Sumário

As células cancerosas interagem com áreas fibroblastos do estroma durante tumorigênese, mas as regras moleculares complexas que regem essas interações permanecem pouco compreendidos, assim, impedindo o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para direcionar estroma câncer. Tomámos uma abordagem matemática para começar a definir estas regras efectuando a primeira análise quantitativa em larga escala de fibroblastos efeitos sobre a proliferação de células de cancro através de mais do que quatro pares de linhas celulares cem heterotípicas. modelagem em nível de sistemas deste conjunto de dados complexos usando decomposição em valores singulares revelou que os fibroblastos de tecido normal variavelmente expressar pelo menos duas atividades funcionalmente distintos, um que reflete os programas de transcrição associados com células mesenquimais ativados, que atuam tanto coordenadamente ou com objetivos opostos para modular a célula cancerosa proliferação. Estes resultados sugerem que as abordagens quantitativas pode ser útil para identificar os princípios organizacionais que governam as interações célula-célula heterotípicos complexo em câncer e outros contextos

Citation:. Wadlow RC, Wittner BS, Finley SA, Bergquist H, Upadhyay R, Finn S, et al. (2009) sistemas de nível de Modelagem de Interação Cancer por fibroblastos. PLoS ONE 4 (9): e6888. doi: 10.1371 /journal.pone.0006888

editor: Dov J. Stekel, da Universidade de Nottingham, Reino Unido

Recebido: 01 de abril de 2009; Aceito: 29 de julho de 2009; Publicação: 03 de setembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Wadlow et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do HHMI médico-cientista Início de Carreira (SR) e um Prêmio de Sidney Kimmel Translational Science (SR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As células cancerosas interagir dinamicamente com áreas células estromais. Entre os muitos tipos de células relevantes no estroma do cancro, fibroblastos pareceu funcionar proeminentemente [1]. No entanto, não temos uma compreensão clara de como heterogeneidade molecular e celular dentro deste tipo de célula funcionalmente contribui para a iniciação e progressão do cancro [2]. Em parte, isso é devido aos desafios experimentais inerentes a estudar interações multi-celulares. Enquanto modelos animais cada vez mais sofisticados estão a ser utilizados para definir os mecanismos pelos quais discretas fibroblastos contribuem para a progressão do tumor, estes modelos não são bem adequadas para a descoberta sistemática em vários contextos genéticos e ambientais [3] – [6]. Uma abordagem experimental alternativo envolve a análise da interacção de células cancerosas e fibroblastos dissociados in vitro [7] – [11]. Esta abordagem tem o potencial de permitir que o rastreio sistemático molecular e imparcial para novos alvos estromais que podem, subsequentemente, ser validados em sistemas mais fisiologicamente relevante.

in vitro abordagens para estudar as interacções celulares são geralmente limitados pela escolha de células específicas, condições de cultura, e ensaios. O sistema ideal seria examinar as interações funcionais entre diferentes populações de células de câncer primário e fibroblastos co-derivados dos mesmos tumores. No entanto, as células de cancro humano primárias são notoriamente difíceis de propagar a longo prazo ex vivo, e fibroblastos derivados de tumores primários parecem sofrer alterações fenotípicas em cultura de curto prazo [6]. Em contraste, linhas celulares estabelecidas são facilmente cultivada, relativamente baratos, e facilmente disponíveis, representando, assim, um recurso renovável e potencialmente útil para estudar a interacção do cancro por fibroblastos. Além disso, as condições de cultura podem influenciar o comportamento celular, mas abordagens cada vez mais complexos que tentam imitar as condições fisiologicamente relevantes, como a cultura tridimensional, escala mal [12]. Finalmente, os fibroblastos afetar muitos aspectos do comportamento de células cancerosas incluindo a proliferação e sobrevivência, angiogénese, invasão, metástase e resistência aos medicamentos, mas os ensaios para marcar fenótipos cada vez mais complexas pode ser um desafio para implementar em estudos sistemáticos.

Nós, portanto, realizada uma análise quantitativa e integrado utilizando modelos matemáticos da proliferação de células de cancro em co-cultura bidimensional com um grande número de linhas celulares de fibroblastos normais. Estes estudos revelaram que os fibroblastos de tecido normal variavelmente expressar pelo menos duas actividades distintas funcionalmente na modulação da proliferação de células cancerosas. Além disso, a caracterização da transcrição destas populações diferentes de fibroblastos revelou que pelo menos uma destas actividades pode estar relacionada com os programas moleculares que estão presentes no mesênquima activado. modelagem em nível de sistemas podem, assim, ser útil para identificar os princípios organizacionais que em termos gerais subjacentes às interacções de células e fibroblastos de câncer, e, portanto, pode informar estudos moleculares sistemáticos de interação câncer de fibroblastos.

Materiais e Métodos

linhas de células e o DNA de plasmídeo

As linhas de células foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA) ou Coriell Depósito de Células (Camden, NJ). Todas as linhas de fibroblastos foram utilizados para co-culturas dentro de 10 passagens após a compra. Cancro e células de fibroblastos linhas foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com soro fetal de vitelo 10% (FCS), L-glutamina (4 mM), penicilina (100 unidades /ml) e estreptomicina (100 ug /mL). EGFP rotulagem de linhas celulares de cancro foi feito usando um sistema lentiviral vector de terceira geração. As células 293T foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 de um subconfluentes de 10 cm de placa com o pCCLsin.PPT.hPGK vector (10 ug), em que EGFP tinha sido clonado, bem como pMDLg embalagem P /(7 ug) e de envelope de VSV-G que codifica pMD.G plasmídeos (5 ug). Estes plasmídeos foram obtidos a partir de Rafaella Sordella no Centro para MGH Cancer Research e Luigi Naldini no Instituto Telethon San Raffaele para terapia genética. sobrenadante viral foi recolhido após 48 horas, filtrada com um filtro de seringa de 0,45 micron, e armazenado a -80 ° C. linhas celulares de cancro foram infectadas em poços confluentes em placas de 24 poços, usando 300 ul de vírus em 1 mL de DMEM meio de cultura com 10% de soro fetal de vitelo. Este protocolo resultou taxas de infecção superiores a 80% (determinado por avaliação visual usando microscopia de fluorescência). células de EGFP-negativas foram removidos usando uma versão modificada do laser 5-Becton-Dickinson FACSDiVa com técnicas padrão tal como previamente descrito [13].

quantitativas co-culturas

2 × 10

4 fibroblastos foram semeadas em 100 ul em pelo menos 6 poços em duplicado em cada uma das duas placas de 96 poços e deixou-se aderir a uma monocamada confluente a noite. Subsequentemente 10

3 células cancerosas que expressam EGFP foram semeadas em um adicional de 50 ul para a fibroblastos contendo poços e em poços vazios (150 pL de volume total por poço). Um leitor de placas Spectramax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) foi utilizado para obter leituras fluorescentes, aproximadamente uma vez por dia durante 14 dias (excitação 477 nm, emissão 515 nm). Trinta microlitros de meio fresco foram adicionados a cada poço nos dias 3, 6, 9 e 12. Os poços contendo fibroblastos ou apenas meio, todos com 150 uL de meios por poço no dia 0, foram medidos em paralelo e subtraídos os valores de co -Cultura e monoculturas de poços, respectivamente, para dar conta auto-fluorescência. Todas as culturas foram realizadas em DMEM com 10% de FCS

heterotípicos xenotransplantes:.

Pelotas estradiol (0,72 mg, de libertação de 60 dias, a investigação inovadora da América, Sarasota, FL) foram implantados em fêmeas ratinhos nus (Charles River Laboratories) dois dias antes do xenoenxerto injecções. Os ratinhos foram divididos em 2 grupos: 5 murganhos foram injectados com fibroblastos AG09877 e células de cancro da mama T47D que expressam EGFP, e 5 murganhos foram injectados com fibroblastos e AG04351 células T47D que expressam EGFP. As células foram tripsinizadas e re-suspensos em solução salina equilibrada de Hank com uma concentração de 4 x 10

6 milhões de células por 100 microlitros. Animais anestesiados com isoflurano foram injetados com 4 × 10

6 fibroblastos e 4 × 10

5 células cancerosas no tecido subcutâneo sobre a almofada de gordura mamária. sinal de EGFP foi representada por imagem e quantificado utilizando um sistema de imagiologia óptica BonSai de fluorescência imediatamente após a injecção, por dia, durante quatro dias, e, em seguida, a cada 2-3 dias. Os ratos foram tratados em conformidade com os regulamentos MGH Animal Care Institucional e Comitê de Uso e sacrificados 43 dias após a injecção. tecido do tumor foi ressecado e flash congelado. As secções congeladas foram coradas com hematoxilina e eosina ou com anti-citoqueratina (CAM 5.2, Becton-Dickinson).

O processamento de dados

Para quantificar o efeito de fibroblastos sobre o crescimento de células cancerosas, que definida a curva de mono-cultura, como a diferença em dias

t

entre a medição de fluorescência média para os poços com células cancerosas, mas não há fibroblastos e a medição média de fluorescência para as cavidades com meio isolado. Definiu-se a curva de co-cultura, como a diferença em dias

t

entre a medição de fluorescência média para os poços com células cancerosas e de fibroblastos e a medição média de fluorescência para as cavidades com fibroblastos isolados. Removemos sinal constante, subtraindo o valor menor dia 0. Especificamente, nós vamos e deixe. proporções de co-cultura foi definido como a razão entre a área sob estas duas curvas. Especificamente, onde

M

é a área sob a curva, nós vamos ser os dias para os quais temos medições e interpolados linearmente entre os tempos de medição. Pela regra trapezoidal,

Definimos

C

semelhante a ser a área sob a curva. Nós, então, definida a relação de co-cultura,

E

, por

Para calcular intervalos de confiança (IC) para

E

, foi utilizada a união de três inicialização BC

a dois lados ICs de 95%, cada calculado a partir de 10.000 amostras de bootstrap [14]. As amostras de bootstrap são formadas escolhendo primeiro com a substituição dos dois replicados placas de 96 poços e então escolher com poços de substituição de cada tipo (ou seja, meios-only, fibroblastos, mono-cultura, co-cultura) das placas escolhidas. A relação de co-cultura foi considerado significativo se o IC 95% para

E

estava completamente acima ou abaixo de um.

A modelagem matemática

Nossa hipótese é que um pequeno número de funcionalmente tipos distintos de interacção são a base da grande número de pontos de dados na matriz de relações de co-cultura. Nós suspeitamos que, se pudéssemos determinar um número ideal,

N

, de matrizes mais simples com o qual para aproximar a matriz de relação de co-cultura, então que melhor

N

nos daria uma idéia da número de tipos de interação funcionalmente distintos de trabalho e as matrizes que compõem a aproximação pode nos dar alguns insights sobre a natureza dessas interações.

uma variedade de métodos existem para decompor uma matriz matemática em uma soma de matrizes mais simples que são em alguns ortogonal sentido ou independentes uma da outra [15]. Modelos baseados em decomposição singular valor (SVD) ou análise de componentes principais (PCA) foram mais amplamente utilizado em uma ampla gama de fatores biológicos, químicos e ciências físicas [16]. Exemplos incluem a informação de desconvolução anatómica ou fisiopatológica da dinâmica RM com contraste e análise de tridimensionais relações quantitativas estrutura-actividade para prever a actividade de fármacos candidatos [17] – [19]. Nós escolhemos SVD para a nossa análise sobre o PCA desde PCA primeiros centros de dados, subtraindo de linha ou coluna meios. No entanto, o valor zero do da matriz foi ajustada para igualar uma proporção da AUC de 1, o que significa a ausência de um efeito de co-cultura na proliferação de células de cancro. Assim, para mudar o valor zero subtraindo meios teria sacrificado seu significado intrínseco.

métodos de decomposição são muitas vezes associada a estratégias de validação cruzada para distinguir componentes significativas de ruído estatístico [20]. A estratégia de validação cruzada optamos por utilizar emprega o algoritmo EM para a estimativa dos dados em falta [21] como detalhado abaixo.

Vamos

R

ser a matriz das diferenças entre a co-cultura matriz de relação e 1, de tal forma que valores positivos de

R

correspondem a co-culturas que estimulam a proliferação de células cancerosas e valores negativos de

R

correspondem a co-culturas que inibiram a proliferação de células cancerígenas. Queremos determinar uma óptima

N Compra de

R

. Para isso, usamos modelos cuja complexidade aumenta com a

N

para prever o valor de cada elemento do

R

de todos os outros elementos da

R

e considerem como ideal o

N

para os quais essas previsões são maximamente preciso.

Especificamente, para qualquer matriz

S

, vamos denotar o elemento do

S

em

i

th linha e

j

th coluna, vamos denotar

S

com o elemento

S

na

i

th linha e

j

th coluna faltando e deixar ficar com o elemento que falta preenchido pelo

x

. Vamos ser a aproximação das

S

obtido adicionando o melhor

N

matrizes de decomposição em valores singulares da

S

(ou seja, aqueles que correspondem ao

N

maiores valores singulares). No caso de falta de dados que definem pelo algoritmo EM para a estimativa dos dados em falta, como se segue. Letand deixe

Em nossa experiência, este algoritmo EM sempre convergiram como

k

aumenta para que possamos deixar

Letand deixe Ser a mediana da sobre todo o

i

e

j

. O

N

para os quais é mínima é considerado o melhor

N Compra de

R

.

perfil de expressão gênica

Confluent placas de fibroblastos (replicando as condições de co-cultura) ou células cancerosas em crescimento de fase log foram tripsinizadas, centrifugadas em peletes, e rapidamente congelados em azoto líquido. RNA foi isolado com kits Qiagen RNeasy e perfilados usando Affymetrix HG-U133 mais 2,0 microarrays com protocolos padrão [22].

Resultados e Discussão

Em primeiro lugar temos sistematicamente co-cultivadas doze materno humano, melanoma e linhas de células de câncer de pulmão com trinta e seis linhas não transformadas, humanas de fibroblastos de células derivadas de pele normal e pulmão (ver Tabela S1 e S2 Table para detalhes). Cada linha de células de cancro foi etiquetado com EGFP utilizando transdução de lentivírus para permitir a quantificação compósito de proliferação de células cancerosas e a sobrevivência ao longo de catorze dias, utilizando um sistema de ensaio baseado no leitor de placas simples. Para cada linha celular de emparelhamento (n = 432), o que foi examinado em múltiplas repetições mais experiências independentes, que calculada a razão entre a área sob a curva de EGFP para as células de cancro cultivadas em co-cultura dividida pela área sob a curva para as células cancerosas cultivadas isoladamente (Figura 1A). Descobrimos que cinquenta e três anos de 432 pares de linhas de células (12%) eram do crescimento-estimuladoras em termos absolutos, definido por um intervalo de confiança de 95% com um limite inferior maior do que 1 (Figura 1B). Em contraste, 176 (41%) eram inibidor do crescimento e 203 (47%) foram nulos. Estes dados demonstram que apenas uma minoria de pares de linhas celulares heterotípica rendimento aumentou crescimento de células cancerígenas.

A) representação mapa de calor dos rácios de co-cultura determinadas experimentalmente para 432 interacções linhagem celular de câncer de fibroblastos. Red refere-se a interações de crescimento-estimuladoras e azul para interações de crescimento-supressiva. B) As interacções resultantes de estimulação estatisticamente significativa das células cancerosas de crescimento (isto é, o limite inferior do IC de 95% para a proporção de co-cultura é 1) são mostrados no vermelho, e as interacções resultantes de inibição do crescimento estatisticamente significativo de células cancerosas ( isto é, o limite superior do CI de 95% para a proporção de co-cultura é 1) são mostrados a azul. O círculo indica a interação entre T47D e AG04351, eo quadrado indica a interação entre T47D e AG09877.

Para explorar a relevância destes co-culturas in vivo, o próximo foco em dois Câncer específica emparelhamentos de fibroblastos que exibiram efeitos opostos proliferativas in vitro. Especificamente, AG09877 estimulada T47D proliferação, enquanto AG04351 era inibidor do crescimento para esta mesma linha celular de cancro. A co-injecção de células T47D e fibroblastos AG09877 subcutaneamente em ratinhos nus, levou à formação de pequenos tumores mais de uma semana (Figura 2A e 2B). Em contraste, xeno-enxerto dessas células cancerosas com fibroblastos AG04351 não resultou na formação de tumores. Estes resultados confirmaram que os efeitos opostos de diferentes populações de fibroblastos sobre o crescimento de células de cancro in vitro podem também ser observadas in vivo. T47D sozinho é fracamente tumorigénico (dados não mostrados) [23], [24], e o facto de a maioria dos tumores induzidos regrediram permanentemente após a primeira semana sugeriu que o efeito de crescimento-estimuladoras de fibroblastos AG09877 foi geralmente insuficientes para sustentar o crescimento prolongado de esta linha de células in vivo. Notavelmente, no entanto, um animal, na verdade, desenvolveu um tumor persistente ao longo de seis semanas. O exame patológico deste único tumor revelou células cancerosas EGFP positivos incorporados dentro de um componente do estroma desmoplásico significativa (Figura 2C). Embora apenas uma única experiência, este resultado sugeriu que provocador de crescimento de fibroblastos-estimuladoras identificados in vitro pode ser capaz de exercer efeitos tumorigénicas ambas transientes e mais prolongada nas células cancerosas adjacentes in vivo.

Um sinal de EGFP) a partir de injecções EGFP-expressando T47D células com fibroblastos AG09877 (5 ratos, azul da curva) ou fibroblastos AG04351 (4 ratos, curva vermelha). As barras de erro representam o erro padrão da média. B) imagens representativas dos ratos xenoenxerto com cada mistura tomado 3 dias após a injecção, com setas brancas apontando para locais de injecção. C) As fotomicrografias de um tumor T47D-AG09877. Da esquerda para a direita:. Hematoxilina e eosina, fluorescência da GFP, e imuno-histoquímica para citoqueratina

A seguir, teve como objetivo identificar princípios organizacionais subjacentes a matriz de co-culturas que possam fornecer insights sobre os determinantes biológicos da câncer de fibroblastos interação. Sistematicamente recriar a matriz de interacção celular utilizando xenoenxertos heterotípicos poderia ter oferecido mais conhecimento sobre a relevância fisiológica de pares individuais, mas não era viável para 432 interações diferentes. Nós, portanto, usou uma abordagem de nível de sistemas para caracterizar e nosso modelo de dados in vitro. Para começar, a inspecção rápida dos dados na Figura 1 revela que as linhas celulares de cancro podem ser agrupados em aqueles que eram predominantemente inibido (n = 3), em grande parte inibidos (n = 6), ou fortemente estimulado (n = 3) por fibroblastos , sugerindo que a resposta de crescimento de uma linha celular de cancro num dado co-cultura de estroma foi pré-programada e independente da linha de fibroblastos emparelhados (por exemplo, Figura 3A). No entanto, apenas SKBR3 exibida respostas uniformes em todas as linhas de fibroblastos, implicando várias contribuições específicas de fibroblastos a proliferação de células cancerosas. Em vários casos, esta contribuição de fibroblastos foi suficiente para anular a predisposição geral da linha celular de cancro, conduzindo a uma interacção estimuladora do crescimento com uma linha celular de cancro de outra forma o crescimento inibido ou vice-versa (por exemplo, a Figura 3B). Assim, a resposta de crescimento de linhas celulares de cancro de co-cultura de estroma parecem resultar da combinação de uma contribuição determinada célula cancerosa-dominante e um efeito menor, mas muitas vezes fibroblastos criticamente importante.

A) A resposta de crescimento de cancro linhas celulares (círculos) a fibroblastos (formas oblongas) é determinada predominantemente pela capacidade pré-programada de células cancerosas para proliferar em resposta a sinais de fibroblastos genéricos (setas pretas) partilhados em comum em todas as linhas de fibroblasto. Algumas linhas celulares de cancro (verde) são o crescimento estimulado, enquanto outros (amarelo) não respondem ou o crescimento inibido. B) Os sinais adicionais produzidos por subconjuntos de fibroblastos (setas vermelhas) acrescentam complexidade por qualquer proliferação ainda mais estimulante célula cancerosa (painel superior esquerdo) ou compensar a falta de resposta a sinais genéricos (painel inferior esquerdo). Embora todos os sinais neste esquema são definidos como crescimento-estimuladoras, eles também podem ser inibidor do crescimento, aumentando assim ainda mais a complexidade.

Embora a Figura 3B representa esquematicamente um modelo parcimonioso sinal de dois, o número total de interacção tipos não poderia ser facilmente inferida por meio de inspeção qualitativa de nosso conjunto de dados. Por isso, usaram um modelo matemático baseado em decomposição em valores singulares para perguntar se o complexo padrão de estimulação do crescimento e inibição observou-se através deste conjunto de dados resultou de um pequeno número, finito de tipos de interação entre as células e fibroblastos cancerosas. Decompondo a matriz de relações de co-cultura em uma soma de

N

matrizes de componentes, usamos uma estratégia de validação cruzada leave-one-out para definir o valor ideal para

N

(Figura 4 ; ver materiais e métodos para detalhes completos do modelo). Verificou-se que o erro de validação cruzada mediana atingiu o seu ponto mais baixo com

N

= 3, o que sugere que a proporção de co-cultura líquida para cada emparelhamento linha celular resultou a partir da soma dos valores de interacção representada por três matrizes de componentes distintos. Uma matriz, que foi responsável pela maioria de redução de erros no modelo, que se reflecte a capacidade de resposta variando de diferentes linhas de células de cancro para os sinais do estroma genéricos produzidos pelos fibroblastos (Figura 5A). Por exemplo, 9 de 12 linhas celulares de cancro geralmente respondeu a fibroblastos com crescimento retardado, tal como exemplificado por SKBR3 e MCF7, enquanto que as linhas de células de três cancerosas foram geralmente estimulados-crescimento, como evidenciado pela BT-474 e SK-MEL-2.

leave-one-out Median erro de validação cruzada quando a matriz de relações de co-cultura é aproximada pela soma de matrizes de componentes N.

a) -C) decomposição do co matriz -cultura 3 em matrizes de componentes. Quando as linhas aplicáveis, de cancro e de células de fibroblasto são divididos em dois grupos (X, verde, e Y, roxo) de tal forma que as interacções dentro do mesmo grupo de tornar o crescimento-estimuladoras (isto é, positivo) contribuições para a proporção de co-cultura estimada e das interacções entre oposto grupos contribuir inibidores do crescimento (isto é, negativas) para a proporção de co-cultura estimada. Os valores de P referem-se a tecidos de origem segregação entre os grupos X e Y. Os círculos indicam a interacção entre T47D e AG04351, e os quadrados indicam a interacção entre T47D e AG09877. Red refere-se a interações de crescimento-estimuladoras e azul para interações de crescimento supressiva, com uma intensidade correspondente à força do efeito e dimensionadas de forma independente dentro de cada matriz.

Em contraste, a matriz B e C matriz refletido distinta atividades de fibroblastos que se correlacionaram significativamente, mas imperfeitamente com o tecido de um determinado fibroblastos de origem (p = 6 × 10

-5 e p = 0,0072 para matrizes B e C, respectivamente) (Figuras 5B e 5C). No espaço de cada matriz, os fibroblastos foram subdivididos em dois grupos que interagiram com subconjuntos distintos de linhas celulares de cancro para promover a proliferação de células de cancro (verde vs roxo na figura 5). Embora a maioria das linhas celulares de cancro interagiram cooperativamente com os fibroblastos da pele “, como” em-matriz B, uma maioria diferente favorecido os fibroblastos de pulmão de “equivalentes” em matriz C. Consequentemente, fomos capazes de identificar vários exemplos em que a mesma fibroblastos emparelhamento -Câncer resultou em efeitos positivos sobre a proliferação de células de cancro em uma matriz e efeitos negativos no outro (por exemplo, T47D-AG07139), sugerindo que os fibroblastos poderiam interagir com as células cancerosas de pelo menos duas maneiras funcionalmente distintos.

Apesar o facto de que a maioria de redução de erros no modelo foi contribuído pela matriz a, em alguns casos, o tamanho do efeito em matrizes B e C em combinação foi suficiente para anular que em matriz A. de facto, a análise revelou que mais de perto os efeitos líquidos diferentes fibroblastos sobre a proliferação de células cancerosas só poderia ser determinada com precisão, considerando os

contribuições

quantitativas de efeitos de todas as três matrizes. Isto é ilustrado por interacções entre a linha celular de cancro da mama T47D e as duas linhas de células de fibroblastos da pele e AG09877 AG04351 (denotado na Figura 1A e Figura 5A-C por quadrados e círculos, respectivamente). Uma matriz (Figura 5A) revelou que T47D foi geralmente predispostos a supressão do crescimento de todas as linhas de células de fibroblastos. Uma explicação plausível para este biológica pode ser a expressão de um receptor da superfície celular para algum factor de citostático segregada por todos os fibroblastos. No entanto, a matriz B (Figura 5B) indicou que a maioria das linhas de células de fibroblastos da pele tinha uma actividade estimuladora de crescimento para T47D, com algumas exceções notáveis, incluindo AG04351. Em teoria, esta actividade podia ser devido à expressão pela maioria dos fibroblastos da pele de um factor de crescimento mitogénico específico. Em contraste, a matriz C (Figura 5C) indicou que a maioria das linhas de células de fibroblastos da pele tinham também uma segunda actividade inibidora do crescimento distinta para T47D, com a excepção importante de AG09877 e vários outros. Esta actividade pode ser atribuída, com a secreção pela maioria dos fibroblastos da pele de um inibidor de crescimento de citoquina específica. Assim AG09877, expressando a atividade de crescimento-estimulação e falta a actividade inibidora do crescimento, fez duas contribuições de crescimento-estimulação funcionalmente distintas para o crescimento T47D que eram suficientes em combinação para substituir a predisposição geral do T47D para fibroblastos mediada por supressão do crescimento. Em contraste, AG04351 só fez contribuições crescimento supressivos com respeito a ambas as atividades de fibroblastos.

Para obter insights sobre a identidade molecular destas actividades de fibroblastos, que isolado RNA das monoculturas de linha de células de fibroblastos 36 e executou a expressão do gene à base de microarray perfilar usando gene chips Affymetrix. Em primeiro lugar, identificaram genes que foram diferencialmente expressos entre a pele e pulmão fibroblastos, entre os grupos X e Y na matriz B, e entre grupos X e Y na matriz C. Em seguida, usamos análise do gene conjunto de enriquecimento (GSEA) [25] para identificar conjuntos de genes enriquecida em cada comparação. Utilizando um limite de taxa de detecção falsa (FDR) de 0,25, foram identificados nove conjuntos de gene enriquecida na pele versus distinção de fibroblastos de pulmão, incluindo dois que caracterizam a transição (EMT) fenótipo epitelial para mesenquimal (Tabela 1) [26]. Embora associado com FDRs mais elevados, ambos os conjuntos também foram enriquecido no B

x (pele-like) vs. B

y (pulmão-like) distinção. Em contraste, há conjuntos de genes foram sinalizadas no C

x (pele-like) C

y distinção (pulmão-like) vs., sugerindo que esta atividade de fibroblastos tanto pode refletir diferenças de transcrição única induzidas dentro do contexto da co-cultura ou diferenças não-transcricionais que não poderia ser facilmente detectados usando perfis de transcrição à base de micro-arranjo.

EMT descreve um programa coordenado de fenótipos celulares cada vez mais reconhecido como crucial para a metástase de células de carcinoma. Estes fenótipos incluem perda da polaridade celular epitelial, aumentou a migração celular, invasão e em tecidos circundantes [27]. Além disso, provas recentes indicam que os programas EMT também regular funções de células mesenquimais incluindo a angiogénese [28]. Além disso, o factor de transcrição Snail, o principal regulador de EMT, é expresso em fibroblastos activados dentro de cicatrização de feridas e na interface tumor estromal [29]. Os nossos dados sugerem, assim, que os programas EMT são preferencialmente expressas por muitos fibroblastos da pele, talvez servindo como a base molecular para uma das actividades de fibroblastos (Tipo B) descrito pelo nosso modelo quantitativo.

Estreitamento inspecção do gene dois EMT conjuntos revela que muitos dos genes que conduzem o enriquecimento em fibroblastos da pele (isto é, os principais genes enriquecido) são constituídas pela superfície de células e as moléculas segregadas que têm sido implicados em contribuições do estroma para a progressão do tumor (Figura 6). Por exemplo, metaloproteinases de matriz e catepsinas incluindo MMP-2, MMP-12, e catepsina Z são regulados positivamente no estroma tumoral e promover a proliferação do câncer de células, migração e invasão de degradar membranas basais e expondo sinais migratórios e de crescimento crípticas [30] . A tenascina C é uma proteína matricellular que estimula a proliferação de células do cancro e angiogénese [31]. N-caderina (CDH2) é expressa na filopodia de miofibroblastos que migram para as células malignas do cancro de um modo dependente-beta do factor de crescimento transformador [32]. SPARC (proteína secretada ácido e rico em cisteína) é uma outra proteína da matriz estromal que aumenta a invasão da célula cancerosa e que foi inversamente correlacionada com a sobrevivência em pacientes com câncer pancreático [33], [34]. Estromal PDGFRB regula as pressões de fluidos intersticiais e absorção de droga dentro de tumores [35]. Assim, os mesmos genes que regulam EMT em células cancerosas epiteliais também regulam contribuições funcionais na progressão maligna do estroma tumoral. expressão enriquecida destes genes em fibroblastos da pele sugere pré-programação específica de tecido das populações mesenquimais para a funcionalidade do estroma tumoral.

mapa de calor (à direita) e enredo de enriquecimento (à esquerda) para o gene EMT definir a partir de análise de GSEA de vs. pele fibroblastos de pulmão [26].

os fibroblastos, portanto, apareceu para exibir pelo menos dois efeitos distintos sobre a resposta proliferativa das células cancerosas em co-cultura. Importante, uma

equilíbrio quantitativo

entre estas duas actividades de fibroblastos e a capacidade de resposta geral de células cancerosas para fibroblastos sinais determinada em grande medida a razão de co-cultura para uma determinada linha celular de emparelhamento. Estes efeitos de fibroblastos independentes aparentemente pode co-existir dentro de populações de fibroblastos individuais, funcionando tanto cooperativamente ou com objetivos opostos em relação ao crescimento de células cancerígenas. Curiosamente, a análise sugere que ambas as actividades segregar fibroblastos largamente de acordo com a tecido de origem. Além disso, microarrays de perfil indicou que uma destas actividades pode reflectir a expressão diferencial de um programa coordenado transcricional associado a células mesenquimais activados. Os trabalhos irão ser necessários para caracterizar completamente a base molecular de cada atividade de fibroblastos e avaliar a relevância de nossas descobertas à interação câncer de fibroblastos em tumores reais.

Este trabalho foi limitada pela natureza das populações de células examinadas , na medida em linhas celulares de cancro estabelecidos e fibroblastos de tecido normal pode não fenocópia completamente essas populações de células que existem dentro de um tumor humano em evolução. Estudos adicionais com painéis maiores ou mais variados fibroblastos também pode identificar novos e diferentes padrões de atividade. Além disso, estas experiências incluiu apenas 12 linhas celulares de cancro.