Sumário

vesículas extracelulares (SVE) são os principais contribuintes para o câncer em que desempenham um papel fundamental na comunicação célula-célula e transferir moléculas pró-oncogênicos para células receptoras conferindo assim um fenótipo canceroso. Aqui, nós purificado EVs usando abordagens bioquímicas diretas a partir de várias linhas celulares de cancro e, posteriormente, caracterizado estes EVs através de múltiplos métodos bioquímicos e biofísicos. Além disso, utilizou-se microscopia de fluorescência para mostrar directamente internalização de VE para as células recipientes dentro de poucos minutos após a adição de VE para células receptoras. Confirmou-se que a proteína transmembranar EMMPRIN, postulada como sendo um marcador de VE, foi de facto segregado a partir de todas as linhas celulares estudadas. Avaliou-se a resposta à estimulação EV em vários tipos diferentes de linhas de células receptoras e medida a capacidade destes VE purificadas para induzir a secreção de vários factores altamente regulados positivamente em cancros humanos. Os nossos dados indicam que os VE purificados preferencialmente estimulam a secreção de várias proteínas envolvidas na condução do cancro nas células monocíticas, mas apenas actividade limitada em abrigar células epiteliais. Especificamente, mostra-se que os VE são estimuladores potentes da MMP-9, IL-6, TGF-β1 e induzir a secreção extracelular de EMMPRIN, que desempenham um papel na condução imune evasão, invasão e inflamação no microambiente tumoral. Assim, usando uma abordagem abrangente, que inclui, e métodos espectroscópicos biológicos bioquímicos, nós começamos a elucidar os papéis estimuladores

Citation:. Redžić JS, Kendrick AA, Bahmed K, Dahl KD, Pearson CG, Robinson WA, et ai. (2013) Extracellular Vesículas segregadas a partir de linhas celulares de cancro estimular a secreção de MMP-9, IL-6, TGF-β1 e EMMPRIN. PLoS ONE 8 (8): e71225. doi: 10.1371 /journal.pone.0071225

editor: Jialin Charles Zheng, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 10 Agosto, 2012; Aceito: 30 de junho de 2013; Publicação: 01 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Redžić et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado através NIH número do pedido 1R01GM096019-01A1 para EZE Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

derramamento celular é um processo que ocorre em todas as células, como um meio para eliminar componentes celulares desnecessários, ainda o papel crítico de vesículas secretadas em comunicação célula-célula está a começar a emergir [1], [2]. As proteínas da membrana são derramadas através de um número de mecanismos diferentes que incluem derramamento ectodomínio e secreção de proteínas de membrana de comprimento total por meio de vesículas secretados [3]. derramamento vesicular ocorre por germinação para fora da membrana do plasma com a libertação de um tipo de vesícula conhecido como um microvesículas ou por germinação para dentro da membrana, com a eventual libertação de vesículas conhecidas como exossomas [4]. Aqui, vamos nos referir coletivamente para ambas as microvesículas e exossomos como vesículas extracelulares (SVE). Este fenómeno de derramamento vesicular, isto é, derramamento EV, também foi observada num número de diferentes doenças, incluindo distúrbios neurológicos, infecções virais e cancro [5] – [7]. Na verdade, EV derramamento ocorre numa maior extensão em células cancerosas em comparação com as células saudáveis ​​e resulta na libertação de moléculas pró-oncogénicas, incluindo proteínas, RNA e DNA [8], [9]. Recentemente, vários papéis de EVs surgiram que permitem que essas partículas para conduzir processos necessários para o desenvolvimento e progressão do câncer, como a angiogênese, inflamação e resistência à droga [10]. Existem vários mecanismos pelos quais EVs pode agir em células receptoras. Por exemplo, estes podem incluir qualquer estimulação directa dos receptores celulares de proteínas na superfície da EV ou internalização de VE pela célula receptora, que tanto levar a subsequente estimulação de vias de sinalização [1], [11]. As células cancerosas parecem usar SVE como meio de comunicação célula-célula, transferindo o seu conteúdo (ADN, ARN e proteína) a uma célula receptora, desse modo conduzindo a uma transformação de um não-maligno de um fenótipo maligno da célula receptora [12 ] – [14]. O teor de proteína da EVs desempenha um papel fundamental na internalização e atividade dos EVs. Por exemplo, as proteínas EV envolver as células receptoras, resultando na absorção de VE [15] e VE foram mostrados para transferir onco-proteínas resultantes na alteração fenotípica da célula receptor [12] – [14]. No entanto, uma das questões pendentes com relação à atividade EV é se há diferenças na atividade EV observada entre os diferentes tipos de células do destinatário, bem como quais as proteínas podem ser secretadas por EVs. Para este fim, foram avaliadas as diferenças na atividade estimuladora EV em vários tipos de células diferentes destinatário sondando a secreção estimulada-EV de vários fatores diferentes que foram mostrados a desempenhar papéis importantes em cancros humanos.

Temos EVs purificadas a partir de indivíduos saudáveis, de doentes com cancro e várias linhas celulares de cancro de mamíferos diferentes. O nosso método de purificação originou uma população heterogénea de veículos eléctricos que variam em tamanho de 20-300 nm, indicando uma mistura de exossomas e microvesículas [4]. Detectamos a proteína de comprimento transmembranar integral chamada Matriz Extracelular metaloproteinase indutor (EMMPRIN), uma proposta de marcador de EVs [16], em EVs purificados a partir de várias amostras de fluidos biológicos diferentes e de todas as diferentes linhas de células que avaliamos aqui. Nós, por conseguinte, utilizado EMMPRIN como um marcador para os nossos VE purificadas. A microscopia de fluorescência revelou que os nossos VE purificadas foram internalizados pela célula receptora num tempo relativamente curto, (5-15 minutos), e localizar em torno do núcleo, confirmando assim que o nosso método de purificação resultou em VE activas, capazes de transferir o seu conteúdo para células receptoras . Nossa avaliação base ampla de várias linhas celulares diferentes destinatário mostra que os VE purificados a partir destes vários tipos de células cancerosas apresentam actividade estimuladora preferencial de proteínas secretadas em relação a monócitos mas as células não epiteliais. De facto, enquanto que nós descobrimos que o SVE segregadas a partir de todas as linhas celulares estudadas aqui contêm comprimento completo EMMPRIN, VE também estimular a secreção de comprimento completo EMMPRIN-se em células de leucemia monocítica humana. Descobrimos que os VE são estimuladores potentes de transformação do factor de crescimento beta 1 (TGF-β1), metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9) e a interleucina-6 (IL-6). Esta actividade estimuladora de VE para induzir a secreção de TGF-β1, MMP-9, IL-6 e EMMPRIN, sugere um papel dos VE na condução de progressão tumoral por factores importantes para imune evasão, invasão e inflamação [17] estimulante – [19 ]. Nossos dados nos aproxima de uma melhor compreensão da biologia dos EVs secretadas, o tipo de célula preferencial estimulada por EVs e as moléculas que são secretadas por células receptoras por estimulação com EVs secretados.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética para Humano (paciente /doador) Recolha de fluidos biológicos

amostras de sangue periférico foram coletadas na University of Colorado Hospital Oncologia cutânea Clinic. VACUTAINERS tubos (top vermelho, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) foram utilizados para a coleta de soro. As amostras foram imediatamente transportadas para o laboratório, centrifugada a 1200 × g durante 10 minutos, em seguida, congeladas a -80 ° C até ser necessário. heparina de lítio contendo VACUTAINERS (topo verde, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) foram utilizados para a recolha de plasma, imediatamente transportadas para o laboratório, centrifugado a 800 x g durante 10 minutos a 4 ° C. As amostras de plasma foram congeladas a -80 ° C até ser necessário. fluido de ascite foi coletado nas torneiras derrame pleural em Radiologia Intervencionista da Universidade do Colorado Hospital usando um vacutainer (top vermelho, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA). As amostras foram imediatamente transportadas para o laboratório em gelo, centrifugadas a 800 x g durante 5 minutos a 4 ° C até os restos celulares removidos. As amostras foram congeladas a -80 ° C até ser necessário. A recolha de amostras de fluidos biológicos foi aprovado pelo Multi-Institucional Review Board Colorado (COMIRB # 05-0309), e as amostras foram coletadas após o consentimento informado por escrito.

Detecção de Corpo Inteiro EMMPRIN em fluidos biológicos

de soro, amostras de plasma e de fluidos de ascites humanos foram filtradas utilizando um filtro de 0,22 um para remover as células e os restos celulares. 10 ug de anticorpo policlonal humano EMMPRIN biotinilado (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA) foi utilizado para imunoprecipitar EMMPRIN (IP) a partir de cada amostra. O IP foi realizada durante 2 horas a 4 ° C com rotação, seguido por incubação com 40 ul de esferas de estreptavidina (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) durante 2 horas a 4 ° C com rotação. PNGaseF (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) foi utilizado para a fracção deglycosylate iped numa enzima de 1:10 a amostra rácio de acordo com o protocolo do fabricante. 5 ul de SDS a 10 X carregando Foi adicionado tampão de amostra e fervida durante 10 minutos antes da carga numa Bis-Tris em gel de SDS-PAGE a 4-12% (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA), em seguida, transferida para um Immobilon polivinilideno fluoreto de vinilideno (PVDF) membrana (Millipore, Bedford, MA, EUA) para análise de mancha de Western. A membrana foi bloqueada em leite a 2% durante 30 minutos e em seguida incubadas em anticorpo monoclonal EMMPRIN humana (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA), preparada usando uma diluição 1:1000 em leite a 2% durante 1 hora. Após a incubação do anticorpo primário, a membrana foi lavada com 1 x tampão fosfato salino (PBS) durante 30 minutos. IgG anti-ratinho conjugado com HRP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) foi preparado usando uma diluição 1:4000, aplicada à membrana e incubada durante 1 hora, seguido de uma lavagem adicional em PBS 1 * durante 30 minutos. detecção de banda da proteína foi realizada com o kit de detecção de quimioluminescência ECL utilizando um kit de detecção da Perkin Elmer (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA).

A cultura de células

células MCF-7 foram um tipo dom de Dr. Heide Ford (Departamento de Farmacologia da Universidade do Colorado Denver School of Medicine) [20]. células MDA-MB-231 foram um presente amável do Dr. Jennifer Richer (Departamento de Patologia da Universidade do Colorado Denver School of Medicine) [21]. U937, THP-1, as linhas celulares Molm13 e prepúcio humano fibroblastos (HFF) foram um presente amável do Dr. James DeGregori (Departamento de Bioquímica e Genética Molecular, Universidade do Colorado Denver School of Medicine) [22] – [24]. células L3.6pL foram um presente amável do Dr. Isaías J. Fidler (Departamento de Biologia do Câncer, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center) [25]. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2. As células MCF-7 e MDA-MB-231 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com alto teor de glucose, L-glutamina, piruvato de sódio, 1% de penicilina /estreptomicina /anfotericina-b e 10% de soro fetal bovino (FBS; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA). L3.6pL células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com L-glutamina, piruvato de sódio, 5 mM de aminoácidos não essenciais, 25 ug /mL plasmocin, 1% de penicilina /estreptomicina /anfotericina-b e 10% de FBS. U937, Molm13, as células THP-1 e de FPH foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com L-glutamina, 1% de penicilina /estreptomicina /anfotericina-b e 10% de FBS.

Purificação de VE

linhas de células aderentes (células MCF-7, MDA-MB-231, e L3.6pL Hek293Fpl) utilizada para a purificação das vesículas foram cultivadas em placas de 150 mm até as células foram 70% confluentes. O meio foi removido e as células foram lavadas com 1 x PBS, duas vezes. meios adequados suplementados com 3% de FBS empobrecido de veículos eléctricos através de ultracentrifugação foi adicionado às células [26].

VE de 5 × 10

5 células /mL de células U937 foram cultivadas em frascos T-75 em RPMI 1640 e 3% vesícula livre FBS. No momento da recolha, as células foram sedimentadas por centrifugação durante 5 minutos a 1100 rpm e o sobrenadante foi recolhido. O sobrenadante a partir de todas as células foi recolhido a cada 48 horas e 4 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA) foi adicionado ao sobrenadante imediatamente após a recolha. O sobrenadante foi centrifugado a 8000 rpm durante 10 minutos para remover quaisquer restos celulares e, em seguida, filtrada utilizando um filtro de 0,22 um. Utilizando um peso molecular de 100 kDa cortado filtro de membrana (Millipore, Bedford, MA, EUA), o sobrenadante foi concentrado para um volume de 1-2 ml. VE da amostra concentrada foram purificadas utilizando uma coluna preparatória de Superose 6 de cromatografia de exclusão de tamanho (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) equilibrada em 1 X PBS, pH 7,5. o conteúdo total de proteína de VE purificados foi medida usando o ensaio de proteína total de Bradford (BioRad, Hercules, CA, EUA).

Identificação de todo o comprimento EMMPRIN dentro purificada EVs

As fracções de volume desocupado a partir de a cromatografia de exclusão de tamanho foram agrupadas e concentradas para 500 ul. 10 ug de anticorpo policlonal humano EMMPRIN biotinilado (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA) foi utilizado para imunoprecipitar EMMPRIN (IP) a partir de cada amostra. O IP foi realizada durante 2 horas a 4 ° C com rotação, seguido por incubação com 40 ul de esferas de estreptavidina (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA) durante 2 horas a 4 ° C com rotação. PNGaseF (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) foi utilizado para a fracção deglycosylate iped numa enzima de 1:10 a amostra rácio de acordo com o protocolo do fabricante. 5 ul de SDS a 10 X carregando Foi adicionado tampão de amostra e fervida durante 10 minutos antes da carga numa Bis-Tris em gel de SDS-PAGE a 4-12% (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA), em seguida, transferida para um Immobilon polivinilideno fluoreto de vinilideno (PVDF) membrana (Millipore, Bedford, MA, EUA) para análise de mancha de Western. A membrana foi bloqueada em leite a 2% durante 30 minutos e em seguida incubadas em anticorpo monoclonal EMMPRIN humana (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA), preparada usando uma diluição 1:1000 em leite a 2% durante 1 hora. Após a incubação do anticorpo primário, a membrana foi lavada com 1 x tampão fosfato salino (PBS) durante 30 minutos. IgG anti-ratinho conjugado com HRP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) foi preparado usando uma diluição 1:4000, aplicada à membrana e incubada durante 1 hora, seguido de uma lavagem adicional em PBS 1 * durante 30 minutos. detecção de banda da proteína foi realizada com o kit de detecção de quimioluminescência ECL utilizando um kit de detecção da Perkin Elmer (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA).

Espectrometria de Massa de Análise do Segregada VE

Seguindo o PI de EMMPRIN a partir das amostras de soro, 10 uL de amostra foi submetida a electroforese através de um gel de SDS-PAGE a 4-12% Bis-Tris. bandas de gel para a espectrometria de massa foram visualizados com Comassie corante azul. Uma banda no intervalo de 25-35 kDa foi excisada a partir do gel e cortados em quadrados de 1 mm. A banda de gel foi então lavada várias vezes em mM de bicarbonato de amónio /50% Acetonitrilo 25 solução (ABC mM /50% de ACN 25) para remover o excesso de corante azul de Comassie. A amostra foi reduzida com ditiotreitol 1 mM (DTT, ouro Biotechnology, St. Louis, MO, EUA) durante 30 minutos a 70 ° C e em seguida alquilado com iodoacetamida 20 mM (IA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) durante 45 minutos à temperatura ambiente no escuro. As amostras são lavadas duas vezes em água destilada durante 15 minutos, enquanto se misturava (vórtice), seguido pela mM ABC /lavagem ACN 25 a 50% e, finalmente, 100% de ACN lavagem. As amostras foram, em seguida, secou-se utilizando um sistema de vácuo de velocidade, em seguida, 10 ul de 10 mg /mL de tripsina (Promega, Madison, WI, EUA) foi adicionado às bandas de gel e a digestão foi deixada prosseguir durante a noite à temperatura ambiente. As amostras foram analisadas num LTQ FT-espectrómetro de massa de ultra híbrido (Thermo Fisher, Bremen, Alemanha). Péptido dessalinização e a separação foi conseguida utilizando um sistema de HPLC de bomba dupla capilar /nano (Agilent 1200, Palo Alto, CA, EUA). A bomba nano prazo foi de 60 minutos a uma velocidade de fluxo de 350 nL /min. Um gradiente de 41 minutos desde 12% de ACN a 35% de ACN foi usada para separar os péptidos. A corrida foi monitorizada por LC gravação sequencialmente varreduras MS, na célula ICR, enquanto três verificações de MS2 foram obtidos na armadilha de iões através de CID. destilador Raw (UCSF, CA, EUA) foi usada para criar de-isotoped, listas de pico centroided de espectros-primas (.mgf formato). Estas listas de pico foram pesquisados ​​contra todas as entradas humanos no banco de dados de proteínas SwissProt utilizando servidor Mascot ™ (Versão 2.2, Matrix Science). Para pesquisas, tolerâncias massa foram +/- 10 ppm para os picos de MS, e +/- 0,6 Da para MS /MS iões do fragmento. especificidade do tipo tripsina foi usado para permitir uma clivagem dispensada. foram permitidas as modificações da oxidação de metionina, a acetilação de proteínas N-terminal e o péptido N-terminal de formação de ácido piroglutâmico para. Um valor de 0,05 foi considerado significativo

nanopartículas Rastreamento Análise Medição

rastreamento de nanopartículas análise (NTA) é um dos métodos utilizados para a detecção de EVs secretadas dentro de uma dada amostra.. fracções de elevado peso molecular de cromatografia de exclusão 6 tamanho Superose foram testadas usando NTA versão 2.2 Build 0375 do instrumento (NanoSight, Amesbury, Wiltshire, Reino Unido). As amostras foram ensaiadas a 1:10,000 diluição e 1 ml de amostra diluída foi usado para a análise.

Microscopia de Fluorescência

1 × 10

6 células /ml de células foram centrifugadas a 1100 rpm durante 5 minutos para sedimentar as células. As células foram fixadas com 200 ul de formalina a 1% (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA) durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram centrifugadas como acima, o sobrenadante é removido e as células lavadas com 1 x PBS duas vezes. As células foram incubadas em 20 ul de anticorpo conjugado com FITC-EMMPRIN (Ancell, Bayport, MN, EUA) preparado em uma diluição de 1:50 e incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos. As células foram lavadas com PBS 1 * duas vezes a seguir ao período de incubação. A coloração nuclear foi realizada à temperatura ambiente durante 10 minutos, utilizando uma ul /ml de 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) mancha (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA). As células foram lavadas duas vezes com 1 x PBS e montadas em lâminas de microscópio.

Para avaliar a interacção e localização de veículos eléctricos com células THP-1, VE foram incubadas com vermelho do Texas mancha durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. VE foram centrifugadas durante 90 minutos a 100000 xg no rotor TLA-55. O sobrenadante foi aspirado e o pelete lavado em 1 X PBS, em seguida, centrifugada novamente como acima 2 vezes. O sobrenadante foi removido e o sedimento ressuspenso em 20 ul de 1 x PBS. VE coradas foram então adicionados às células e incubadas a vários tempos variando entre 5 minutos até 24 horas a 37 ° C. As células foram visualizadas utilizando um Ti Nikon Eclipse (Nikon Instruments Inc., Melville, Nova Iorque, EUA) com um microscópio invertido Nikon 1,4 objectivo 100X PlanApo NA. As imagens foram capturadas com uma câmera Andor ixon EMCCD 888E (Andor Technologies, South Windsor, CT, EUA). análise de imagem e quantificação foi realizada utilizando o software de imagem NIS Elements (Nikon Instruments Inc., Melville, NY, EUA). Todas as imagens obtidas foram adquiridos à temperatura ambiente. Tempos de aquisição de imagens eram 80 ms, 500 ms e 300 ms para os canais de azul, verde e vermelho, respectivamente. As imagens foram processadas para figuras usando ImageJ e depois produzido usando Corel Draw.

medindo a variação de EMMPRIN Expressão Após a vesícula Estimulação

citometria de fluxo de células THP-1 marcadas com anticorpo conjugado EMMPRIN-FITC foi realizada para determinar se existem quaisquer alterações no nível de expressão EMMPRIN superfície celular após o tratamento com os VE. EMMPRIN intensidade média de fluorescência (MFI) foi medida utilizando o Beckman Coulter celular Lab Quanta SC Citómetro de fluxo em células não tratadas, células tratadas com 1 x PBS (tampão células tratadas) e células tratadas EV. Todas as medições foram feitas 24 horas após a estimulação e foram realizadas utilizando toda a população de células, isto é, 1 × 10

6 células /ml estimuladas durante 24 horas.

medição da alteração na secreção EMMPRIN Após vesículas Estimulação

o sobrenadante do controle, tampão tratada e EV tratada amostras foram coletadas para determinar se existem alterações na quantidade de EMMPRIN secretada com a estimulação. 100 ul de sobrenadante foi desglicosilada como descrito anteriormente, e as proteínas separadas usando electroforese em SDS-PAGE. secreção EMMPRIN foi medido usando análise de Western blot, conforme descrito anteriormente.

Actividade Ensaios

A secreção de MMP-9 e IL-6 foi medido em várias linhas celulares utilizando detecção de Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kits (ELISA Tech, Aurora, CO, EUA). No caso de células em suspensão, 5 × 10

5 células /ml foram utilizados por cada 0,5 mL de meio numa placa de 12 poços. Para as células aderentes, estimulações foram realizadas em placas de 12 poços com células a 70-80% de confluência. Todos os ensaios de actividade foram realizados em meio isento de soro. Os sobrenadantes das células estimuladas foram recolhidos no posto de estimulação de 24 horas e armazenados a -20 ° em C até ser necessário. 100 ul de sobrenadante foi aplicada à placa de ELISA. TGF-β1 é segregada sob a forma latente, por conseguinte, as amostras foram acidificadas até pH 2 utilizando uma M de ácido clorídrico (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA) e incubou-se durante uma hora à temperatura ambiente para gerar a forma imunorreactiva de TGF-β1 . As amostras foram, em seguida, neutralizada com 1 M de hidróxido de sódio (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA). 100 ul da amostra activada foi aplicada à placa de ELISA. As medições foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante (ELISA Tech, Aurora, CO, EUA).

Resultados

De Corpo Inteiro EMMPRIN serve como um marcador geral do SVE segregadas em fluidos biológicos, como também a partir de células cultivadas

a presença da forma EMMPRIN extracelular (s) foi avaliada em primeiro lugar em vários tipos de fluidos biológicos, incluindo soro humano, plasma, fluido de ascites e a determinar se EMMPRIN pode ser utilizado como um marcador geral da presença de VE como tem sido sugerido recentemente [16]. As amostras foram filtradas utilizando um filtro de 0,22 um para remover quaisquer células ou detritos celulares e imunoprecipitados (iped) utilizando um anticorpo EMMPRIN. Após desglicosilação, a forma de comprimento completo da proteína (28 kDa) foi detectada em soro humano e plasma de ambos os dadores saudáveis ​​e de doentes com cancro, bem como no fluido de ascites recolhidos de pacientes com cancro, sem níveis observáveis ​​de quaisquer formas clivadas dentro destes biológica fluidos (ver Fig. S1A e a Fig. S1B para o fluido ascite soros e humana, respectivamente). A análise por espectrometria de massa de digestões com tripsina foi usada para confirmar inequivocamente que é EMMPRIN na amostra de soro iped, Fig. S1C. Vários péptidos mapeamento para o ectodomínio de EMMPRIN foram detectados e usadas para confirmar a presença de EMMPRIN extracelular dentro das amostras de soro, Fig. S1C. A presença de uma proteína transmembranar de comprimento completo tal como aqui identificado EMMPRIN é consistente com uma secreção geral de proteínas transmembranares via VE em todos os fluidos biológicos, contudo isto foi mostrado adicionalmente no que se segue.

De modo a proporcionar uma consistente e fonte confiável de EVs para ensaios subsequentes para investigar directamente as suas funções estimuladoras, EVs foram purificados a partir de várias linhas celulares de cancro de mamíferos diferentes. EMMPRIN foi sondada para determinar se esta proteína transmembranar pode ser usado como um marcador geral de VE para todas estas linhas celulares análogas para os VE purificados a partir de fluidos biológicos como acima. Duas linhas celulares de cancro da mama, MCF-7 e MDA-MB-231, foram utilizados os VE e purificados a partir destas linhas celulares são denotados como EV

MCF-7 e EV

MDA, respectivamente. Além disso, tanto uma linha celular de leucemia monocítica, U937 e uma linha celular de cancro pancreático, L3.6pL, foram usadas com os VE derivadas destas linhas celulares designadas por EV

U937 e EV

L3.6pL, respectivamente. Sobrenadantes de células cultivadas nos meios de comunicação apropriados suplementado com antibióticos e 3% FBS livres EV foram coletadas a cada 48 horas.

Entre os métodos utilizados anteriormente empregadas para purificar EVs secretadas, optamos por utilizar cromatografia de exclusão de tamanho [27] . Especificamente, cromatografia de exclusão de tamanho Superose 6, foi utilizado para seleccionar para os grandes fracções de peso molecular, a Fig. 1A (caixa vermelha). EMMPRIN foi detectada na fracção EV recolhidos a partir de todas as linhas celulares testadas aqui, a Fig. 1B, indicando que a secreção EMMPRIN é um processo que ocorre amplamente.

A) de exclusão de tamanho de cromatografia perfil de eluição da purificação de meios condicionados para isolar os VE. A caixa vermelha corresponde ao pico de eluição para os EVs purificados. B) EMMPRIN é secretada através de VE em todas as linhas celulares testadas, como mostrado por Western blot sondado para EMMPRIN nas fracções de vesícula purificado usando cromatografia de exclusão de tamanho. C) nanopartícula análise de rastreamento detecta EVs na amostra purificada e valida o nosso método de exclusão de tamanho para purificar EVs partir de meio condicionado. microscopia D) Electron foi usado para visualizar os EVs secretados. Os dados mostrados são para EV

MDA.

Assim, nossos estudos aqui indicam que extracelular, comprimento total EMMPRIN secreção via EVs é um fenômeno que ocorre amplamente em vez de um processo específico tipo de célula e EMMPRIN pode ser utilizado como um marcador geral para a presença de EVs.

confirmação e Validação de EVs purificado utilizando nanopartículas Análise de rastreamento, Microscopia Eletrônica e espectrometria de massa

Foram utilizados vários métodos comumente utilizados para a detecção de EV e visualização para validar ainda mais o nosso método de purificação EV além da nossa presença confirmada de EMMPRIN como um marcador geral EV (Fig. 1A, B). Especificamente, a análise de nanopartículas de acompanhamento (NTA) foi utilizado para a determinação da distribuição do tamanho de VE em amostras. Com base na distribuição de tamanho das VE detectados utilizando NTA (Fig. 1C), pode concluir-se que as linhas celulares utilizadas neste estudo secretar uma população heterogénea de veículos eléctricos que variam em tamanho de 20-300 nm. A gama de tamanhos indicam que estas vesículas menores compreendem VE, conhecidos como exossomas (10-100 nM) e VE maior conhecida como microvesículas (100-1000 nm). Note-se que mais de fraccionamento em gradiente de sacarose e subsequente análise de mancha de Western identificou EMMPRIN em ambas as populações de EV (dados não mostrados), indicando que é um marcador EMMPRIN geral para ambos os tipos de veículos eléctricos. microscopia electrónica (ME) foi usada para visualizar os VE segregadas a partir de diferentes linhas de células, como mostrado para EV purificada

MDA (Fig. 1D). Os dados de EM mostraram também uma heterogeneidade no tamanho das vesículas foi determinado como com NTA. A análise de espectrometria de massa também originou a identificação de vários outros marcadores EV tais como CD63, CD81 e anexina V, tal como mostrado na Tabela 1, assim validar adicionalmente o método de purificação utilizado aqui. Assim, dada a distribuição de tamanho detectado com NTA e EM ea identificação de proteínas específicas EV, podemos concluir que o nosso método de purificação produz uma mistura de exossomos e microvesículas.

EVs são rapidamente internalizado em células receptoras

EV modulação da função do receptor de células tem sido proposto para ser pelo menos parcialmente dependente da sua captação inicial e transferência de carga (ver revisão por Lopez-Verrilli [28]). De acordo com um tal mecanismo proposto, verificou-se que os veículos eléctricos purificadas são internalizados em poucos minutos por células de leucemia monocítica THP-1 (Fig. 2) e células de leucemia U937 monocíticas (Fig. S4), confirmando assim a actividade biológica dos nossos VE purificadas. Especificamente, foi visualizada a internalização de VE coradas de vermelho do Texas como puncti distinta em células coradas com um anticorpo FITC-EMMPRIN que permitia a visualização da membrana celular (Fig. 2, à direita). Assim, nestas experiências utilizou-se o facto de que é inicialmente EMMPRIN altamente expresso na superfície da célula receptora como um marcador para a membrana celular. Imagens individuais através do volume da célula Z-pilhas foram recolhidas para confirmar que os veículos eléctricos são, de facto internalizado em vez de simplesmente localizada na superfície da célula. Nós também quantificada a percentagem de células que internalizaram a EVS, contando a frequência de células positivas EV. Dados a partir de uma média de três medidas independentes demonstra que a internalização de vesículas ocorre em 76% das células. Assim, vesícula internalização não é uma ocorrência rara, mas um evento frequente. Estes dados também mostram a localização de veículos eléctricos coradas de vermelho do Texas na membrana celular, o que indica que são provavelmente os VE incorporada ou associada com a membrana celular, bem como a ser internalizado.

imagens de microscopia de fluorescência de células THP-1 tratadas com vermelho Texas EVs manchadas. Painel esquerdo – THP-1 de células coradas com EMMPRIN FITC e DAPI. O sinal vermelho é o sinal de auto-fluorescência da célula. Painel central – THP-1 de células tratadas com o corante Vermelho do Texas sozinho. O sinal observado é o mesmo que na imagem esquerda e corresponde ao fundo vermelho Texas e sinal celular auto-fluorescência. Painel direito – células THP-1 tratadas com os VE coradas de vermelho do Texas e visualizadas depois de um período de incubação de 5 minutos. A membrana celular é manchado com anticorpo EMMPRIN-FITC, os EVs são mostrados em vermelho eo núcleo DAPI manchado é mostrado em azul. A barra de referência é de 10 m.

EVs estimular a secreção de diversos fatores associados ao câncer

ensaios de actividade inicial.

Nós inicialmente testadas várias linhas celulares destinatário para determinar que, se houver, as células cultivadas foram responsivo ao nosso EV purificada

MCF e EV

MDA. Especificamente, MMP-9 e a secreção de IL-6 (Fig. S2 e Fig. S3, respectivamente) foi monitorizada por estimulação com EV

MCF-7 e EV

MDA usando Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), uma vez que ambos estas proteínas são sobre-regulada em vários cancros, juntamente com o marcador de EMMPRIN VE [29], [30]. Em geral, os nossos dados mostram que não há selectividade preferencial no tipo celular desencadear uma resposta após estimulação EV. Por exemplo, as células monocíticas U937 foram mais sensíveis no que segregam IL-6 e MMP-9 após estimulação com VE, quando comparado com as células epiteliais. Fizemos observar um aumento na secreção de IL-6 em ambos HFF e células MBA-MB-231 após estimulação com EV

MDA, no entanto, nem a secreção de IL-6 ou MMP-9 foi estimulado com EV

MCF- 7. Assim, uma vez que as células U937 obtiveram as respostas mais notável por estimulação com ambos os tipos de veículos eléctricos utilizados nestes ensaios ELISA iniciais, nós nos concentramos em células monocíticas, THP-1 e U937, em ensaios de actividade subsequentes.

EVs purificadas estimular a secreção de EMMPRIN sugestivo de um ciclo de feedback positivo.

uma vez que estudos anteriores mostraram que EMMPRIN está envolvido em um loop de feedback positivo em algumas linhas celulares [31], o próximo queria avaliar o efeito dos EVs em expressão na superfície celular e a secreção de EMMPRIN em monócitos. As células THP-1 foram estimuladas com 10 ug de proteína total para cada tipo de vesícula, ou seja VE

MCF-7 e EV

MDA, e incubou-se a 37 ° C durante 24 horas.