Abstract
Fundo
O objetivo deste estudo foi avaliar a função biológica na progressão tumoral e moléculas de adesão celular relacionados com antígeno carcinoembrionário processo metastático (CEACAM) 1, 5 e 6 no pâncreas adenocarcinoma (PDAC).
Experimental design by
CEACAM derrubar células foram estabelecidas e avaliadas in vitro e em um rato modelo de xenoenxerto subcutâneo e intraperitoneal. Tecido e soro expressão de pacientes com PDAC foram avaliados por imuno-histoquímica (IHQ) e por ensaios de imunoabsorção de enzima ligada.
Resultados
A presença de metástase ganglionar foi correlacionada com CEACAM 5 e 6 de expressão (determinado por IHC) e recorrência do tumor exclusivamente com CEACAM 6. pacientes com CEACAM 5 e 6 a expressão mostrou um sistema operacional significativamente reduzido em Kaplan-Meier sobrevivência. Os valores séricos elevados CEACAM6 mostrou uma correlação com metástases à distância e. A análise de sobrevida revelou um OS prolongado para pacientes com valores CEACAM 1 séricos baixos. Na proliferação e migração capacidade vitro foi aumentada em CEACAM derrubar células PDAC, no entanto, camundongos inoculados com CEACAM derrubar células mostrou uma prolongada-a sobrevida global (OS). O número de metástases pulmonares espontânea foi aumentada no grupo de derrubar CEACAM.
Conclusão
Os efeitos mediados por expressão CEACAM no PDAC são complexos, embora a sobre-expressão está correlacionada com o crescimento do tumor agressivo loco-regional . No entanto, a perda de CEACAM pode ser considerada como uma parte da transição epitelial-mesenquimal e é, por conseguinte, em vez de importância no processo de metástase distante
citação:. Gebauer F, Wicklein D, J Horst, Sundermann P, Maar H, Streichert T, et al. (2014) Cell Carcinoembrionário Antigen-relacionadas Moléculas de Adesão (CEACAM) 1, 5 e 6 como Biomarkers no cancro do pâncreas. PLoS ONE 9 (11): e113023. doi: 10.1371 /journal.pone.0113023
editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América
Recebido: 22 de julho de 2014; Aceito: 20 de outubro de 2014; Publicação: 19 de novembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Gebauer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:.. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores declaram que não existem interesses conflitantes
Introdução
Nos últimos anos, o prognóstico de pacientes sofrendo de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) não melhorou significativamente [1], [2]. A maioria dos pacientes apresentam estágios tumorais avançados que fazem tratamento curativo impossível. A ressecção cirúrgica completa, seguida por quimioterapia adjuvante é hoje o padrão-ouro na terapia de PDAC. No entanto, mesmo em pacientes após a ressecção do tumor cirúrgica completa, a sobrevida global continua pobre, com um tempo médio de sobrevivência de 20-24 meses [3] – [5]. crescimento do tumor locorregional agressivo em adição à metástase distante e peritoneal precoce e um elevado grau de quimioresistência fazer PDAC um dos tumores gastrointestinais, mais letais [6].
Hoje em dia, nem soro nem fiável marcadores de tecido predizer o clínico curso de pacientes após o diagnóstico de PDAC estão disponíveis. Além disso, as interacções moleculares do tumor com o hospedeiro e os factores locais que permitem PDAC para exibir uma progressão tão agressiva são mal compreendidos. Por conseguinte, existe uma necessidade imperiosa para uma melhor compreensão da biologia do tumor em relação aos mecanismos de invasão local do tumor e a recorrência.
Carcioembryonic moléculas de adesão célula-antigénio relacionado (CEACAMs) são membros da glicosilfosfatidilinositol (GPI ) -linked imunoglobulina (Ig) superfamília [7]. Há mais de 17 genes que pertencem a esta família, com os seus produtos de genes integrados, principalmente na membrana celular. Dentro da família CEACAM os subtipos CEACAM são estruturalmente semelhantes e fisiologicamente expressas na superfície apical dos numerosos tipos de células, por exemplo células endoteliais e hematopoiéticas, bem como células epiteliais de diferentes órgãos. Dependendo do tipo de célula e CEACAM subtipo, o efeito transmitidos após a ligação de um determinado parceiro varia, incluindo a regulação da adesão de células, a supressão de tumor, angiogénese, activação de leucócitos e de outras células imuno-reactivo, e a regulação do ciclo celular [8] – [11]. O gene CEACAM 5, o seu produto, também conhecida como códigos CD66e para o antigénio carcioembryonic (CEA) e tornou-se um dos membros mais conhecidos da Ig-superfamília uma vez que tem um papel significativo na rotina clínica como um marcador tumoral de vários entidades tumorais, incluindo gastrointestinais e doenças malignas respiratórias [12]. No entanto, devido à falta de sensibilidade e especificidade do seu valor preditivo sozinho é ainda insatisfatória [13] – [16]. Os subtipos CEACAM 1 e 6 são descritos para ser sub ou sobre-expressos em diversas entidades tumorais como câncer de pulmão, câncer de cólon e melanoma [17] – [23]. Embora a superexpressão é amplamente observado, alguns estudos até mesmo relatar uma expressão diminuída em certas entidades tumorais em estágios diferentes de tumor.
Curiosamente, estudos recentes descobriram CEACAM 1 e 6 de expressão em PDAC primária correlacionada com uma sobrevida do paciente geral encurtado [24 ], [25]. Os princípios biológicos por expressão CEACAM medeia a progressão do tumor não são completamente compreendidos. Nós, portanto, analisou os efeitos da CEACAM 1, 5 e 6 in vitro e estabeleceu um modelo de rato de xenotransplante para investigar o papel funcional de expressão CEACAM no PDAC. Para avaliar se a expressão CEACAM tem um impacto sobre a progressão do tumor em pacientes, nós combinados de soro e a análise imuno-histoquímica para moléculas CEACAM 1, 5 e 6 para analisar se existe uma correlação de expressão CECACM com dados clinico-pathologcial de pacientes com PDAC.
material e Métodos
linha celular e CEACAM derrubar
A linha de células de adenocarcinoma pancreático humano PaCa 5061 foi criada a partir de um tumor primário. características detalhadas do estabelecimento e da cultura da linha de células foram previamente descritos [26]. Resumidamente, as células foram obtidas de um paciente com um PDAC que foram submetidos a ressecção cirúrgica no Departamento de Geral, visceral e Cirurgia Torácica da Universidade Medical Center Hamburg-Eppendorf. A classificação final do tumor de acordo com a UICC 7
th ed. revelou uma pT3, N1, L1, V1, R0, G2 PDAC da cabeça do pâncreas.
CEACAM derrubar variantes foram conduzidas pela interferência shRNA como descrito anteriormente [27]. Os oligonucleótidos foram clonados num vector de pSIREN-RetroQ e transfectadas por agentes de transfecção FuGENE (Roche Diagnostics, Hilden, Alemanha) com as células tumorais. Seleção de derrubar clones foi realizada por expressão de um chemoresistance puromicina (Clontech, Saint-Germain-en-Laye, França) e flow-citômetro (FACS-LSR Fortessa, BD Bioscience, San Jose, EUA). Apenas as células com derrube de 90%, como determinado por citometria de fluxo, foram utilizados para in vitro e em experiências in vivo. anticorpos não conjugados contra CEACAM 1, 5 e 6 e o rato biotinilado correspondente IgM ou IgM de rato de controlo de isotipo (Dako, Glostrup, Dinamarca) foram detectados com anticorpos de cabra anti-Ig de ratinho-APC (BD Biosciences). As células foram analisadas usando um CyFlow citômetro (Partek, Münster, Alemanha), com uma adição posterior de AlexaFluor488 estreptavidina conjugada (Invitrogen) antes da coloração.
In vitro caracterização de CEACAM derrubar células
A proliferação celular foi avaliada utilizando o ensaio colorimétrico de XTT (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a 3000 células /poço. Após 48 h, para permitir a aderência das células, as células foram incubadas com substratos colorimétricos. mudanças colorimétricos foram medidos em um multi-bem espectrofotômetro (MR5000 Multiplate Reader, Dynatech, Denkendorf, Alemanha).
As diferenças na migração celular foram avaliados utilizando FluoroBlok Migration Assay (BD Bioscience, San Jose, EUA) com 24- bem 8 micra de poro inserções de tamanho. As células foram tripsinizadas e re-suspensas em RPMI1640 isento de soro (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha) em uma concentração de 300.000 células /mL. 400 ul de suspensão de células foi adicionado à câmara apical e 800 ul de RPMI1640 com 10% de soro de vitela fetal (FCS, Invitrogen) foi adicionada à câmara inferior. O ensaio foi incubado durante 24 h sob condições de cultura de células padrão.
Após a remoção do atractor quimio da câmara inferior, a visualização de células que migraram foi realizada por adição de 500 ul de tampão bem /HBSS com calceína AM (Invitrogen) 4 ug /ml no poço inferior e incubação durante 1 h. Leitura foi realizado em 494/517 nm (Ex /Em) em um bottom-leitura do leitor de placas de fluorescência Genios (Tecan, Männedorf, Swizerland).
experimentos de fluxo laminar foram realizadas utilizando Ibidi microslides VI (Ibidi, Munique, Alemanha) ligado a uma bomba de seringa (modelo Série 100; kdScientific, Holliston, MA) e o movimento celular foi observada com um microscópio invertido (Zeiss, Jena, Alemanha; Axiovert 200). As células tumorais foram suspensas em meio de cultura de células (20 ml, 200 000 células /ml) e as lâminas foram revestidos com células endoteliais microvasculares de pulmão humano (HPMEC) (PromoCell, Heidelberg, Alemanha). HPMEC foram suspensas em meio de cultura celular, semeadas em microslides a uma concentração de 5 × 10
5 células /ml e 20 ul de meio com células foi pipetada para cada canal de fluxo. Celular confluente cresceu durante a noite sob condições padrão. taxas de corte aplicada variou de 0,05 dyn /cm
2-10,0 dyn /cm
2. a movimentação das células foi registrada e analisada no que respeita à qualidade do movimento (adesão, rolando e tethering) e velocidade de rolamento usando CapImage 8,5 programa (Dr. Heinrich Zeintl, Heidelberg, Alemanha).
Experiências com animais
as experiências com animais foram realizados de acordo com as diretrizes UKCCR para o bem-estar dos animais na neoplasia experimental [28], os moradores comissão de Ética para as experiências com animais (Behörde für Soziales, Familie, Gesundheit, Verbraucherschutz; Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz;. Billstr 80 , D-20539 Hamburgo, Alemanha, projecto nº G58 /09) e assim o animal oficial de bem-estar institucional da Universidade Medical-Center recomendado e aprovou o estudo.
Para o modelo de tumor subcutâneo, um milhão de PaCa 5061 células tumorais foram injetados na região escápula direita em 8-12 semanas de idade C57BL /6N PFP
– /- /RAG2
– /- ratos duplo knockout. Os animais foram sacrificados quando os tumores primários excedeu 2 cm
3 ou ulcerada na pele do rato, os ratos foram terminalmente narcotizado e sacrificados por cardiocentesis.
Para avaliação da influência de expressão CEACAM na disseminação peritoneal, estabelecemos um intraperiteoneal modelo de tumor tal como previamente descrito [29]. Resumidamente, um milhão de células de tumor foram injectados no quadrante esquerdo inferior abdominal intraperitonealmente em volume de suspensão de 200 uL. pontos de avaliação e hora de encerramento do experimento foi conduzido de acordo com um sistema de pontuação estabelecida anterior. Avaliação da extensão da o crescimento do tumor foi feito por via intraperitoneal com um índice de carcinomatose peritoneal modificado (PCI), como descrito anteriormente [30]. Resumidamente, a cavidade peritoneal é dividido em 9 regiões abdomino-pélvica, dependendo do estender do crescimento do tumor, a pontuação entre 0 e 3 pontos são atribuídos (0 pontos: nenhum tumor presentes; 1 ponto: tumor 1 milímetro
3 ; 2 pontos: tumor 1 e 3 mm
3; 3 pontos: tumor 3 mm
3) que levam a uma pontuação PCI de 0 a 27.
Quantificação de metástases pulmonares, células tumorais disseminadas (DTC) e por CTC Alu-PCR
Os pulmões esquerdos foram homogeneizados num disruptor amostra (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Alemanha) e submetido a isolamento de DNA-(QIAamp DNA Mini kit, Qiagen). A medula óssea foi recolhido por lavagem do fémur esquerdo com 1 ml de NaCl a 0,9%. 200 ul de sangue e as suspensões de medula óssea foram submetidos a ADN utilizando o Kit de isolamento de ADN de sangue QIAamp Mini.
concentrações de ADN de todas as amostras foram quantificadas usando um espectrofotómetro NanoDrop (Peqlab, Erlangen, Alemanha). À medida que o conteúdo de Alu-sequências detectáveis na seguinte qPCR teria sido afectada simplesmente variando as concentrações de ADN, todas as amostras de ADN-medula e osso lung- foram normalizados para 30 ng /mL, utilizando tampão AE (Qiagen). As concentrações de ADN-sangue foram bastante semelhantes em todas as amostras (aprox. 10 ng /ul) e foram, por conseguinte, não normalizada. qPCR foi realizado com Alu-iniciadores específicos de humanos estabelecidos [31]. 2 uL de ADN total (isto é, 60 ng de pulmão /da medula óssea de ADN; 20 ng de ADN de sangue) foram usados para cada qPCR. Os dados numéricos foram determinados contra uma curva padrão, tal como descrito [32]. O limite de detecção para sinais específicos Alu-seqüência humanos foi determinada para cada tipo de tecido por meio de testes de DNA de cinco saudável (não injectada) PFP
– /- /RAG2
– /- ratos do sexo e idade similar. Para cada amostra, foram realizadas análises em duplicado e experimentos independentes, pelo menos, duas vezes.
Os pacientes e procedimentos cirúrgicos
Entre 1992 e 2009, todos os pacientes submetidos à cirurgia de pâncreas resectional importante no Departamento de geral, visceral e Cirurgia Torácica da Universidade Medical Centre Hamburg-Eppendorf foram incluídos em um banco de dados prospectivo, pancreático. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Câmara dos Médicos em Hamburgo, Alemanha. consentimento por escrito para usar as amostras para fins de pesquisa foi obtido de todos os pacientes antes da cirurgia ou a retirada de sangue.
Os pacientes com PDAC da região cabeça do pâncreas rotineiramente foi submetido a duodenopancreatectomia parcial (PD) ou duodenopancreatectomia de preservação do piloro (PPDP ) e os métodos de ressecção de preservação de órgãos em casos de pancreatite crônica (CP). Somente os pacientes com ressecção completa do tumor macroscópico foram incluídos na análise final. A mortalidade hospitalar foi definida como morte a qualquer momento durante todo o período de hospitalização. informações de acompanhamento foi obtido a partir de ambulatório de nossa instituição, a partir de escritórios dos médicos de clínica geral adequados, ou a partir do registro de câncer regional. Quando a data da morte não foi registrado, os pacientes foram censurados no último contato gravado.
Tissue construção e matriz micro immounohistochemistry
núcleos de tecido foram obtidos a partir fixado em formol embebido em parafina (FFPE) blocos de tecido de pacientes com patologicamente provado PDAC. foram seleccionados áreas representativas do tumor com base na coloração de hematoxilina-eosina
TMA construção foi realizada como previamente descrito [33] -. [35]. Resumidamente, 252 cilindros de tecido com um diâmetro de 0,6 mm foram perfurados a partir do “dador” blocos de tecido, utilizando um instrumento de precisão robótico semiautomática feito por encomenda e colocados em um bloco de parafina que continha as 252 amostras individuais. Dentro destas amostras, havia 142 PDACs, tumores pancreáticos 40 neuroendócrinos (NET), 33 intraductal papilar mucinoso neoplasia (IPMN) e 37 amostras de tecido saudável como um controlo negativo. Os blocos de TMA resultantes foram usados para produzir secções de 4 ^ m que foram transferidos para um sistema de lâmina revestida de adesivo (Instrumedics Inc., Hackensack, New Jersey, EUA).
Os protocolos de coloração imuno-histoquímicos foram optimizados em vários benigna e tecidos malignos em um extenso processo de passos múltiplos que modificou o protocolo de coloração, até a coloração selectiva requerido foi obtido com o menor possível sinal de fundo (de acordo com [36]).
as secções foram desparafinadas e secas durante a noite a 37 ° C . A recuperação de antígenos foi realizada por tratamento em microondas forno em tampão citrato (pH 6,0) durante 1 min, as secções foram então re-hidratados em solução salina tamponada com Tris (TBS; 0,05 M Tris-HCl a pH 7,6 e 0,15 M de NaCl) e bloqueadas com soro de coelho AB (Biotest Diagnostics, Dreirach, Alemanha) diluída 1:10 em TBS durante 60 minutos. CEACAM coloração foi realizada utilizando um anticorpo monoclonal específico CEACAM (clone 4D1 CEACAM1 /C2 IgG2a, em casa clone (anteriormente descrito por [37]) a uma diluição de 1:200, CEACAM5 clone # 2383 IgG1 a uma diluição de 1:50 (Cell Signaling, Beverly, EUA); CEACAM6 clone de IgG1 (9A6), a uma diluição de 1:40 [Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemanha]) durante a noite a 4 ° C. anticorpos anti-ratinho biotinilado policlonal secundário de coelho (Dako, Hamburgo, Alemanha) foram utilizadas para a ligação do anticorpo primário CEACAM. Transição (EMT) marcadores epiteliais-mesenquimais foram estudos de imuno-histoquímica também. ZEB 1 (IgG a uma diluição de 1:100, policlonal de coelho anti-humano, Atlas anticorpos, Estocolmo, Suécia), 2 ZEB (IgG a uma diluição de 1:100, policlonal de coelho anti-humano, Atlas anticorpos, Estocolmo, Suécia ), E-caderina (), Pan-Cytokeratin ().
os sítios de ligação foram detectadas usando o ABC-AP-Kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, EUA). A actividade da fosfatase alcalina de um complexo biotina-estreptavidina fosfatase alcalina foi visualizada utilizando naftol AS-bisfosfato como substrato e hexatozised nova fucsina foi utilizado para acoplamento simultâneo. As secções foram contrastadas com hemalum de Mayer (Merck, Darmstadt, Alemanha).
A intensidade da coloração (0, 1+, 2+, 3+) e a fracção de células tumorais positivas foram pontuadas para cada mancha como tecido recentemente publicado [34]. Manchas sem coloração e com uma intensidade de coloração de 1+ em 70% e em 2+ 30% das células tumorais foram marcados como CEACAM baixo, as pontuações médias foram dadas para uma intensidade de coloração de 1+ na ≥70%, 2+ em ≥30% ou em 3+ 30% das células tumorais, e pontuações mais altas foram dadas para uma intensidade de coloração de 2+ em ≥70% ou em 3+ ≥30% das células tumorais. análise imuno-histoquímica das seções foi realizada sem o conhecimento da identidade dos pacientes ou estado clínico. A análise imunohistoquímica e pontuação foram realizadas por dois investigadores independentes que desconheciam o resultado paciente ou outros achados clínicos. Em 95% das amostras, as avaliações dos dois observadores eram idênticas, as lâminas restantes foram reavaliadas, e as decisões de consenso foram feitas.
O protocolo de coloração foi bem utilizado para ratos cultivados tumores e mostrou semelhante sensibilidade e especificidade em comparação com a coloração TMA.
ensaio imunoenzimático (ELISA)
para subtipos quantificação CEACAM no sangue periférico, as amostras de soro de 46 pacientes caucasianos com PDAC e 47 pacientes caucasianos com CP , que foram indicados para o tratamento cirúrgico, foram analisados com um imunoensaio ligado a enzima (ELISA). Todas as amostras de sangue foram obtidas diretamente antes da cirurgia. Como controles saudáveis, 50 caucasianos doadores de sangue bancários, obtidos a partir do instituto de medicina de transfusão (Centro Médico Universitário Hamburg-Eppendorf), foram incluídos no estudo. Preparação de amostras de soro foram conduzidos de acordo com um protocolo padronizado [38]. A idade média foi de 62,4 anos no momento do diagnóstico (faixa 36.3-90.4 anos, 24 do sexo masculino [52,2%], 21 do sexo feminino [47,8%]). Os valores séricos de 47 pacientes submetidos à cirurgia devido a pancreatite crônica (idade média no momento do diagnóstico de 47,0 anos, faixa de 31.1-76.1 anos) e 50 amostras de dadores de sangue saudáveis foram utilizados como controle (25 do sexo masculino [50%], 25 do sexo feminino [ ,,,0],50%]).
Para a detecção de CEACAM 1 e 5 CEACAM no soro, placas de 96 poços de microtítulo flexíveis (Costar 9019, EUA) foram revestidas com 50 uL por poço de 2 ug /ml de anticorpos monoclonais anticorpo de captura de rato (clone 283324 e 843130, de IgG1 de rato, R D systems, USA) durante a noite a 4 ° C. Os poços foram bloqueados com 3% w /v de albumina de soro bovino (BSA; Fracção V, 98% de pureza, Sigma Aldrich, Alemanha) em PBS /T (salina tamponada com fosfato, pH 7,3, contendo 0,05% v /v de Tween) durante 45 min à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante 1 h com soro humano diluído a 1:50 em PBS, à temperatura ambiente. Após cinco lavagens com PBS /T, a proteína ligada foi detectada com conjugado com biotina anticorpo policlonal anti-CEACAM 1 ou 5 (, clone 842284 CEACAM uma IgG de cabra; CEACAM 5 IgG de ovelha, o clone 843131Goat IgG, R D systems, EUA), respectivamente, seguido de peroxidase conjugada com estreptavidina utilizando TMB (3,3 ‘, 5,5 “-tetrametilbenzidina) como substrato. A reacção de cor foi interrompida pela adição de 10 mM H
2SO
4 e analisada a 450 nm utilizando um leitor de ELISA (Dynatech MR 5000, EUA). CEACAM recombinante humana 1 e 5 proteínas (R D systems) serviu como um padrão interno para o ensaio
CEACAM 6 foi determinada por um ELISA directo do revestimento 50 ul de soro de um paciente em uma diluição 1:50 durante a noite a. 4 ° C na placa de 96 poços. Os poços foram bloqueados com albumina de 3% de soro de bovino (BSA; Fracção V, 98% de pureza, Sigma Aldrich) em PBS /T (salina tamponada com fosfato, pH 7,3, contendo 0,05% v /v de Tween) durante 45 min à temperatura ambiente e depois incubou-se durante 1 h com o anticorpo de detecção anti-CEACAM 6 (IgG1 de ratinho, clone 843158, R D systems). A reacção de cor foi interrompida pela adição de 10 mM H
2SO
4 e analisada a 450 nm. Para assegurar que o imunoensaio foi adequado para medir as amostras de soro clínicos, reprodutibilidade e linearidade foram examinados (de acordo com [39]).
Análise estatística
Para a análise estatística exploratória dos grupos de pacientes individuais, foi usada ou um teste do qui-quadrado de dois lados ou de um teste exato de Fisher. As variáveis quantitativas tanto foram testadas por meio do Estudante
t-teste
ou medianas do teste de Wilcoxon. Teste para a distribuição normal das variáveis quantitativas foi realizada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov-teste. A análise de Kaplan-Meier (teste log-rank) foi utilizado para LIVRE doença e análise-sobrevida global excluindo mortalidade intra-hospitalar. Todas as variáveis que atingiram um valor P ≤0.05 foram incluídas em um modelo de cox-regressão multivariada. O nível de corte de quantificação CEACAM soro foi determinada usando a Youden-index e como descrito anteriormente [33], [40].
Resultados
In vitro características de CEACAM derrubar PDAC células
Tal como analisado por citometria de fluxo, a expressão basal CEACAM estava presente nas células de tumor. níveis superfície do CEACAM subtipos 1, 5 e 6 foram reduzidos para 5% em comparação com a expressão CEACAM em células de controlo (Figura 1A). A proliferação e migração aumentada nas células derrubar CEACAM em comparação com as células de controlo (Figura 1B e C), mas CEACAM knockdown não afectou a aderência sobre o endotélio estimulada (HPMEC) (Figura 1D e E).
( UMA). CEACAM expressão basal variou dependendo do subtipo CEACAM, foram encontrados níveis mais elevados para CEACAM 1, intermediário para CEACAM 6 e níveis mais baixos para CEACAM 5. Como pode ser visto na proliferação (B) e os ensaios de migração (C), CEACAM derrubar células apresentaram maior proliferativa e migrative potencial em comparação com células de controlo. As diferenças de aderência em (TNFa) de células endoteliais estimuladas não eram detectáveis entre KD CEACAM e células de controlo. Nem o número médio (D) nem o tempo médio de adesão às células endoteliais foi diferente (E). tumores de xenoenxerto de murino foram altamente positivo para CEACAM 1, 5 e 6. imuno coloração em células de controle mostrou completa ausência de expressão CEACAM em imuno-histoquímica em derrubar células (F).
Para o controle da presença do CEACAM derrubar nos tumores murinos cultivados, IHC coloração de CEACAM 1, 5 e 6 foi realizada e, como representado na Figura 1F, os níveis de derrubar-se estáveis e ainda presente nos tumores cresceram nos ratinhos.
modelo de xenoenxerto de análise funcional do CEACAMs no PDAC
para responder à questão de saber se os membros da família CEACAM ter um efeito funcional na formação de tumores, crescimento e metástase, um experimento de xenotransplante tumoral com células PDAC humanos (com e sem CEACAM knockdown ) em PFP
– /RAG2
– ratos foi realizada. Após a injeção de células tumorais subcutânea, camundongos inoculados com CEACAM derrubar células mostrou uma sobrevida global significativamente prolongada até atingir os critérios de terminação (sobrevivência média de 144 d) quando comparado com PaCa 5061 controlo (sobrevivência média 104 d; P = 0,014) e do tipo selvagem PACA 5061 (mediana de sobrevivência 79 d; P = 0,01) (Figura 2A). O tamanho do tumor e o peso no momento da morte não foi significativamente diferente entre os grupos (dados não apresentados).
intraperitoneal, não foram observadas diferenças no índice de carcinomatose peritoneal (PCI) em vez de escarificação (80 dias depois injecção). CEACAM derrubar mostrou mais cópias de ADN de DNA humano no pulmão esquerdo (p = 0,021) (C), que está correlacionada com uma carga metastática maior no pulmão, no entanto, não foi observada nenhuma diferença para células de tumor que circulam no sangue (D) .
Enquanto o modelo de xenoenxerto subcutâneo mostrou uma oS prolongado para ratos com CEACAM knockdown, a influência do CEACAM knock down no modelo de xenotransplante intraperitoneal não estava presente. O índice de carcinomatose peritoneal não diferiu entre os grupos, o que também foi representado em diferenças em falta na divulgação como não havia diferenças entre o CEACAM knock down e o grupo de controlo em células tumorais circulantes no sangue periférico (Figura 2B e D). No entanto, no CEACAM derrubar grupo, encontramos quantidades mais elevadas do DNA humano (o que significa significativamente mais células PDAC) nos pulmões em comparação com o grupo controle (Figura 2C). células PDAC mostrou nenhuma afinidade para difusão para a medula óssea, o DNA de células de tumor humano não foi detectada em qualquer um dos grupos. Marcadores para EMT não mostraram diferenças significativas entre o tipo selvagem e CEACAM derrubar tumores como determinado por imuno-histoquímica (Fig S1).
imuno-histoquímica CEACAM 1, 5 e 6 de expressão em pacientes com amostras
Fora de os 142 pontos tumorais, 5 (3,5%) de amostra não foram avaliados sobre a TMA devido ao tecido do tumor em falta ou não representativos. As amostras de tecido de 137 pacientes foram finalmente avaliável e correlacionados com dados clínico-patológico. Os pacientes tinham idades entre 33.1-85.0 anos (mediana de 63,5 anos). Havia 82 pacientes do sexo masculino (59,9%) e 55 do sexo feminino (40,1%).
CEACAM 1 expressão foi encontrada em 62,8% de todas as amostras de tumor (n = 86), CEACAM 5 em 87 pacientes (63,5%) , 6 CEACAM expressão foi observada em 99 pacientes (72,3%). A maioria dos tumores mostrou uma coloração homogénea dentro de cada espécime, embora numa minoria de espécimes de tumor, foi observado um padrão de coloração IHC não homogénea dentro da área de tumor. O padrão de expressão de todas as três CEACAMs era membranoso e citoplasmático bem como (Figura 3). Expressão de CEACAM 5 foi associada à presença de CEACAM 6 expressão (P 0,001). A correlação entre CEACAM 1 e CEACAM 5 expressão (P = 0,113) ou não foi observada CEACAM 6 (P = 0,09).
A correlação com os dados clínico-patológicos não revelou associação significativa com qualquer parâmetro para CEACAM 1, excepto uma correlação com metástase distante (P = 0,008). CEACAM 5 e 6 de expressão foi correlacionada com um status de linfonodo positivo (P = 0,017 e P = 0,046, respectivamente) e metástases à distância (P 0,001). (Tabela 1)
A Kaplan-Meier análise de sobrevivência não mostrou correlação entre a expressão CEACAM 1 eo global (oS) ou sobrevida livre de doença (DFS), respectivamente. Os doentes com um CEACAM positivo 5 e /ou 6 tinha uma expressão OS encurtado e DFS (P = 0,025 e P = 0,007, P = 0,010 e P = 0,030, respectivamente) (Figura 4A-C, Tabela 2). Em pacientes com expressão positiva para as três proteínas CEACAM foi observada nenhuma diferença significativa em DFS ou OS comparação com aqueles pacientes que foram negativos para todos os subtipos CEACAM (P = 0,144 e P = 0,742, dados não mostrados).
(A-C). CEACAM 1 doentes positivos apresentaram uma sobrevida média de 17,0 meses (14.0-20.1 meses), CEACAM 1 negativos 23.0 meses (9.5-36.5 meses, P = 0,279). OS de CEACAM 5 pacientes positivos foi de 16,0 meses (12.8-19.2 meses) versus 22.0 meses (4.1-47.9 meses) (p = 0,025). CEACAM 6 pacientes positivos mostraram um sistema operacional de 14,0 meses (7.9-20.0) vs. 22.0 meses (5.6-38.4 meses, P = 0,010). As curvas de sobrevida para correlação entre-sobrevida global e expressão soro CEACAM (D-F). CEACAM 1 doentes positivos mostraram um sistema operacional de 11,8 meses (2.4-25.2) vs. 18,3 meses (10.0-26.2 meses, P = 0,022). OS mediana para pacientes positivos para CEACAM 5 foi de 15,7 meses (2.4-32.3 meses) versus 18,6 meses (8.7-28.6 meses, p = 0,651), e OS mediana para pacientes com CEACAM 6 positividade foi de 18,8 meses (9.5-28.1 meses ) vs. 12,8 meses (3.3-22.3 meses, p = 0,187). Boxplots para CEACAM 1 expressão soro (G), CEACAM 5 (H) e CEACAM 6 (I) em comparação adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC), pâncreas crônica (PB) e doadores de sangue saudáveis (BD). curva de funcionamento do receptor (ROC) para a expressão do soro CEACAM (J).
CEACAM 1, 5 e 6 no soro
CEACAM 1 Valores em PDAC não foram elevados, quando comparados com pacientes com CP, mas foram maiores em comparação com BD (PDAC média 33,0 g /l, faixa de 3,3-136,7 g /l; CP média de 23,1 g /l, faixa de 1,8-110,1; BD média 16,1 g /l, gama 7,8-36,5 ug /L, P = 0,059 e P 0,001, respectivamente). Foram encontrados resultados semelhantes para CEACAM 5: Valores de soro foram superiores no grupo PDAC comparação com TB, mas não para CP (PDAC mediana de 8,5 ug /L, gama de 0,7-75,2 ng /mL; mediana CP 4,8 ug /l, 0,7-gama 24,0; BD mediana de 1,9 ug /L, gama de 0,2-9,2 ug /ml; P = 0,122 e P = 0,002, respectivamente). Pacientes com PDAC apresentaram expressão elevada de soro CEACAM 6 comparado com ambos, CP e BD (PDAC mediana 2,90 mg /L, gama de 1,34-5,46 ug /l; CP mediana 2,25 mg /L, gama de 0,77-5,15; BD mediana 2,34 mg /L , gama de 1,25-6,99 ug /ml; P = 0,06 e P = 0,029, respectivamente). Em nenhuma das análises realizadas, uma diferença significativa entre CP e BD foi detectável (Figura 2G-I).
Curvas ROC foram usadas para estabelecer a relação sensibilidade especificidade para CEACAM 1, 5 e 6. os valores de corte ideais foram determinados por cálculo Youdens-Index. A área-sob-a-curva (AUC) para CEACAM 1 foi 0,711 (valor de corte de 184,1 ug /L), para CEACAM 5 0,689 (cut-off valor 1,95 ug /l) e para CEACAM 6 0,664 (cut-off valor de 3,58? g /L) (Figura 2J) A sensibilidade de detecção em 1 CEACAM PDAC foi de 53,5% com uma especificidade correspondente de 54,7%. Para CEACAM 5, a sensibilidade é de 79,1%, com uma especificidade de 44,2%. Sensibilidade de CEACAM 6 foi de 47,0% com uma especificidade de 82,6%. A AUC para uma combinação de todos os três CEACAMs não mostrou melhoria em comparação com a determinação de cada um dos CEACAMs sozinho (AUC 0,680, dados não mostrados).
Para uma correlação entre os valores séricos de CEACAM com dados clinico-patológico, os valores de soro foram divididas em um nível baixo ( 75
percentil) e um grupo de alto nível (≥75
percentil). Alta CEACAM 6 valores com presença de metástases à distância (P = 0,009) e classificação (P = 0,019) (Tabela 1). Além disso, rubor da molécula shedded na corrente sanguínea pode ser uma consequência do rompimento de barreiras anatômicas adjacentes tecidos hospedeiros e células endoteliais.