foram aumentadas significativamente em Oct-4 tratadas com siRNA LC-CD133

+ por ensaio FACS. *

p Art 0,001. Os dados apresentados aqui são a média ± DP de três experiências.

Avançado Chemoradiotherapeutic Sensibilidade e apoptóticos atividade no LC-CD133

+ tratados por Oct-4 siRNA

Para um estudo mais aprofundado o papel da Oct-4 em malignidade do tumor de LC-CD133

+

in vitro

, foram utilizados a migração /invasivo e ensaio de colónias em agar mole. Os resultados mostraram que as habilidades do

in vitro

migratória invasão e colônia formação em LC-CD133

+ tratados por Oct-4 siRNA significativamente foram reduzidos em comparação com os não-tratados LC-CD133

+ ou LC-CD133

+ tratados com disputa-siRNA (controle;

p Art 0,001; a Fig. 6A). Além disso, o efeito do tratamento da radioquimioterapia para a LC-CD133

+ grupo pode ser significativamente melhorada pelo tratamento de Oct-4 siARN em comparação com não-tratada LC-CD133

+ ou LC-CD133

+ tratados pela disputa-siRNA (Fig 6B;.

p Art 0,001). Além disso, verificou-se que as atividades apoptóticos de anexina V (Fig 6C.) E caspase 3 (Fig 6D;. Parte superior) foram rápida e eficazmente induzida em LC-CD133

+ tratados por Oct-4 siRNA após 72 horas . De acordo com o resultado dos efeitos de sobrevivência celular e tratamento em Out-4-siRNA tratada LC-CD133

+ (Fig. 6B), os dados de Western blot ainda demonstrado que as quantidades de forma activada (clivada) da PARP foram consistentemente elevados em LC-CD133

+ tratados por Oct-4 siRNA com IR sozinho ou combinado com quimioterapia (Fig 6D;. parte inferior). Assim, knockdown de Oct-4 expressão na LC-CD133

+ pode efetivamente melhorar chemoradiosensitivities e atividades apoptóticos em resposta a IR e quimioterapia, sugerindo que Oct-4 poderia ser um fator chave permite LC-CD133

+ para resistir