Abstract

Fundo

A apoptose desempenha um papel central na patogênese da doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), e este processo pode ser regulada por um factor de transcrição mitocondrial (mtTFA). Epigenética está envolvido na regulação e modificação dos genes envolvidos no câncer de pulmão e DPOC. Neste estudo, determinou-se a expressão de mtTFA e seus níveis de metilação nos pacientes com DPOC com câncer de pulmão.

Métodos

Vinte e um pacientes com câncer de pulmão de células escamosas, 11 com DPOC e 10 sem DPOC, pneumonectomia submetidos foram inscritos. O índice apoptótico (IA) das células endoteliais vasculares pulmonares foi analisada pelo ensaio de marcação terminal mediada nick-transferase de desoxiuridina-trifosfato-biotina. A expressão de mRNA e proteína mtTFA foi medido utilizando PCR, imuno-histoquímica e Western-blot. Metilação do

mtTFA

promotor foi detectada usando seqüenciamento bissulfito PCR.

Resultados

Em comparação com o grupo não-DPOC, a AI foi maior, e expressão de mRNA mtTFA e proteína foi menor no grupo DPOC (

P Art 0,001). A expressão da proteína mtTFA foi positivamente correlacionada com FEV

1 /Pré (

r

= 0,892,

P Art 0,001), e negativamente com AI (

r

= -0,749,

P Art 0,001) e índice de fumo (

r

= -0,763,

P Art 0,001). Percentagem de

mtTFA

metilação do promotor nos pacientes com DPOC foi significativamente maior em comparação com os pacientes sem DPOC (

P Art 0,05).

Conclusão

Estes resultados sugerem que a expressão de ARNm e proteína mtTFA é sub-regulada no tecido pulmonar de pacientes com DPOC e cancro do pulmão de células escamosas, e o nível de proteína mtTFA está relacionado com a apoptose de células endoteliais vasculares pulmonares. Aberrante

mtTFA

metilação também podem desempenhar um papel importante na patogênese da DPOC

Citation:. Peng H, Yang M, Chen Z-y, Chen P, Guan C-x, Xiang X-d, et al. (2013) Expressão e metilação de mitocondrial transcrição Factor A em doença pulmonar obstrutiva crônica pacientes com câncer pulmonar. PLoS ONE 8 (12): e82739. doi: 10.1371 /journal.pone.0082739

editor: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, França |

Recebido: 28 Março, 2013; Aceito: 28 de outubro de 2013; Publicação: 18 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Peng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 30.800.503, No. 30.770.931 e No. 81.070.039) e do National Science Foundation Natural da província de Hunan (No. 09JJ3036). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma das doenças crônicas mais comuns. A prevalência global em adultos com mais de 40 anos de idade é estimada como sendo de 10% [1]. Muitos mecanismos, tais como a inflamação crónica, a proteinase /desequilíbrio anti-proteinase, e o stress oxidativo está envolvido na patogénese de COPD [2], e que interagem uns com os outros durante o desenvolvimento da doença. Dados recentes a partir de modelos animais e estudos em humanos [3] – [6] sugere um papel importante para a apoptose endotelial nos processos patológicos da DPOC

Um factor de transcrição mitocondrial (mtTFA, TFAM) é um núcleo codificado. proteína que se liga a montante do promotor da cadeia leve (LSP), e promotor de cadeia pesada (HSP) do DNA mitocondrial (mtDNA). mtTFA promove a transcrição de mtDNA e regula a replicação mtDNA [7]. O rompimento da

gene mtTFA

no resultado de ratos na depleção de mtDNA, perda de transcritos mitocondriais, comprometimento da respiração corrente, apoptose celular, e redução dos polipeptídeos codificados por mtDNA [8], [9]. Por outro lado, a sobre-expressão de mtTFA pode melhorar o declínio no número de cópias do DNA mitocondrial e apoptose em transgénicos (Tg) ratos [10]. Remels et al [11] verificaram que a quantidade de proteína mtTFA foi significativamente menor no músculo quadriceps de pacientes com DPOC de moderada a grave, muito do que nos controlos. Eles também relataram que a quantidade de mRNA mtTFA e proteína foram significativamente menores em pacientes com DPOC caquético em comparação com que em ambos os pacientes não caquéticos e indivíduos de controlo [11]. Estas observações sugerem que a interrupção de mtTFA está associada a anormalidades do músculo esquelético em pacientes com DPOC. No entanto, a expressão de mtTFA no pulmão de pacientes com DPOC não foi estudado e os mecanismos subjacentes não foram elucidados.

Epigenética refere-se a mudanças hereditárias em função do gene que ocorrem por meio de mudanças na estrutura da cromatina sem qualquer alteração na a sequência de ADN. Um dos mecanismos chave epigenética é a metilação do DNA, o que reprime a transcrição do gene, e modifica as histonas nucleares de ADN deficiente no cromossoma. metilação de ADN pode resultar ou na activação ou repressão de genes [12]. Até à data, a maioria das pesquisas nesta área está focada em câncer, desenvolvimento e diferenciação celular. No entanto, há evidências crescentes de que a epigenética também podem desempenhar um papel importante na regulação de genes envolvidos na asma e DPOC [13]. DeMeo et ai descobriram que a metilação do ADN variável está associada a DPOC e a função pulmonar [14]. Eles também descobriram que

Alu Comprar e LINE-1 hipometilação estão associados com menor função pulmonar e /ou deterioração da função pulmonar rápido nos pacientes idosos [15]. Portanto, etiologia epigenética apresenta um novo alvo para o tratamento de asma e DPOC [16].

A fumaça do cigarro é um fator de risco para a DPOC. Numerosos estudos têm mostrado que o fumo podem alterar a metilação de DNA. Um relatório anterior mostrou que houve pelo menos um gene de metilação aberrante em 32 por cento da amostra de escovado brônquico de pessoas com história de tabagismo [17]. Kikuchi et al [18] também encontraram TSLC1 /IGSF4 metilação foi correlacionada com o índice de tabagismo. Fumo de cigarro e o intervalo de tempo de abstinência associados com a metilação do DNA diferencial ao longo do genoma humano [19]. A análise da sequência revelou que há 67 potencial CpG metilação loci entre -2246 pb e 132 pb do humano

mtTFA

promotor, sugerindo que a metilação da citosina pode desempenhar um papel na regulação da expressão mtTFA. Choi et al [20] verificaram as actividades da luciferase de pGL2-hTfam em células HepG2 transfectadas transientemente é suprimida por metilação específico do local. Este

in vitro

estudo demonstrou que a metilação do fator respiratório nuclear 1 (NRF-1) região de ligação inibiu fortemente a actividade da

mtTFA

promotor em células HepG2 transfectadas transitoriamente.

no presente estudo, testamos a hipótese de que as mudanças na expressão de mtTFA e aberrante

mtTFA

metilação pode desempenhar um papel importante na patogênese da DPOC.

Materiais e Métodos

Declaração de ética

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional da segunda Hospital Xiangya do Centro-Sul da Universidade e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes da sua inscrição no estudo.

Os pacientes e suas informações

gerais

A população do estudo consistiu de 11 pacientes escamosas do câncer de pulmão de células (fase II) com DPOC e 10 pacientes com câncer de pulmão de células escamosas (fase II) sem DPOC que foram submetidos a pneumonectomia. O tecido de pulmão de 5 cm de distância da margem do tumor foi usado nos nossos estudos. Todos os pacientes com DPOC sofria de limitação do fluxo aéreo crônica, definida como uma pós-broncodilatador volume expiratório forçado no primeiro segundo sobre a capacidade vital forçada (FEV

1 /CVF) é 70%, na ausência de causas alternativas. Todos os pacientes não tinham recebido transplante de pulmão, radioterapia, quimioterapia ou terapia corticosteróide inalado. Os indivíduos inscritos não têm quaisquer outras condições médicas confoundable tais como gastrointestinal, renal, endócrino, doenças metabólicas e inflamatórias. FEV

1 e CVF foram avaliados a partir da curva fluxo-volume obtido através de um espirômetro (Sensormedics Autobox-6200D, EUA). parâmetros da função pulmonar foram expressas como uma percentagem de valores de referência. As características gerais dos pacientes estão apresentados na tabela 1. Não houve diferenças na idade ou sexo entre os dois grupos (

P Art 0,05). Em comparação com o grupo não-DPOC, o índice de fumar do grupo de DPOC foi significativamente maior (

P

0,001), enquanto que tanto VEF

1 /Pré (%) (percentagem de VEF

1 real de FEV

1 predicado) e FEV

1 /CVF (%) foi menor no grupo DPOC (

P Restaurant . 0.001)

Methods seções

Os estudos histológicos.

parafina embutido de tecido do pulmão humano foram desparafinados e reidratadas com xileno e etanol. As secções foram brevemente lavadas, coradas em solução de hematoxilina de Harris durante 5 a 10 minutos, diferenciadas em álcool ácido 1% durante 30 segundos, e depois lavou-se. As secções foram então contrastadas em solução eosina-Floxina por 30 segundos a 1 minuto, desidratadas com álcool 95% e 2 mudanças de álcool absoluto por 5 minutos cada, apuradas em 2 mudanças de xileno 5 minutos cada, e montado com xileno meio de montagem com base . A histologia foi avaliada por um patologista de uma forma cega. Como enfisema é uma doença caracterizada pela destruição estrutural das paredes alveolares e alargamento dos espaços alveolares, alargamento dos espaços alveolares foi avaliada por quantificação da intercepção linear média (MLI) e a destruição das paredes alveolares medindo o índice destrutiva (DI). A MLI, uma medida de distância inter-parede alveolar, foi determinada por microscopia de luz, com uma ampliação total de 100 ×. Os campos que incluíram grandes vias aéreas ou vasos foram excluídos da análise. A MLI foi definida como o comprimento total da linha transversal dividido pelo número de paredes alveolares que se intersectam as linhas de teste, como descrito por Xu et al [21]. O Dl foi calculado como uma medida de destruição do parênquima usando uma técnica de ponto de contagem microscópica [22]. A análise foi realizada em duplicado pela contagem aleatoriamente mais de 3.000 alvéolos de 50 seções se ele, de cada paciente com uma ampliação de 200 ×.

Medição de apoptose.

Terminal desoxinucleotidiltransferase-Mediated dUTP Nick End rotulagem (TUNEL) ensaio foi utilizado para medir a apoptose de células endoteliais nos pulmões de pacientes com DPOC. crióstato secções de tecido de pulmão foram fixadas em paraformaldeído a 1% em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. TUNEL foi realizado com o

In Situ

Cell Death Detection Kit-POD (Roche). células positivas e negativas TUNEL sobre toda a secção foram contadas por um patologista de uma forma cega, e o índice apoptótico foi calculada como o número de células de células endoteliais positivas TUNEL /inteiros endoteliais.

Inverter Cadeia da Polimerase-Transcriptase A reacção (RT-PCR).

O ARN total foi extraído utilizando Trizol Reagente de um-passo método de extracção (Invitrogen, EUA). A concentração de RNA foi determinada utilizando um espectrofotómetro e a qualidade foi verificada por electroforese em gel de agarose. ARN (2 mg por amostra) foi transcrito de forma reversa para fazer o DNA complementar (cDNA) de acordo com as instruções do fabricante (kit RT, Fermentas, USA). O ADNc foi amplificado por PCR utilizando polimerase de DNA Taq Platinum (Invitrogen, Breda, Holanda) num aparelho termociclador (Applied B PE4500, EUA). condições de ciclos térmicos foram concebidos como se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 5 min, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 30 seg e 55 ° C durante 45 seg, e um passo de extensão de 5 min a 72 ° C. Os pares de iniciadores utilizados para a PCR foram como se segue: 5′-TATCAAGATGCTTATAGGGC-3 ‘e 5′-ACTCCTCAGCACCATATTTT-3′ para mtTFA (amplicão tamanho esperado: 441 pb); 5’-ACCCACACTGTGCCCATCTAC-3 ‘e 5′-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3’ para β-actina (amplicão esperado tamanho: 103 pb). nível de transcrição do gene constitutivo de limpeza β-actina foi medido quantitativamente como um controle de carregamento RNA. A expressão de genes foi quantificada e expressa em unidades arbitrárias (UA).

em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR).

ARN isolado foi transcrito de forma inversa para ADNc por RT-PCR. O ADNc foi amplificado por PCR utilizando polimerase de DNA Taq Platinum (Invitrogen, Breda, Países Baixos) em um aparelho de Bio-Rad iCycler (Bio-Rad, EUA). condições de ciclos térmicos foram concebidos como se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 10 seg e 57 ° C durante 20 seg, e um passo de extensão de 5 min a 72 ° C. Os pares de iniciadores utilizados para a PCR foram como se segue: 5′-GAACAACTACCCATATTTAAAGCTCA-3 ‘e 5′-GAATCAGGAAGTTCCCTCCA-3′ para mtTFA; 5’-CCAACCGCGAGAAGATGA-3 ‘e 5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3’ para β-actina. tamanhos fragmento amplificado esperado foram de 95 pb e 97 pb. A especificidade da amplificação foi verificada por análise de curva de fusão e de avaliação da eficiência da amplificação por PCR. níveis de transcrição do gene constitutivo de limpeza produtos β-actina foram quantitativamente medida para o controle do carregamento. mudanças relativas em abundância transcrição foram expressos como Sc

valores T (

T = Sc

referência T -ΔC

T-alvo Sc), onde higherΔC

valores de T indicam abundância de transcritos mais elevados.

análise de Western blot.

um total de 40 ug de proteína de cada amostra foi separada em gel de poliacrilamida-SDS a 12% e electrotransferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno. A membrana foi bloqueada com 5% de leite em pó magro em PBS contendo 0,05% de Tween (PBST), durante 1 hora. Após lavagem com PBST, a membrana foi incubada com um anticorpo monoclonal de coelho anticorpo mtTFA (1:100; Abcam, EUA) durante a noite a 4 ° C. A membrana foi lavada quatro vezes e incubadas com peroxidase de rábano -conjugated anticorpo secundário (anti-coelho, 1:10,000; Santa Cruz, CA) durante 1 hora. O filme foi desenvolvido por aprimorado sistema de detecção de quimioluminescência (ECL, BestBio Pharmacia Biotech). Os níveis do produto do gene constitutivo de arrumação β-actina foram também medidas como controlo de carregamento. A expressão da proteína foi quantificada e expressa em unidades arbitrárias (UA).

imuno-histoquímica.

Seções de tecido de pulmão humano

parafina-embedded foram desparafinados e reidratadas com xileno e etanol. A recuperação de antígenos foi realizada usando o método de micro-ondas com tampão citrato, durante 20 minutos. bloco de avidina e biotina foi realizada, e a peroxidase endógena foi extinta com peróxido de hidrogénio a 3%. Após bloqueio com soro de cabra normal a 5%, foi aplicado um anticorpo de coelho anti-humano mtTFA (1:100) (Abcam, EUA) durante a noite a 4 ° C. As secções foram lavadas com PBS com 0,05% de Tween e incubado com anti-coelho biotinilado de cabra IgG (1:10,000; Santa Cruz, CA). Após a lavagem, as secções foram coradas com reagentes ABC Vectastatin (Wuhan Boster Biological Technology Corporation, Ltd) e DAB (Beijing Zhong Shan-Golden Bridge Biological Technology Corporation). As secções foram então marcado por um patologista de forma cega (número de células endoteliais mtTFA-positivas /100 células endoteliais por caso) para a coloração mtTFA em capilares, artérias pequenos /médios.

Bissulfito Sequencing PCR (BSP).

o ADN genómico foi isolado a partir do tecido pulmonar usando o kit de isolamento de ADN DNeasy (Qiagen, Valencia, CA), seguido por digestão com EcoRI. modificação bissulfito de ADN genómico foi realizada utilizando o kit de ADN-ouro EZ metilação (Zymo Research Corporation, Orange, CA) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, 1 ug de ADN purificado (20 ul) foi incubado em 130 ul de TC Conversão reagente a 98 ° C durante 10 min e 64 ° C durante 2,5 h, resultando em conversão de citosinas não metiladas em uracilo. Depois da purificação do ADN, o ADN modificado com bissulfito foi amplificado utilizando PCR. Os iniciadores foram concebidos utilizando o programa em linha MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/): iniciadores de PCR, 5′-TATTAGAATTTGTTAAATTTTGGGGAAT-3 ‘e 5′-ACAAACAATCCTACATCCAAAACC-3’. As condições de PCR foram as seguintes: 3 min a 94 ° C; 35 ciclos de 30 seg a 94 ° C, 30 seg a 56 ° C, e 40 seg a 72 ° C; e um passo de extensão de 5 min a 7 ° C. Os produtos de PCR foram purificados usando electroforese em géis de 1% de agarose (QIAquick kit de extracção de gel; Qiagen), recuperado ou utilizando precipitação com etanol, e, em seguida, clonado utilizando ligadura em pCR 2.1-TOPO vectores de clonagem com um kit de clonagem TA (Takara, EUA), seguido usando as bactérias competentes DH5a (laboratório chave Humano of Medical Epigenomics, o segundo hospital Xiangya, Universidade Centro-Sul). O DNA de plasmídeo isolado a partir de pelo menos cinco clones para cada produto de reacção de PCR foram sujeitos a análise da sequência de ADN no Shanghai Biotecnológica Companhia. Em comparação com a sequência genómica originais DNA mtTFA, a metilação de CpG foi determinada como aparecendo citosinas não convertidos nos locais de CpG no DNA modificado com bissulfito.

A análise estatística.

A análise estatística foi realizada com SPSS versão 13.0. Os dados foram apresentados como média ± SD. teste T comparação da diferença entre os grupos. análise de correlação linear foi conduzida usando Pearson correlação do momento do produto. foram consideradas estatisticamente significativas diferenças se

P Art .. 0,05

Resultados

A análise histológica dos tecidos pulmonares

A alteração patológica do tecido pulmonar

Houve diferenças patológicas significativas entre o grupo sem DPOC e o grupo DPOC. A morfologia do tecido pulmonar normal no grupo de não-DPOC. septos alveolares estavam intactos e havia pouca infiltração de células inflamatórias (Figura 1A). Mas no grupo DPOC, havia infiltrado inflamatório severo, tanto das vias aéreas e alvéolos. Como mostrado na Figura 1B, defluxion cílio e proliferação de células caliciformes foram observados nas vias aéreas, entretanto destruição e rarefacção foram detectados em alvéolos de pacientes com DPOC. Em comparação com o grupo não-DPOC, a MLI e DI foram significativamente maiores no grupo DPOC (MLI:. 70 ± 23 mm

vs

43 ± 6 mm,

P Art 0,001; DI: 55 ± 4%

vs

16 ± 3%,

P Art 0,001)

as microfotografias do tecido pulmonar do grupo sem DPOC (painel.. a) e o grupo de DPOC (painel B) (ampliação: 100 ×). A intercepção linear média (MLI) eo índice destrutiva (DI) no grupo DPOC foram significativamente maiores em comparação com o grupo não-DPOC (

P

0,001).

as alterações patológicas da vasculatura pulmonar.

A morfologia da vasculatura pulmonar entre os grupos não-portadores de DPOC e DPOC foi diferente. A vasculatura pulmonar era normal e havia pouca infiltração de células inflamatórias no grupo não-DPOC (Figura 2A). No entanto, no grupo de DPOC, as paredes dos vasos eram muito mais espessas, especialmente na camada de músculo liso. O lúmen foi reduzida em consequência do aumento da espessura da parede vascular no grupo DPOC (Figura 2B).

As fotomicrografias de vasos pulmonares a partir da não-DPOC (painel A) e o grupo DPOC (painel B) (ampliação: 100 ×). A apresentação histológico da vasculatura pulmonar entre o grupo de grupo DPOC e não a DPOC foi diferente.

O vascular pulmonar apoptose endotelial

A apoptose de células endoteliais vasculares pulmonares na não-DPOC e grupos DPOC foi analisada pelo ensaio de TUNEL. As células positivas apoptóticos foram coradas em marrom amarelo no ensaio de TUNEL. O índice de apoptose de células endoteliais vasculares pulmonares no grupo DPOC era muito maior do que no grupo sem DPOC (

P Art 0,001). (Figura 3 e Tabela 2)

A células positivas foram coradas em marrom amarelo por ensaio TUNEL. Fotomicrografias de TUNEL coradas tecido pulmonar do grupo não-DPOC (painel A) e o grupo de DPOC (painel B) (ampliação: 400 ×). O número de células pulmonares TUNEL positivas endoteliais vasculares no grupo DPOC foi muito maior do que no grupo sem DPOC.

A expressão de mRNA mtTFA e proteína no tecido pulmonar de não-DPOC e pacientes com DPOC

o tecido pulmonar

mtTFA

mRNA detectado por RT-PCR e qRT-PCR.

Foi analisada a expressão de

mtTFA

mRNA no pulmão tecidos por semi-quantitativo de RT-PCR. eletroforese em gel de agarose mostrou expressão de

mtTFA

mRNA no tecido pulmonar de pacientes com DPOC foi menor quando comparada com a dos pacientes não-portadores de DPOC (Figura 4A). Além disso, a expressão de

mtTFA

ARNm no tecido do pulmão foi também determinada por qRT-PCR. A quantidade relativa de

mtTFA

expressão de mRNA nos pacientes com DPOC foi menor do que nos pacientes não-portadores de DPOC (grupo DPOC: 0,59 ± 0,07

vs

non grupo DPOC:. 0,78 ± 0,09,

P

. 0,001) (Figura 4B)

a expressão do pulmonar

mtTFA

mRNA medido por RT-PCR (painel a). Linha 1, 2 e 3 foram as pacientes não-portadores de DPOC e linha 4, 5 e 6 foram os pacientes com DPOC. O nível de ARNm mtTFA em tecidos de pulmão a partir do grupo DPOC foi inferior em comparação com o grupo não-DPOC. Expressão da pulmonar

mtTFA

ARNm medido por qRT-PCR (painel B). Os diagramas de caixa exibir o intervalo e distribuição de dados com os superiores, quartis mais baixos, ea mediana da diferença máxima de

mtTFA

mRNA no grupo não-DPOC e o grupo DPOC. A mediana para cada conjunto de dados também é indicada pela linha central. A expressão da proteína mtTFA (painel C): Linha 1 e 2 foram os pacientes não-portadores de DPOC e da linha 4 e 5 foram os pacientes com DPOC. A análise quantitativa da densidade de proteína também é mostrado (painel D).

A expressão da proteína mtTFA do tecido pulmonar em pacientes não-portadores de DPOC e DPOC.

Nós expressão próxima medida mtTFA da proteína no tecido pulmonar por mancha de Western. A expressão relativa de proteína mtTFA no grupo DPOC foi menor do que no grupo sem DPOC (COPD: 0,32 ± 0,07

vs

não DPOC:. 0,55 ± 0,09,

P Art 0,001) (Figura 4C 4D). Para caracterizar ainda mais a localização da proteína mtTFA pulmonar, foi realizada coloração imuno-histoquímica em secções de tecido de pulmão utilizando um anticorpo específico para mtTFA. mtTFA proteína foi localizada principalmente nas células endoteliais dos vasos sanguíneos, e consistente com o resultado de Western blot, a sua expressão foi mais baixa no grupo de DPOC em comparação com o grupo não-DPOC (Figura 5).

a expressão da proteína de mtTFA o grupo não-DPOC (painel a) e o grupo de DPOC (painel B) (ampliação: 400 ×). proteína mtTFA era castanho amarelo na coloração DAB. Quando comparado com o grupo não-DPOC, a expressão da proteína mtTFA foi menor no grupo DPOC.

O estado de metilação de

mtTFA

promotor no tecido pulmonar de não DPOC

vs

. pacientes com DPOC

Foi determinada ainda mais o status de

mtTFA

metilação do promotor no tecido pulmonar a partir da não-DPOC e DPOC paciente por meio de análise BSP e sequência de ADN. O

mtTFA

padrão de metilação do promotor de tecidos pulmonares de pacientes com DPOC e não-DPOC são mostrados na Figura 6A e 6B. A percentagem de

mtTFA

metilação do promotor (%) em pacientes com DPOC foi maior em comparação com pacientes não-portadores de DPOC (DPOC:. 38,6 ± 14,7

vs

não DPOC 27,8 ± 8,8;

P Art .. 0,05) (Figura 7)

o modelo de mtTFA metilação do grupo sem DPOC (painel a) e o grupo DPOC (painel B)

os diagramas de caixa exibir os extremos, os quartis superiores e inferiores, e a mediana da diferença máxima entre os grupos não-portadores de DPOC e DPOC. A mediana para cada conjunto de dados é indicado pela linha central,

valor P

da porcentagem de metilação do

mtTFA

promotor foi de 0,013 entre o não-DPOC e o grupo DPOC.

A análise de correlação

A análise de correlação de apoptose de células endoteliais com função pulmonar e índice de fumar.

O índice de apoptose de células endoteliais foi negativamente correlacionada com FEV

1 /CVF (

r

= -0,796,

P

0.001) e FEV

1 /Pré (

r

= -0,827,

P

0,001) (Figura 8A 8B) e correlacionou positivamente com o índice de tabagismo (

r

= 0,703,

P

0,001) (Figura 8C)

O gráfico de dispersão da análise de correlação de endotelial. índice de apoptose celular e FEV

1 /CVF (

r

= -0,796,

P Art 0,001) (painel A). A dispersão da análise de correlação do índice de apoptose de células endoteliais e FEV

1 /Pré (

r

= -0,827,

P Art 0,001) (painel B). A dispersão da análise de correlação do índice de apoptose de células endoteliais e índice de tabagismo (

r

= 0,703,

P Art 0,001). (Painel C)

O análise de correlação de proteína mtTFA tecido pulmonar e FEV

1 /Pre, índice de tabagismo, índice de apoptose de células endoteliais.

a expressão da proteína mtTFA do tecido pulmonar foi positivamente correlacionada com FEV

1 /Pré (

r

= 0,892,

P

0,001) (Figura 9A), correlacionada negativamente com o índice de apoptose de células endoteliais vasculares (

r

= -0,749,

P

0,001) e índice de tabagismo (

r

= -0,763,

P

0,001) (Figura 9B . 9C)

O gráfico de dispersão da análise de correlação de pulmão proteína mtTFA tecidos e FEV

1 /Pré (

r

= 0,892,

P Art 0,001) (painel A). A dispersão da análise de correlação de proteína mtTFA tecido pulmonar e endoteliais índice apoptótico (

r

= -0,749,

P Art 0,001) (painel B). A dispersão da análise de correlação de proteína mtTFA tecido pulmonar e índice de tabagismo (

r

= -0,763,

P Art 0,001). (Painel C)

discussão

neste estudo verificou-se que o índice de apoptose de células endoteliais vasculares em pacientes com DPOC foi muito maior em comparação com pacientes não-portadores de DPOC, e foi negativamente correlacionada com FEV

1 /Pre, mas positivamente correlacionada com o índice de tabagismo. Nós demonstramos que 1) a expressão de mRNA e proteína mtTFA foi menor no tecido pulmonar de pacientes com DPOC com cancro do pulmão escamosas, em comparação com pacientes com câncer de pulmão escamosas sem DPOC; 2) a expressão de mTFA foi positivamente correlacionada com o índice de apoptose de células endoteliais vasculares; 3), mas foi negativamente correlacionada com o índice de tabagismo. Descobrimos também que a percentagem de

mtTFA

metilação do promotor foi maior no grupo de DPOC em relação ao grupo não DPOC.

A DPOC é uma das principais causas de morbidade e mortalidade crônicas em todo o mundo, e tem causou um encargo económico e social substancial [23]. Vários mecanismos estão envolvidos na patogênese da doença. Eles incluem: 1) infiltrado inflamatório; 2) o desequilíbrio entre proteolitica e actividade anti-proteolítica; 3) estresse oxidativo; e 4) desequilíbrio apoptose /proliferação [3]. Uma das consequências seguintes destes processos é a apoptose celular, um processo complexo e bem regulado que leva a morte celular. A presença de um nível mais elevado de apoptose no pulmão de enfisema humano tem sido relatada [24], [25]. Tem sido proposto que epitelial e endotelial morte celular devido a uma diminuição na taxa de manutenção de célula pode ser responsável pelo desenvolvimento de enfisema. Consistente com esta noção, a DPOC pode ser re-produzidas através da indução de apoptose endotelial pulmonar em modelos animais [26], [27]. Semelhante a estas observações, encontramos um aumento do número de células endoteliais pulmonares apoptóticos em pacientes com DPOC, em comparação com os pacientes não-portadores de DPOC. O índice apoptótico foi positivamente correlacionada com FEV

1 /Pre, FEV

1 /CVF e tabagismo índice [6], [28]. Estes resultados indicam que a apoptose endotelial pulmonar pode desempenhar um papel importante na patogénese da COPD.

mtTFA é um factor importante que regula a biogénese mitocondrial. Ele activa a transcrição e a replicação do mtDNA [29]. Ela desempenha um papel muito importante na regulação da respiração mitocondrial, estresse anti-oxidativo e apoptose celular. estudo anterior por Remels et al [11] sugeriram que mtTFA pode ser envolvido na patogénese da COPD. Descobrimos que a expressão de ARNm e proteína mtTFA foi diminuída nos tecidos pulmonares de pacientes com DPOC, em comparação com pacientes não-DPOC. A expressão de mtTFA foi positivamente correlacionada com FEV

1 /Pré e FEV

1 /CVF, e negativamente correlacionados com o índice de tabagismo e índice de apoptose de células endoteliais vasculares. Consistente com as observações anteriores, os nossos resultados também sugerem um papel de mtTFA na apoptose de células endoteliais pulmonares e na patogénese da COPD. No entanto, os mecanismos subjacentes responsáveis ​​por isso são mal compreendidos. Existem evidências de que epigenética pode desempenhar um papel importante na patogénese de algumas doenças respiratórias, tais como asma e DPOC [13]. Curiosamente, descobrimos que a percentagem de

mtTFA

metilação do promotor no tecido pulmonar dos pacientes com câncer de pulmão de células escamosas com DPOC é muito maior em comparação com pacientes com câncer de pulmão de células escamosas sem DPOC, sugerindo regulação epigenética pode ser responsável por a expressão de mtTFA.

DPOC e câncer de pulmão são os dois principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Eles compartilham um risco ambiental comum na exposição à fumaça de cigarro e uma predisposição genética. O risco de câncer de pulmão em pacientes com DPOC tem sido sugerido por mais de 30 anos [30], e, embora a exposição ao tabaco permanece como uma importante variável de confusão, uma associação independente provavelmente existe. Punturieri et al [31] sugeriu que o câncer de pulmão e DPOC pode ser dois lados da mesma moeda. Porque a metilação do DNA, a desacetilação das histonas, e a fosforilação da proteína estão envolvidas na patogénese de cancro do pulmão [32] – [34], sugere-se que as modificações epigenética também pode atribuir à patogénese de COPD, quer isoladamente ou quando associada com cancro do pulmão [ ,,,0],35], [36]. Demeo et al [14] descobriu que o estado de metilação do DNA em distintos loci CpG foi associada tanto com a presença e gravidade da DPOC e função pulmonar, sugerindo que a metilação do DNA pode ser um biomarcador da DPOC e pode destacar novos caminhos da patogênese da DPOC.

metilação aberrante da região promotora de oncogenes e genes supressores de tumor tem um papel importante na patogénese do cancro do pulmão e o estado de metilação está intimamente relacionado com o tabagismo [37], [38]. Há muitas substâncias cancerígenas na fumaça do tabaco. Além disso, o fumo do tabaco é um irritante da mucosa que induz inflamação, resultando na geração de radicais livres de oxigénio. Além disso, o fumo aumenta a actividade de DNA metiltransferase [39], que conduz o

de novo

hipermetilação de loci sensíveis [40]. Essas interações diretas ou indiretas poderiam estar envolvidos na metilação do DNA reforçada em fumantes pesados. Dois estudos recentes relataram alterações moleculares no escarro espontâneo de livre-câncer fumantes pesados ​​[41], [42]. Athough há diferentes opiniões sobre o efeito de fumaça na metilação do DNA [43] – [45].