Abstract

proteína tirosina quinase-7 (PTK7) é um cataliticamente inativa receptor tirosina quinase (RTK). PTK7 é regulada em muitos cancros humanos comuns, incluindo câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer gástrico e leucemia mielóide aguda. A razão para este aumento da regulação ainda não é conhecido. Para explorar o papel funcional de PTK7, a expressão de PTK7 em células HCT 116 foi examinada utilizando pequena interferência (siARN) silenciamento do gene mediada. A seguir à transfecção, o siRNA suprimida com êxito PTK7 ARNm e a expressão da proteína. Derrubar de PTK7 em células HCT 116 inibiram a proliferação de células em comparação com grupos de controle e apoptose induzida. Além disso, esta apoptose foi caracterizada por uma diminuição potencial de membrana mitocondrial e activação de caspase-9 e -10. A adição de um inibidor da caspase-10 bloqueou totalmente este apoptose, sugerindo que a caspase-10 pode desempenhar um papel crucial na apoptose induzida por PTK7 knockdown, a jusante das mitocôndrias. Estas observações podem indicar um papel para PTK7 na proliferação celular e apoptose celular e podem fornecer uma potencial via terapêutica para o tratamento de uma variedade de cancros

citação:. Meng G, K Sefah, O’Donoghue MB, Zhu L, D Shangguan, Noorali A, et al. (2010) Silenciamento de PTK7 em células cancerígenas do cólon: Caspase-10-dependente apoptose via mitocondrial Caminho. PLoS ONE 5 (11): e14018. doi: 10.1371 /journal.pone.0014018

editor: Zhongjun Zhou, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 12 Julho, 2010; Aceito: 28 de outubro de 2010; Publicação: 16 de novembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Meng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH), Agência # R01GM066137 (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as tirosina quinases receptoras (RTKs) compor uma classe de proteínas transmembranares de sinalização, que transmitem sinais extracelulares para o interior da célula. A desregulação das RTK desempenha um papel importante no desenvolvimento e /ou a progressão de muitas formas de cancro [1]. proteína tirosina-cinase-7 (PTK7), que também é conhecido como o carcinoma do cólon quinase-4 (CCK4), é um membro estudado relativamente nova e pouco da superfamília RTK. Ele contém um domínio extracelular com sete voltas semelhantes a imunoglobulina, um domínio transmembranar, e um domínio de tirosina-quinase cataliticamente inactivo [2], [3]. No entanto, como resultado de uma substituição de aminoácido dentro do domínio catalítico, PTK7 é um pseudokinase sem actividade de tirosina-cinase catalítico detectável [1], [4]. Foi inicialmente identificada como uma linha celular derivada de cancro do cólon expresso do gene, mas que não é expressa em tecidos de adulto do cólon humano [2]. Em contraste, os níveis elevados de expressão de PTK7 são vistas em dois pontos fetais de rato [1], [2], [4]. A expressão de PTK7 é regulado para cima em muitos cancros humanos comuns, incluindo câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer gástrico e leucemia mielóide aguda [2], [5], [6], [7], [8], [9] . Recentemente, PTK7 foi identificado como um novo regulador de polaridade celular WNT ou planar não canónicas (PCP) de sinalização [10], [11]. PTK7 também parece desempenhar um papel importante na formação do tubo, a migração, invasão do endotélio e a angiogénese em células HUVEC [12]. No entanto, o papel funcional de PTK7 na proliferação celular e apoptose permanece por esclarecer.

Morte celular

Aptotosis é programado, tipicamente mediada por uma família de cisteína proteases conhecidas como caspases [13]. As caspases são sintetizadas como pró-enzimas inactivas, quer com um comprimento (caspase-8, -9 e -10) ou uma curta (caspase-3, -6 e -7) prodom�io [14], [15]. Estes últimos proteases clivam uma série de proteínas intracelulares essenciais que conduzem à morte das células [16].

Dois principais vias de apoptose foram identificados. A via intrínseca (via mitocôndrias) envolve uma diminuição no potencial de membrana mitocondrial e a libertação de citocromo

C

[17], o qual activa a caspase-9 através da apoptossomo. Em seguida, caspase-9, caspase inicia uma cascata proteolítica que mata as células. A via extrínseca (via do receptor de morte) envolve a superfamília do receptor do factor de necrose tumoral (TNF). Em resposta à ligação do ligando de TNF, estes receptores de membrana recrutar moléculas adaptadoras e activar a caspase-8 na morte induzir sinalização complexo (DISCO). Activado caspase-8 activa seja diretamente caspases efetoras jusante, como a caspase-3, ou se conecta à via intrínseca através da clivagem de BCL-2 Interacting Domínio (Bid) para Bid truncado (tBid) [18].

o gene da caspase-10 está ligado ao gene da caspase-8 no cromossoma 2q33-34 locus de humano [19]. No entanto, as funções fisiológicas de caspase-10 permanecem pouco compreendidos, embora se pense que desempenham um papel na via de receptor de morte. A caspase-10 também foi relatado para ser activado a jusante das mitocôndrias em apoptose induzida por drogas citotóxicas das células tumorais [20]. mutações de inactivação adquiridos de caspase-10 foram identificados em células tumorais de pacientes com tumores sólidos [21], [22], [23]. Recentemente, foi mostrado que a caspase-10 desempenham um papel na apoptose induzida por paclitaxel, um fármaco anti-cancro, através de uma proteína Fas associada à morte de domínio (FADD) mecanismo dependente [24].

A interferência de ARN termo (RNAi) foi usado pela primeira vez pelo fogo

et al.

[25] em seu trabalho em

Caenorhabditis elegans

. ARNi é um mecanismo celular através do qual os pequenos ARN interferentes (siRNAs) (19-23 nucleótidos de comprimento) provocar a degradação do ARNm específica [25], [26]. Tem sido demonstrado que os siRNAs pode silenciar a expressão do gene cognato através da via de RNAi em células de mamíferos [27]. As propriedades de RNAi, incluindo especificidade estrita para o gene alvo e simplicidade de concepção e de ensaio [28], aumentaram grandemente o seu potencial para estudos mecanísticos de proteínas, bem como para abordagens terapêuticas para o tratamento de doenças, incluindo o cancro [29], [30 ].

neste estudo, foi utilizado um siRNA alvejando PTK7 ARNm humano para a inibição máxima da expressão PTK7, a fim de investigar o papel das PTK7 na apoptose e a proliferação. Derrubando PTK7 em células HCT 116 inibiu a proliferação celular e apoptose induzida. Além disso, esta apoptose foi caracterizada por uma diminuição potencial de membrana mitocondrial e activação de caspase-9 e -10. A adição de um inibidor da caspase-10 bloqueou totalmente este apoptose, sugerindo que a caspase-10 pode desempenhar um papel crucial na apoptose induzida por PTK7 knockdown jusante das mitocôndrias. Portanto, estas observações podem indicar um papel para PTK7 na proliferação celular e apoptose celular

Materiais e Métodos

Materiais

meios 5A de McCoy foram adquiridos da ATCC.; soro fetal de bovino (FBS) (inactivado pelo calor) foi adquirido de GIBCO, e penicilina-estreptomicina foi adquirido a Cellgro. Micro-FastTrack kit 2.0 foi adquirida a Invitrogen. Um kit colorimétrico bromodesoxiuridina (BrdU) era da BD Pharmingen. IScript One-Step RT-PCR Kit com SYBR Green foi de Biorad. mistura de inibidores de protease (mistura de 4- (2-aminoetil) fluoreto de benzenossulfonilo (AEBSF), E-64, bestatina, leupeptina, aprotinina, e o EDTA de sódio) e 0,4% de azul tripano foram da Sigma. O kit de ensaio de proteína foi de Bio-Rad. Os anticorpos contra a caspase-9 e β-actina foram de Cell Signaling Technology. Anticorpo contra a caspase-10 era da Millipore. Anticorpo contra PTK7 foi de Abnova. anticorpo secundário anti-IgG de ratinho conjugado com HRP de cabra e anticorpo secundário conjugado com HRP de IgG anti-coelho de cabra foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology. Vybrant Apoptosis Assay Kit # 2, 4 × tampão NuPAGE LDS amostra, 4-12% de gel NuPAGE Bis-Tris, 20 × NuPAGE MOPS SDS tampão de corrida, e 20 × buffer de transferência NuPAGE eram de Invitrogen. membrana de transferência Immobilon-P foi de Millipore. SuperSignal Oeste Dura estendido-Duração do substrato e restauração mais tampão de Western blot de decapagem eram da Thermo Scientific. filmes de raio-X foram de ISCBioExpress. JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’- iodeto tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine) foi adquirido a partir de Anaspec. Caspase-9 inibidor (Z-LEHD-FMK), inibidor da caspase-3 (Z-DEVD-FMK), inibidor de caspase-8 (IETD-Z-FMK), inibidor da caspase-família (Z-VAD-FMK), caspase um inibidor de (Z-YVAD-FMK), caspase-10, inibidor (Z-AEVD-FMK) e caspase-2 inibidor (Z-VDVAD-FMK) foram adquiridos a BioVision. Caspase-10 Fluorométrica Protease Assay Kit foi de Millipore.

Cultura celular

HCT 116 (carcinoma do cólon), as células foram obtidas de ATCC (Manassas, VA) e mantidas em cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO

2. As células HCT 116 p53 foram fornecidos pelo Dr. Bert Vogelstein (O Centro Johns Hopkins Kimmel Cancer). As células foram cultivadas em meio de McCoy 5A suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (inactivado pelo calor) e 100 UI /mL de penicilina-estreptomicina.

ARN interferência

HiPerFect reagente de transfecção, HP- Validado siRNA específico para PTK7, chamado PTK7 siRNA (sentido: 5′-CGGGATGATGTCACTGGAGAA-3 ‘), e um siRNA inespecíficos (AllStars Controlo negativo siARN) foram adquiridos de Qiagen. As células HCT 116 foram transfectadas com ARNsi por reagente de transfecção HiPerFect. No dia 1, as células em fase de crescimento exponencial foram colhidas e suspensas em meio de crescimento. As células foram divididas em quatro grupos e foram tratados apenas com PTK7 siRNA, um siARN inespecífica como controlo negativo, veículo HiPerFect, ou foram deixados sem tratamento. Para cada transfecção, uma suspensão de células de 500 ul foi transfectada com 25 nM de ARNsi utilizando 4 mL de reagente de transfecção em placas de 24 poços. As células foram mantidas em condições de cultura normais e recolheu-2, 3 ou 4 dias após a transfecção para análise.

Análise de citometria de fluxo

Após a transfecção com siRNAs como descritos acima, as células foram tratadas com tripsina, lavadas duas vezes em PBS, e contadas utilizando um hemocitómetro. Alíquotas de 5 × 10

5 as células foram incubadas com excesso de phycoerythring (PE) marcado com anti-PTK7 em 200 uL de tampão de ligação (PBS contendo MgCl 5 mM de

2, 4,5 mg /mL de glucose, 0,1 mg /mL ARNt de levedura, 1 mg /ml BSA e 20% de FBS) em gelo durante 30 min. As células foram então lavadas duas vezes com 1 mL de tampão de ligação e suspensas em 0,3 ml de tampão de ligação. A fluorescência foi determinada com um citómetro FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Sistemas, San Jose, CA). PE-anti-IgG marcado foi usado como um controlo negativo.

RT-PCR quantitativo

ARNm total de células tratadas com várias siRNAs foi extraída com Micro-FastTrack kit de 2,0 de acordo com as instruções do fabricante . PCR em tempo real foi realizada em ARNm (50 ng) com iScript One-Step estojo de RT-PCR utilizando SYBR Green com um Biorad iCycler. Todas as reacções foram realizadas num volume de 50 uL-em triplicado. Primers para PTK7 humana foram adquiridos de Qiagen (QT00015568). parâmetros de PCR foram as seguintes: 50 ° C durante 30 min, 5 min de activação Taq a 95 ° C, seguido por 45 ciclos de PCR: 95 ° C x 30 s, 57 ° C x 60 s, e 72 ° C × 60 s. A quantidade relativa de ARNm alvo foi normalizada para ARNm de GAPDH. A especificidade foi verificada por análise da curva de fusão. As médias e desvios-padrão de pelo menos três repetições de cada experimento são calculados. A significância foi determinada pelo teste t, value≤0.05 ap indicado por um asterisco.

detecção de número de celular por Trypan Blue Exclusão Ensaio

Durante quatro dias após o tratamento, as suspensões de células foram preparadas por tripsinização, e as células foram ressuspensas em 1 ml de meio. Para 25 mL da suspensão celular, 25 pL de 0,4% foi adicionado azul de tripano e as células foram contadas utilizando um hemocitómetro.

Ensaio de Proliferação

A proliferação celular foi estudada utilizando um bromodesoxiuridina colorimétrico (BrdU ) kit de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro, as células foram transfectadas com ARNsi. Após 48 h de tratamento, 10 uM de BrdU solução foi adicionado ao meio. O meio foi descartado depois de 2 h, e as células foram fixadas e permeabilizadas com BD Cytofix Tampão /Cytoperm durante 30 min à temperatura ambiente. Após a remoção do buffer Cytofix /Cytoperm, as células foram incubadas com 100 ul de ADNase diluída (diluída para 300 ug /ml em PBS) durante 1 hora a 37 ° C para expor BrdU incorporada. As células foram então ressuspensas em 50 ul de BD Perm /Wash Buffer contendo diluída marcado com FITC anti-BrdU e incubou-se durante 20 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, as células foram incubadas com 20 uL da solução de 7-AAD. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo. As médias e desvios-padrão de pelo menos três repetições de cada experimento foram calculados. A significância foi determinada pelo teste t; ap value≤0.05 é indicado por um asterisco.

anexina V /iodeto de propídio Double-Coloração Ensaio

anexina V /iodeto de propídio (PI) double-coloração foi realizada utilizando o Invitrogen Vybrant Apoptosis Assay kit # 2. As células foram lavadas duas vezes em tampão PBS gelado e centrifugado a 900 rpm durante 3 min. Os sedimentos foram ressuspensos em tampão de ligação a uma densidade de 10

6 células /ml. Uma solução de amostra (100 mL) foi duplamente coradas com 5 uL Anexina V /Alexa Fluor 488 uL e 2 100 ug /mL de PI. Após incubação à temperatura ambiente durante 15 minutos, 400 ul de tampão de ligação foi adicionado, e as células foram analisadas por citometria de fluxo.

As análises Western blot

Depois de células HCT 116 foram transfectadas com ARNsi para PTK7 12 h, 24 h, 30 h e 48 h, as células inteiras foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS gelado. Em seguida, as células foram lisadas em tampão de radioimunoprecipitação (NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sódio, 0,1% de dodecilsulfato de sódio (SDS), Tris-HCl a 50, pH 7,5, e EDTA 2 mM) na presença de mistura de inibidores de proteinase, durante 20 min em gelo. Os lisados ​​foram centrifugados a 14000 rpm durante 20 min a 4 ° C, e o teor de proteína no sobrenadante foi medida utilizando o ensaio de proteína Bio-Rad. Cinquenta microgramas de proteínas do sobrenadante foram misturados com 4 x tampão de amostra NuPAGE LDS e aqueceu-se a 70 ° C durante 10 min. As proteínas foram separadas em géis de NuPAGE 4-12% Bis-Tris com 1 × NuPAGE MOPS SDS tampão de corrida e então electrotransferidas para uma membrana de transferência de PVDF com tampão de transferência NuPAGE a 50 V durante 1 h. As membranas foram bloqueadas com leite seco sem gordura 5% em tampão de PBS contendo 0,2% de Tween 20 (PBST) durante 2 h à temperatura ambiente. As membranas foram sondadas com anticorpos primários em PBST contendo 5% de leite em pó desnatado durante a noite a 4 ° C. Depois de três lavagens sucessivas com PBST durante 10 minutos, as membranas foram incubadas com anticorpo anti-IgG de ratinho-peroxidase de rábano de cabra conjugado ou anticorpo anti-IgG de coelho de cabra em PBST contendo 5% de leite em pó desnatado durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de três lavagens sucessivas com PBST durante 10 min, os sinais de proteínas foram desenvolvidas com um kit de substrato Duração SuperSignal Oeste Dura prolongado e transferido a partir da membrana a filmes de raio-X. carga de proteína foi normalizada por sondagem da mesma membrana com anticorpo anti-actina. Para a detecção β-actina, as membranas utilizadas anteriormente foram embebidas em Restore Plus Western Blot Tampão de decapagem à temperatura ambiente durante 30 minutos e hibridou-se com a actina anti-β.

Medição da Membrana Mitocondrial Potencial

Corante JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’- iodeto tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine) foi utilizada para determinar o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ

m), a perda do qual é considerado como um passo crucial na via de apoptose. As células HCT 116 foram transfectadas com ARNsi durante 48 h ou 72 h, após o que as células foram lavadas com PBS frio e coradas por incubação com 2 uM JC-1 durante 20 min a 37 ° C. Em seguida, o potencial da membrana mitocondrial foi detectada por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo a 590 nm.

A caspase-10 Actividade Medição

a actividade da caspase-10 foi medida utilizando o Kit de caspase-10 Fluorometic Protease Ensaio . Resumidamente, as células foram transfectadas com ARNsi PTK7, e depois de 24 h ou de 48 h as células foram colhidas. Dois milhões de células foram ressuspensos em tampão de lise arrefecido em gelo e incubadas durante 10 min. Em seguida, 50 ul de 2 x tampão de reacção e 5 mL de 1 mM a AEVD-AFC substrato (50 uM de concentração final) foram adicionados a cada amostra. Após incubação a 37 ° C durante 2 h, as amostras foram analisadas utilizando um leitor de microplacas equipado com um filtro de excitação de 400 nm e um filtro de emissão de 505 nm. As médias e desvios-padrão de pelo menos três repetições de cada experimento foram calculados. A significância foi determinada pelo teste t, value≤0.05 ap é indicado por um asterisco.

Resultados

A inibição da expressão PTK7 por PTK7 siRNA

A expressão de PTK7 no HCT 116 , células de carcinoma do cólon humano, foi investigado por citometria de fluxo (Fig. 1A, não tratado) e Western blot (Fig. 1B, 0 h). Comparando-se o sinal de fluorescência de marcado com PE anti-PTK7 a PE-IgG anti-rato mostra claramente que PTK7 é expresso em células HCT 116.

(A) de citometria de fluxo de ensaio para a ligação da PE-rotulados anti-PTK7 com células HCT 116 (curvas de cinza). As curvas a preto representam a ligação de anti-IgG-PE fundo. A concentração do anticorpo no tampão de ligação foi de 2 mg /mL. (B) Análise de Western blot de PTK7 em 116 células HCT transfectadas por PTK7 siRNAs. A membrana foi despida e sondado pelo anticorpo β-actina como um controlo de carga. (C) A supressão da expressão de ARNm de PTK7 em células HCT 116 por PTK7 ARNsi. As células foram colhidas após 48 horas de tratamento. RT-PCR foi realizada usando iniciadores específicos de gene. A quantidade de expressão de ARNm de PTK7 foi normalizada para o grupo não tratado. Os dados são média ± D.P.. de três experiências independentes. * Teste t de Student:. P 0,05

A expressão de PTK7 foi derrubado usando PTK7-alvo siRNA ea citometria de fluxo resultados para as células-alvo foram comparados com aqueles expostos ao único veículo, siRNA não específico ou não tratado, tal como mostrado na Fig. 1A. Após 48 horas, o pico de anti-PTK7-PE em HCT 116 transfectadas com PTK7 siARN deslocado de volta para o pico da proteína de controlo de fundo, anti-IgG-PE, que indica que o nível de expressão de PTK7 em células HCT 116 transfectadas com PTK7 siRNA diminuiu consideravelmente. Ao mesmo tempo, não houve mudança correspondente em que o siRNA de controlo ou os grupos tratados com veículo, indicando que nem o reagente de transfecção HiPerFect nem a expressão PTK7 siARN inespecífica afectada. Quando a expressão foi sondada PTK7 após 12 h, 24 h, 30 h e 48 h de transfecção utilizando Western blot (Fig. 1B), os resultados mostraram claramente que o nível de expressão de PTK7 diminuiu após 48 horas de transfecção. Além disso, o ARNm total foi extraído a partir do não tratado, veículo, siARN inespecífico, e grupos PTK7 siRNA. Como mostrado na Fig. 1C, PTK7 siARN induziu uma redução de 75-80% de ARNm PTK7 em células HCT 116. Estes resultados indicaram que ambas as proteínas PTK7 e os níveis de expressão de mRNA foram grandemente reduzido pela PTK7 siARN. Isto provou a função e eficiência de PTK7 siRNA e forneceu uma base sólida para o nosso estudo do papel funcional de PTK7.

células HCT 116 viabilidade e proliferação de PTK7 siRNA tratados

O efeito de supressão PTK7 sobre a viabilidade das células HCT 116 foi investigado por contagem do número total de células vivas todos os dias após a transfecção. Como mostrado na Fig. 2A, o número de células vivas 116 HCT transfectadas com ARNsi PTK7 mostrou-se significativamente diferente da dos grupos não tratados no dia 4. Este achado demonstrou uma inibição significativa da viabilidade celular nas células HCT 116 tratadas com siRNA PTK7. Para confirmar que a diminuição de viabilidade celular resultou da supressão de PTK7, os mesmos ensaios foram realizados com células HCT 116 transfectadas com ARNsi não específica ou tratados apenas com veículo. Os resultados mostraram que a amostra tratada com siRNA PTK7 continha o menor número de células. Embora-tratado com veículo e células tratadas com siRNA inespecíficas tinham números de células mais pequenas do que as células não tratadas, não foram significativamente menos células na amostra tratada com siRNA PTK7.

Os dados são média ± D.P.. de três experiências independentes. (A) O número de células vivas foi contado por dia durante 4 dias, utilizando Trypan azul. (B) a incorporação de BrdU em relação às células não tratadas detectados por citometria de fluxo. As células foram incubadas com 10 uM de BrdU durante 2 h depois de 48 h de tratamento. A quantidade de incorporação de BrdU foi normalizada para o grupo não tratado. Os dados são média ± D.P.. de três experiências independentes. * Teste t de Student: P 0,05. (C) ocorrência de apoptose em células HCT 116 detectadas pela coloração de anexina V /PI nos dias 1-4 após a transfecção. As células coradas negativo tanto para anexina V e PI foram considerados saudáveis.

Para determinar o efeito de supressão de PTK7 na proliferação de células HCT 116, um experimento de incorporação de BrdU foi realizada para medir a síntese de DNA. Após 48 horas da transfecção, as células foram semeadas em placas de cultura de 24 cavidades e foram incubadas com 10 uM de BrdU durante 2 h. As células foram então fixadas, e a incorporação de BrdU foi detectada utilizando um anticorpo anti-BrdU marcado com FITC (Fig. 2B). Silenciamento de PTK7 inibiu significativamente incorporação de BrdU em 116 células HCT, sugerindo um efeito direto da proteína PTK7 na proliferação de células HCT 116.

Aumento de apoptose de tratados siRNA PTK7 HCT 116 células

Um anexina V /experimento coloração PI foi realizado para estudar a possibilidade de derrubar PTK7 poderia afetar a apoptose de células HCT 116. A fosfatidilserina (PS) encontra-se no folheto interno da membrana celular em células saudáveis. Durante a apoptose, PS se torna translocado para a superfície externa da membrana celular, e o ensaio de anexina V /PI detecta o PS sobre a superfície externa. Os resultados na Figura 2C mostram que o grupo PTK7 siARN mostrou aumento significativo em células apoptóticas no dia 4 em comparação com o não tratado, veículo, e os grupos de controlo não específicos siARN.

alterações no potencial de membrana mitocondrial e activação de caspase-9 em HCT 116 células tratadas com siRNA PTK7

Para estudar o mecanismo através do qual derrubar PTK7 induz a apoptose em células HCT 116, o efeito de derrubar PTK7 no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ

m) foi determinado por fluorescência microscopia (Fig. 3A) e citometria de fluxo (Fig. 3B). Corante JC-1 foi usado como um indicador. Em células saudáveis, mitocôndrias polarizadas tem uma carga negativa, o que permite JC-1 corante com carga positiva deslocalizados para inserir a matriz mitocondrial e acumulam-se aí. Quando a concentração crítica é excedido, JC-1 forma J-agregados, e as células se tornam vermelho fluorescente (FL2). Em células apoptóticas, potencial de membrana mitocondrial, colapsos e JC-1 não pode acumular-se dentro da mitocôndria. Nestas células apoptóticas, JC-1 permanece no citoplasma numa forma monomérica fluorescente verde (FL1). Após as células HCT 116 foram transfectadas com ARNsi de controlo ou como descrito acima e incubou-se durante 48 h ou 72 h, a redução de ΔΨ

m foi observada em células HCT 116 transfectadas com ARNsi PTK7. Após 72 h de transfeco, a percentagem de células com mitocôndrias polarizada foi de 90%, 87% e 88% para as células do não tratado, de veículo e os grupos de siRNA não específicos, respectivamente. No entanto, apenas 35% do total de células no grupo PTK7 siARN mitocôndrias tinha polarizadas. Esta tendência foi observada até às 48 h, quando apenas 58% das células tinha polarizado mitocôndrias. Estes dados sugerem que a disfunção mitocondrial estava envolvida na apoptose induzida por PTK7 knockdown.

(A) detecção de fluorescência microscópio de potencial de membrana mitocondrial em células HCT 116 tratados. (B) A citometria de fluxo da detecção de potencial de membrana mitocondrial em células HCT 116 tratados. (C) Activação de caspase-9 envolvida na apoptose induzida por derrubar PTK7. A membrana foi despida e sondado pelo anticorpo β-actina, como um controlo de carga.

Uma variedade de vias de sinalização pode estar envolvido em apoptose, e as mitocôndrias desempenham um papel importante. disfunção mitocondrial provoca a libertação de citocromo

c

, que ativa a caspase-9, por sua vez alimenta a apoptose. Caspase-9 activação foi detectado por Western blot após as células HCT 116 foram transfectadas com ARNsi PTK7 e cultivadas durante 12 h, 24 h, 30 h e 48 h, respectivamente. Como mostrado na Figura 3C, caspase-9 foi activado e envolvida na apoptose induzida por PTK7 knockdown.

O papel da caspase-10 na apoptose induzida por

PTK7 knockdown

Para determinar se as caspases mediar a apoptose induzida por batida para baixo de PTK7, as células foram pré-tratadas com um inibidor pancaspase ou um de vários inibidores específicos de single-caspase. Salvamento das células de apoptose significaria que a caspase inibido foi implicada na morte de células PTK7-deficiente. Após a pré-incubação das células HCT 116 com 20 uM de inibidor pancaspase-família a 37 ° C durante 3 h, as células foram transfectadas com ARNsi durante 48 h. Após incubação durante 48 horas, a viabilidade celular foi testada utilizando anexina V /PI (Fig. 4A). As células pré-incubadas com inibidor pancaspase-família mostraram boa viabilidade das células (80 ± 13%) após a transfecção com PTK7 siRNA, dentro da incerteza da viabilidade das células do grupo siRNA não especifica (83 ± 7,5%). Enquanto isso, as células directamente transfectadas com ARNsi PTK7 tinham significativamente inferior a viabilidade das células (36 ± 12%). inibidor Pancaspase familiar bloqueou a atividade da caspase e também bloqueou a apoptose induzida por derrubar de PTK7, indicando que a apoptose induzida por derrubar de PTK7 é dependente de caspase.

(A) A apoptose induzida por derrubar PTK7 foi caspase -dependente. Os dados são média ± D.P.. de três experiências independentes. * Teste t de Student: P 0,05. (B) Caspase-10 inibidor bloqueou totalmente a apoptose induzida por derrubar de PTK7. Dados: média ± D.P.. de três experiências independentes, * Teste t de Student: P 0,05

Para investigar quais caspase desempenha o papel crítico neste apoptose, as células HCT 116 foram pré-tratados com o inibidor de caspase-9 (Z. -LEHD-FMK), inibidor da caspase-3 (Z-DEVD-FMK), inibidor de caspase-8 (IETD-Z-FMK), inibidor da caspase-família (Z-VAD-FMK), inibidor da caspase-1 (Z-YVAD -FMK), caspase-10, inibidor (Z-AEVD-FMK), caspase-2 inibidor (Z-VDVAD-FMK), ou veículo de DMSO a 37 ° C durante 3 h, seguida por transfecção com PTK7 siARN. Após incubação durante 48 horas, a viabilidade celular foi testada por anexina V /PI utilizando citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 4B, a inibição da caspase-10 bloqueou a apoptose, com 79 ± 3% de células viáveis. Isto significava que caspse-10 pode desempenhar um papel crítico na via apoptótica induzida por derrubar de PTK7.

para confirmar a activação de caspase-10 na apoptose induzida por PTK7 knockdown, pro-caspase-10 os níveis de proteína em células Os lisados ​​transfectadas com ARNsi PTK7 foram examinadas utilizando Western blot (Fig. 5A). Procaspase-10 diminuiu depois de 12 horas de transfecção e aumentada após 30 horas de transfecção. Além disso, como a ligação entre a via intrínseca e a via extrínseca, a clivagem de Bid para tBid foi investigada, e não houve tBid óbvio, o que indica que não havia transferência do sinal a partir da via extrínseca da via intrínseca. Numa outra experiência, a expressão PTK7 em HCT 116 foi inicialmente suprimido utilizando PTK7 siRNA, resultando em apoptose nestas células. A capacidade dos lisados ​​celulares para clivar os substratos peptídicos (Ac-AEVD-AFC) foi testado como um indicador da actividade da caspase-10. Os resultados na Figura 5B mostram aumento significativo na atividade da caspase 10 em células tratadas com PTK7 siRNA.

(A) de análise Western blot de pro-caspase-10 e Bid no HCT 116 células transfectadas por PTK7 siRNAs. A membrana foi despida e sondado pelo anticorpo β-actina, como um controlo de carga. (B) a actividade da caspase-10 em células HCT 116: não tratados e tratados com veículo, siARN inespecífica e siRNA. Os resultados foram dados como proporções em relação a actividade de caspase-10 em células não tratadas. Os dados são média ± D.P.. de três experiências independentes. * Teste t de Student:. P 0,05

envolvimento proteína p53 nos PTK7-knockdown induzida por apoptose

A proteína p53 foi provado como uma proteína supressora de tumores em seres humanos [31] , e as células HCT 116 expressar-tipo de largura de p53. [32], [33] a fim de estudar o envolvimento de p53 na apoptose induzida por PTK7 knockdown, p53 nulo HCT 116 foi utilizada como a segunda linha de células para realizar PTK7 knockdown e outros experimentos relacionados. Em primeiro lugar, o nível de expressão de PTK7 sem /com o tratamento com siARN foi monitorizada por citometria de fluxo (Fig. 6A). As células HCT 116 sem p53 expressar uma grande quantidade de PTK7 na membrana celular, mas após 48 horas de PTK7 siARN transfecção, o pico para o anti-PTK7-PE em p53 nulo HCT 116 deslocado de volta para o pico do controlo de fundo proteína, anti-IgG-PE. Isto indicou que o nível de expressão PTK7 em células 116 p53 HCT transfectadas com PTK7 siRNA foi grandemente diminuído. Em seguida, foi mostrado o número de 116 células HCT p53 vivas transfectadas com PTK7 siRNA para ser significativamente diferente da dos grupos não tratados no dia 4, que demonstram uma inibição significativa da viabilidade de células em células 116 sem p53 HCT por tratamento com PTK7 siRNA (Fig. 6B). E numa experiência de incorporação de BrdU, o silenciamento de PTK7 inibiu significativamente a incorporação de BrdU nas células HCT 116 sem p53, sugerindo um efeito directo da proteína PTK7 sobre a proliferação celular (Fig. 6C). Por outro lado, a experiência de coloração de anexina V /PI mostrou que a p53 nulo HCT-tratada siARN PTK7 116 mostraram aumento significativo em células apoptóticas e mortas no dia 4 em comparação com o não tratado, veículo, e os grupos de controlo não específicos siARN.

(a) citometria de fluxo de ensaio para a ligação do anti-PTK7 marcado com PE com HCT 116 células p53 (curvas de cinza). As curvas a preto representam a ligação de anti-IgG-PE fundo. A concentração do anticorpo no tampão de ligação foi de 2 mg /mL. (B) O número de células vivas sem p53 HCT 116 foi contado no dia 4 após o tratamento com o veículo, siRNA inespecíficos e PTK7 siRNA. Os dados são média ± D.P.. de três experiências independentes. * Teste t de Student: P 0,05. (C) a incorporação de BrdU em relação às células não tratadas detectados por citometria de fluxo. p53 células HCT 116 foram incubadas com 10 uM de BrdU durante 2 h depois de 48 h de tratamento. A quantidade de incorporação de BrdU foi normalizada para o grupo não tratado. Os dados são média ± D.P.. de três experiências independentes. * Teste t de Student: P 0,05. (D) ocorrência de apoptose em células sem p53 HCT 116 detectadas pela coloração de anexina V /PI no dia 4 após a transfecção. As células coradas negativo tanto para anexina V e PI foram considerados saudáveis ​​e porcentagem foi mostrado na figura.

A apoptose induzida por PTK7 knockdown foi provou ser dependente no tipo selvagem HCT 116 10 caspase. Assim, a via de apoptose no HCT p53 nulo 116 induzida por PTK7 knockdown foi investigado. JC-1 experimento foi monitorizada por microscopia de fluorescência (Fig. 7A) e citometria de fluxo (Fig. 7B). Claramente, o potencial de membrana mitocondrial diminuiu em 116 células sem p53 HCT tratados com PTK7 siARN. Ao mesmo tempo, um inibidor da caspase experiência foi realizada utilizando células HCT 116 sem p53. Como mostrado na Fig.