Abstract

Salsaparrilha, também conhecido como

Smilax Glabra

Rizoma (SGR) , foi mostrado para modular a imunidade, proteger contra a lesão hepática, baixar a glicose no sangue e suprimem câncer. No entanto, seus efeitos sobre a adesão de células de câncer, migração e invasão não eram claras. No presente estudo, verificou-se que o sobrenadante de extrato solúvel em água do SGR (SW) poderia promover a adesão, inibir a migração e invasão de HepG2, MDA-MB-231 e as células T24

in vitro

, bem como metástase suprimir de células MDA-MB-231

in vivo

. Resultados de F-actina e vinculina dupla coloração revelou a adesão focal melhorada em células tratadas com SW. Microarray Analysis indicou uma repressão de sinalização de TGF-β1 por tratamento SW, o qual foi verificado por: em tempo real de RT-PCR dos genes e imunotransferência de proteína TGFBR1 relacionadas com TGF-β1. SW também foi mostrado para antagonizar a migração celular de TGF-β1-promovido. Colectivamente, o nosso estudo revelou uma nova função antitumoral do Sarsaparilla na luta contra invasão de um subconjunto de células cancerosas através da inibição da sinalização TGF-β1

Citation:. Ela T, Zhao C, Feng J, Wang L, Qu L, fang K, et al. (2015) Salsaparrilha (

Smilax Glabra

Rizoma) Extrato de Migração inibe e invasão das células cancerosas através da supressão de TGF-β1 Caminho. PLoS ONE 10 (3): e0118287. doi: 10.1371 /journal.pone.0118287

Editor do Academic: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, Coreia, República da

Recebido: 28 de junho de 2014; Aceito: 12 de janeiro de 2015; Publicação: 05 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ela et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability: dados Microarray tem foram depositados em NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (acesso. GSE58201), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58201.

Financiamento : o financiamento foi fornecido pelo Programa Nacional de Pesquisa básica da China (2010CB529303, 2013CB910504), https://www.973.gov.cn/Default_3.aspx. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Salsaparrilha, também conhecido como

Smilax Glabra

Rizoma (SGR), é um suplemento dietético natural amplamente utilizado na tomada de alimentos e cuidados de saúde, com base na sua capacidade em detoxicating, limpar o calor e aliviando humidade [1,2]. Algumas bebidas que contêm SGR, alimentos e suplementos dietéticos podem ser adquiridas no sudeste da Ásia e América do Norte. Os doentes com dermatite, sífilis ou artrite gotosa no sudeste da Ásia beneficiaram do tratamento de SGR contendo misturas de ervas para uma longa história [3,4]. Actualmente há também estão crescendo evidências científicas relatando o seu potencial terapêutico para o tratamento da artrite reumatóide [5], inflamação [6], lesão hepática [1], hiperinsulinemia [7] e cancro [8].

As funções de SGR são divididos principalmente em quatro aspectos, a saber, imunomodulador, hepato-protetora, tumoricida e outros. No aspecto imunomodulador, o extracto aquoso do SGR exerce uma inibição acentuada sobre o cloreto de picrilo (PCL) – ou células vermelhas do sangue de ovelha (SRBC) induzida pela hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) [6,9]. SGR actua principalmente sobre a resposta imune celular (CIR), a fase efectora de DTH em vez do que a resposta imunitária humoral (HIR), conferindo assim uma vantagem SGR superior a outros imunossupressores no tratamento de doenças inflamatórias mediadas por CIR como a hepatite e a artrite reumatóide [6,9 ]. Astilbina, um dos compostos bioactivos isolados de SGR, pode alterar o

in vivo

perfis de citocinas de linfócitos e suprimir a migração de células T ativadas, aliviando, assim, hipersensibilidade de contato e DTH [10,11]. No aspecto hepato-protector, astilbina facilita a apoptose dos linfócitos T que se infiltram no fígado e inibe a adesão de células-matriz de esplenócitos para minimizar danos no fígado [12,13]. Além disso, poderia melhorar a função do fígado, invertendo a elevação da transaminase, diminuindo a produção de TNF-α e reduzir a hepatotoxicidade de células não-parenquimatosas [12,14]. Taxifolina, outro composto isolado a partir de SGR, foi encontrada para alterar o metabolismo lipídico para aliviar a carga do fígado [15,16]. A função do SGR também se estende a outras funções biológicas, incluindo a reprimir a actividade de Helicobacter pylori [17], que abaixam a glicemia [2] e actividade redutora da integrase do VIH-1 [18]. Todas essas descobertas apontam para o potencial multifuncional da SGR.

No aspecto anticancerígeno, a ingestão oral de uma fórmula à base de plantas contendo SGR foi encontrado para aumentar o tempo sustentado de alívio da dor, melhorar a qualidade de vida dos pacientes e prolongar a longo sobrevivência a longo prazo de pacientes com carcinoma hepático [19]. Outra injecção contendo SGR foi descoberto para diminuir o crescimento do tumor em doses relativamente altas em modelos de ratos [20]. Extratos do SGR foram encontrados para promover a apoptose em câncer hepático humano HepG2 e HepG3 células [8,21] câncer colorretal humano HT-29,. Há também várias dicas que indicam os possíveis papéis de SGR no controle da adesão e migração celular. Astilbina pode suprimir a adesão de esplenócitos a matriz extracelular na ferida do fígado modelos ratos [14], e bloquear adesão intercelular entre as células T Jurkat humanos e ECV-304 células [13]. Além disso, o ácido 5-O-caffeoylshikimic, taxifolina e astilbina do SGR inibiu a migração e da adesão dos macrófagos [22]. No entanto, o papel directo de extracto SGR na capacidade de invasão de células de cancro não é claro e a base mecanística é inexistente. No presente estudo, foram avaliados os efeitos do sobrenadante do extracto solúvel em água de SGR (SW) na adesão, migração e invasão de três linhas de células de cancro, e investigaram o possível mecanismo.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

animal estudo foi aprovado pelo Biomedical Comitê de Ética do Hospital Peking University Instituto e realizada em função de orientações bem-estar animal institucional estabelecidos concordantes com as diretrizes dos Estados Unidos (NIH Publicação # 85-23, revista em 1985).

Materiais

Matrigel foi comprado de BD Biosciences (San Jose, CA). Os anticorpos para vinculina e TGFBRI foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) e Bioworld (Pequim, China), respectivamente. TGF-β1 foi da Sigma-Aldrich.

Preparação de SGR extrair

SGR foram obtidos a partir de Ben Fang do Cao Yuan Pharmaceutical Co. (Beijing, China). Os procedimentos para a preparação do sobrenadante de extrato solúvel em água do SGR (SW) foram descritos anteriormente [23]. A percentagem de rendimento para SW foi 7,27% (g /g). O solvente para a preparação de SW (solução de reserva) foi de 3% de DMSO em PBS, e a solução de DMSO em SW trabalhando era menor do que 0,15% (v /v).

cultura celular

HepG2, MDA-MB-231 e T24 células foram obtidas de ATCC (Rockville, MD) e cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), mais 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. Todos os reagentes para a cultura foram obtidos da Invitrogen (Carlsbad, CA).

A adesão celular ensaio

As células foram semeadas em placas de 6 cm e cultivadas com meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS ). Matrigel foi de 1: 100 diluído com meio isento de soro RPMI 1640 e adicionaram-se placa de 96 poços para permitir para revestir durante a noite a 4 ° C. No dia seguinte, as células foram tripsinizadas e recolhidas em meio isento de soro suplementado com doses indicadas de SW. Depois de drogas pré-tratamento durante 15 min (para células T24) ou 30 minutos (para as células MDA-MB-231 e HepG2), a suspensão de células foi então suplementado com FBS a 0,5% antes de serem semeadas em matrigel pré-revestidas placas de 96 poços a a densidade de 2 × 10

4 por poço e deixadas a aderir durante 2 h. Depois de remover as células não aderentes por PBS, as células aderentes foram fotografados com o sistema CloneSelect Imager (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Nove campos microscópicos de cada poço foram capturados aleatoriamente e as células foram contadas utilizando software Image Pro Plus.

migração Transwell /invasão ensaio

Para o ensaio de migração, as células foram semeadas em placas de 10 cm. No dia seguinte, as células foram colhidas em meio isento de soro e dividida em três partes iguais. Depois de cada parte foi suplementada com doses indicadas de SW, metade da suspensão de células foi adicionado ao poço superior da inserção Transwell (Corning Inc., Corning, NY, EUA) a uma densidade de 1 × 10

4 (para células T24 e HepG2 ) ou 5 x 10

3 (para as células MDA-MB-231) por poço. O poço inferior, adicionou-se meio RPMI 1640 contendo 10% FBS a forma como atractores quimiotáticos. A metade restante da suspensão de células foi então semeadas em placas de 96 poços para ensaio de viabilidade. Após incubação de 12 h, as células que tenham penetrado no lado inferior da membrana Transwell foram coradas com violeta de cristal e fotografado sob microscópio. 14 campos microscópicos foram capturados e contadas aleatoriamente. Para avaliar o efeito de TGF-β1 sobre a migração celular, as células foram privadas de meio RPMI 1640 contendo FBS a 0,5% durante 24 h e, em seguida, recolhidos por tripsinização. suspensão celular foram divididos em quatro partes iguais e cada parte foi suplementado com solvente, 5 ng /ml de TGF-β1, 1,5 ug /uL SW SW ou mais TGF-β1. Após adição de metade da suspensão de células que contém o fármaco no poço superior da Transwell Insert, a suspensão de células remanescente foi adicionado em placas de 96 poços. Ambas as placas foram incubadas durante 12 h. As placas Transwell foram usadas para o ensaio de migração e as placas de 96 poços para ensaio de viabilidade celular. Para o ensaio de invasão, uma camada de Matrigel (1: 4 de diluição em meio isento de soro) foi pré-revestida no poço superior da Transwell Insert antes das células adicionando, e as células foram incubadas durante 36 horas antes da coloração com violeta de cristal. Os procedimentos de descanso foram os mesmos como ensaio de migração.

ferida celular ensaio curando

Duas linhas paralelas foram desenhada no lado de trás das placas de 12 poços com uma caneta de marcador antes da semeadura célula. No dia seguinte, o meio de cultura foi removido e substituído por 0,5% de FBS /RPMI 1640. 24 h mais tarde, uma linha ferida reta que era perpendicular a essas linhas paralelas foi traçada através da camada de células anexado com pontas de pipeta. Portanto, a diferença ferida entre duas linhas paralelas foi marcado. Depois de remover as células flutuantes com PBS, indicado doses de SW foram adicionados em cada cavidade. Fotos foram tiradas da diferença marcada a cada 6-8 h até a ferida fechada. As lacunas feridas foram digitalmente quantificados utilizando software Image Pro Plus.

Animal modelo

7 a /ratos de 8 semanas de idade, do sexo feminino Balb c nu (Vital Laboratories River, Beijing, China) foram injectado através da veia da cauda com 1 × 10

6 células MDA-MB-231. No dia seguinte, os ratos (n = 8 para cada grupo) foram administrados por via oral com 72,7 mg SW (preparado em PBS, é igual a 1 g de SGR) ou PBS por dia. Após duas semanas, os ratos foram mantidos durante mais 3 semanas antes de serem sacrificados para recolha do pulmão e fígado. Hematoxilina e eosina (H E). Coloração foi utilizada para monitorar e contar focos metastáticos no pulmão ou fígado

Medição da proliferação das células

As células tratadas com o solvente ou SW foram semeadas em 96 cavidades placas e incuba-se. taxa de confluência celular foi quantificada utilizando o sistema CloneSelect Imager.

Western blot

As células expostas a SW para tempos indicados foram colhidas em tampão de lise contendo Tris-HCl 50 (pH 7,0), 150 mM de NaCl , 2 mM de EDTA, 1% de SDS, ditiotreitol 2 mM (DTT) e um cocktail de inibidores de protease × (Roche, Mannhelm, Alemanha) e, em seguida, submetida a ultrassons durante 30 segundos em gelo. A concentração de proteína foi determinada pelo kit BCA (Pierce, Rockford, IL). Os lisados ​​celulares (30 ng por amostra) foram separados em 8% -15% de SDS-PAGE antes de ser electrotransferidas para membranas de nitrocelulose. Após o bloqueio com leite magro a 5% em 0,1% de Tween 20 /TBS (TBST), as membranas foram sondadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C e depois sondado com anticorpos secundários marcados com HRP durante 45 minutos à temperatura ambiente (TA). Os sinais foram detectados por um sistema de quimioluminiscência melhorado de Pierce (Rockford, IL).

Imunofluorescência

As células foram semeadas em lamelas de esterilizados. No dia seguinte, SW foi adicionado e as células foram incubadas durante o tempo indicado. No final da experiência, as células foram fixadas com 4% de paraformaldeído durante 20 min à temperatura ambiente antes de ser permeabilizadas com 0,1% de Triton-X-100 em PBS durante 4 minutos. Após o bloqueio com BSA a 5% /PBS durante 1 h, as células foram incubadas com anticorpo anti-vinculina (1: 100) durante a noite a 4 ° C e, depois, misturas TRITC-conjugados segundo anticorpo anti-ratinho e faloidina marcada com FITC (Sigma) durante 1 h à temperatura ambiente. Os núcleos foram corados com DAPI antes de capturar imagens através da Leica TCS SP5 confocal laser de microscópio.

Análise de adesão focal

A intensidade do sinal vinculin ea área de adesão focal foram analisados ​​pelo Adobe Photoshop CS5 e software Pro Plus imagem. Em primeiro lugar, as imagens Vinculina-coradas foram dessaturadas, invertida e de-propalado usando software Photoshop para produzir pegadas de adesão. Em seguida, estas pegadas contendo vinculina foram ainda seleccionados por thresholding em software Image Pro Plus. Através de calibragem, a área ea intensidade de pegadas contendo vinculina foi quantificada utilizando o comando “contagem /tamanho”. Um total de 50 células foram analisadas em cada grupo.

análise de microarray e em tempo real de RT-PCR

O ARN foi extraído a partir de células HepG2 tratadas com SW (1,5 ug /uL), utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) e o ADNc foi sintetizado utilizando o sistema de transcriptase reversa (Promega, Madison, WI). perfis de expressão gênica foram examinados pela Shanghai Biotechnology Corporation (Xangai, China) usando microarrays 1.0st gene humano Affymetrix. dados de Microarray foi depositado no NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (acesso. GSE58201). Após Multi-matriz robusta Média (RMA) normalização,

P

valor 0,05 e do limiar 1.5 foram identificados como sendo alterações estatisticamente significativas. KEGG, GO e Gene Cards (https://www.genecards.org/) foram utilizados para selecionar a genes que foi relacionadas à adesão celular, migração e invasão. Em seguida, esses genes foram colocados em banco de dados STRING para via de sinalização de busca. Em tempo real de RT-PCR foi utilizado para validar os resultados da micromatriz e realizada de acordo com as instruções do fabricante (SYBR, TOYOBO). Os níveis de expressão de todos os genes foram normalizados por meio de

gene GAPDH e do

2

-ΔΔCT método foi utilizado para calcular a expressão do gene relativo. Os primers para real-time RT-PCR (

TGFBR1

, para a frente, 5′-CCTGGGATTTATAGCAGCAGAC-3 ‘, reverso, 5′-TGACACCAACCAGAGCTGAG-3’;

NTS

, para a frente, 5 ‘ -ATTAGTAAAGCACATGTTCC-3 ‘, reverso, 5′-CTCCCAGTGTTGAAAAGCCC-3’;

ID1

, para a frente, 5′-GAGCTGAACTCGGAATCCGAAG-3 ‘, reverso, 5′-GATCGTCCGCAGGAACGCATGC-3’;

ID2

, para a frente, 5′-TCAGCCTGCATCACCAGAGA-3 ‘, reverso, 5′-CTGCAAGGACAGGATGCTGATA-3’;

ID3

, para a frente, 5′-CTGAGCTTGCTGGACGACA-3 ‘, reverso, 5′-ATGTAGTCGATGACGCGCTGTA-3’) foram sintetizados por GenePharma (Xangai, China).

A análise estatística

A análise dos dados foi realizada usando SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). Bicaudal teste t de Student e ANOVA foram usados ​​para determinar a significância das diferenças entre os diferentes grupos experimentais.

Resultados

SW aumenta a adesão celular

Para testar o efeito de SW na capacidade de células cancerosas de se ligar à matriz extracelular, foi realizado ensaio de adesão de células utilizando a linha de células de hepatoma HepG2 (Fig. 1A), linha celular de cancro da mama MDA-MB-231 (Fig. 1B) e linha celular de cancro da bexiga T24 (Fig. 1C). Verificou-se que a adesão de células HepG2 para Matrigel foi aumentada de 0,7 mg /mL de SW (Fig. 1A), enquanto efeito da mesma concentração de SW na adesão de células MDA-MB-231 foi marginal (Fig. 1B) . Pelo contrário, o aumento da adesão foi mais evidente nas células T24 e a maior adesão foi conseguida por tão baixo como 0,07 ug /ul de SW (Figura 1C.)

painéis da esquerda:. HepG2 (A), MDA-MB-231 (B) e células T24 (C) foram pré-tratados com as doses indicadas de SW para 15 ou 30 minutos antes da sementeira para os poços revestidos com Matrigel, e 2 h mais tarde, as células aderentes foram contadas depois de remover as células flutuantes PBS. Imagens representativas foram exibidos. barra de escala, de 200 mm. painéis da direita: quantificação dos dados, no painel esquerdo, mostrados foram resultados compostas de três independentemente experimentos com triplicado. Colunas, quer dizer; bares, SD.

SW inibe câncer de migração celular

Em seguida, foi realizada

in vitro

ensaio de zero. As células foram pré-incubadas em meio com FBS a 0,5% durante 24 h, antes da introdução do zero, a fim de excluir o impacto da FBS sobre a proliferação celular. A cicatrização de feridas foi monitorada em intervalos regulares, até que se fechou. Observou-se que SW levou a um abrandamento da migração em células HepG2, a MDA-MB-231 e células T24 (Fig. 2A, B e C), com MDA MB-231 que mostra o efeito inibidor mais óbvia (Fig 2B. ). Percebemos que era necessário tempo diferente para diferentes linhas de células para curar as feridas. Além disso, a mesma concentração de SW exibiram inibição distinta na cicatrização de feridas em diferentes linhas celulares. Isto poderia ser explicado pela especificidade linhagem celular em migração. Considerando-se a rugosidade e subjetividade do ensaio zero, nós também utilizado transpoço ensaio de migração. As células que foram bem sucedidas em espremer através dos micro-orifícios da membrana de base, no grupo tratado com SW foram marcadamente menos do que aqueles do grupo de controlo (Fig. 3A, B e C, para a esquerda e painéis de meia), com pouca influência sobre a viabilidade celular (Fig. 3A, B e C, painéis direitos). Estes resultados apontam para a acção inibidora de SW na migração de células de cancro.

In vitro

zero ensaio foi utilizado para avaliar o efeito de SW na migração de células HepG2 (A), MDA-MB -231 (B) e T24 células (C). Imagens representativas foram exibidos no painel esquerdo; quantificação dos dados no painel esquerdo foi mostrado no painel à direita, mostrado resultados eram compostas de três experiências independentemente com amostras paralelas em triplicado. O índice de migração representa a velocidade de migração em relação ao grupo controle. Colunas, quer dizer; Barras, DP.

HepG2 (A), células T24 (B) e células MDA-MB-231 (C) foram semeadas na inserção Transwell na presença de doses indicadas de SW, durante 12 h. As células que atingiram o lado inferior da membrana Transwell foram coradas e imagens representativas foram exibidos no painel superior. barra de escala, de 200 mm. Os dados no painel à esquerda foram quantificadas e mostradas no painel do meio, e a viabilidade celular foi reflectida pela taxa de confluência de células no painel da direita. Mostrado foram resultados compostas de duas independentemente experimentos. Colunas, quer dizer; bares, SD; NS, não é estatisticamente significativa.

SW inibe a invasão da célula cancerosa

in vitro

e metástase

in vivo

Nós também testou o efeito do SW na invasão de células de cancro. Ainda, foi utilizado o mesmo dispositivo de carregamento Transwell mais uma camada de matrigel sobre a membrana de base. Como esperado, o tratamento SW impediu todas as três linhas de células de invadir através da Matrigel para atingir o lado inferior da membrana de base (Fig. 4A, painel superior e o painel inferior esquerdo). Além disso, 36 h de exposição a doses indicadas de SW exercida inibição insignificante sobre a proliferação celular (Fig. 4A, painel inferior direito). Para melhor avaliar o efeito de SW na metástase

in vivo

, foi utilizado MDA-MB-231 modelo de camundongos metastático. Como mostrado na Fig. 4B, a administração oral de SW durante 2 semanas diminuiu marcadamente o número de focos metastáticos do pulmão. Não fígado focos metastáticos foram observadas em ambos os grupos (S1 Fig.)

(A) As câmaras Transwell foram pré-revestidas com 60 ul de diluição matrigel (1: 4 em meio isento de soro). Antes que as células semeadura. As células foram incubadas com as doses indicadas de SW durante 36 h antes da coloração. Imagens representativas foram exibidos no painel superior. barra de escala, de 200 mm. Os dados de migração e viabilidade celular foram quantificadas e mostrado, respectivamente, no painel inferior, mostrado foram resultados compostas de duas independentemente experimentos com triplicado. Colunas, quer dizer; bares, SD; NS, não é estatisticamente significativa. (B) Painel esquerdo: imagens representativas de H tecidos pulmonares E manchado em PBS e grupo tratado com SW. pulmões embebidos em parafina foram seccionados em intervalos e 10 células de cancro MDA-MB-231 foram identificados como focos metastáticos. Ampliação, x 4 (superior) e 20 × (inferior). Painel da direita: quantificação de focos metastáticos do pulmão em PBS e o grupo de ratinhos tratados com SW (n = 8 para cada grupo). Colunas, quer dizer; bares, SD.

SW aumenta a adesão focal

Foi relatado que o número eo tamanho das adesões focais foram inversamente proporcional à velocidade de migração [24]. Para isso, realizada a coloração fluorescente dupla de F-actina e vinculina para avaliar o efeito, se houver, do SGR na adesão focal [20,24,25]. Após exposição a SW, durante 0,5 h, as células HepG2 e T24 começou a exibir o sinal mais forte vinculina principalmente em torno da periferia de células, exibindo uma forma semelhante fascículo ou local semelhante (Fig. 5A). Correspondentemente, grandes fibras de stress em todo o corpo da célula foram perdidos, com fibras de F-actina mudando gradualmente para a periferia celular e de co-localizar ali com vinculina bem. Foram quantificados as áreas e intensidades fluorescentes de sites de adesão. Como mostrado na Fig. 5B, a área de adesão por célula elevado em 0,5 h e atingiu um planalto a h em células HepG2 tratadas com SW, enquanto que já alcançado pico a 0,5 h após o tratamento SW em células T24. Foram obtidos resultados semelhantes em intensidade quantificação (Fig. 5C).

células HepG2 e T24 (A) foram tratados com SW (3,5 ug /uL) para os tempos indicados e, em seguida, imuno-coradas com F-actina (FITC -phalloidin) e vinculina (vermelho). Os núcleos foram contrastadas por DAPI (azul). Imagens representativas foram exibidos. barra de escala, 100 mm. (B) A área de sítios de adesão por célula (onde F-actina e vinculin mesclados). Mostrado resultados eram compostas de duas experiências, independentemente, (n = 50 células). Colunas, quer dizer; Barras, DP. (C) A intensidade de fluorescência da vinculina nas manchas de adesão por célula. Mostrado resultados eram compostas de duas experiências, independentemente, (n = 50 células). Colunas, quer dizer; bares, SD.

SW antagonizar TGF-β1-induzida aumento da regulação de genes relacionados à invasão

Para obter uma compreensão mais profunda do possível mecanismo subjacente a todos esses resultados, realizamos uma análise de microarray expressão do gene com células HepG2 tratadas com SW. Nós descobrimos que havia 118 genes com mais do que 1,5 vezes a mudança de expressão nas células tratadas com SW, alguns deles estavam relacionados com a motilidade celular, metabolismo, e stress oxidativo (Fig. 6A). Em seguida, analisou-se um subconjunto de genes associados com a capacidade de invasão de células de banco de dados usando STRING. Como mostrado na Fig. 6B, a maior parte destes 12 genes foram directa ou indirectamente regulada pela via TGF-β1, indicando que a via de TGF-β1 pode estar envolvido em fenótipos regulada-SW. Real-time RT-PCR foi realizada para níveis de expressão avaliadas de 5 genes, ou seja,

TGFBR1

,

NTS

,

ID1

,

ID2

, e

ID3

em células HepG2 e T24 tratados com TGF-β1 com ou sem SW. SW sozinho diminuição dos níveis de

NTS

,

ID1

,

ID2

, e

ID3

em células HepG2 e

TGFBR1

,

NTS

,

ID1

, e

ID2

em células T24. Por outro lado, TGF-β1 elevou significativamente os níveis de mRNA destes genes em ambas as linhas celulares (Fig. 6c), confirmando que estes genes são a jusante de sinalização de TGF-β1. No entanto aumento, induzido por TGF-β1 maioria dos na expressão do gene foi neutralizada pelo tratamento concomitante com SW, excepto para

ID1

em células HepG2 (Fig. 6C). Além disso, observou-se níveis de proteína-regulada de TGFBR1 em células HepG2 e T24 tratadas com TGF-β1, que foi revertida por SW (Fig. 6D). Para confirmar ainda mais o efeito inibidor de SW na sinalização de TGF-β1, foi avaliado o efeito de SW na migração induzida por TGF-β1. Como mostrado na Fig. 7, a migração promovida TGF-β1-se marcadamente revogada por SW em HepG2, MDA-MB-231 e células T24, enquanto que a viabilidade celular não foi afectada por SW (Fig. 7A, B e C).

(A ) o mapa de calor do enriquecimento funcional de genes diferencialmente expressos a partir do resultado de chips HepG2. Cluster 3.0 e software TreeView foram utilizados para gerar o mapa de calor. Vermelho:-regulação contra a dizer; verde: down-regulação em relação dizer. (B) A rede de regulação entre os genes relacionados com a adesão, migração e invasão em (A) utilizando a base de dados STRING. (C) em tempo real de verificação de RT-PCR dos genes em células HepG2 e T24 tratadas com TGF-β1 com ou sem SW. Mostrado foram resultados compostas de três independentemente experimentos com triplicado. Colunas, quer dizer; Barras, DP. (D) Efeito de TGF-SW na β1 induzida por sobre-regulação de TGFBR1 foi avaliada por imunotransf erência. Mostrado foram Resultados representativos de 3 expericias independentes.

HepG2 (A), MDA-MB-231 células T24 (C) (B) e foram semeadas em inserções Transwell os na presença de TGF-β1 além de SW. 12 h mais tarde, as células foram coradas e retratado. Imagens representativas foram exibidos no painel da esquerda. barra de escala, 100 mm. Os dados de migração foram quantificadas e mostradas no painel do meio. A viabilidade celular foi reflectida pela taxa de confluência de células no painel da direita. Mostrado foi resultado compostas de duas independentemente experimentos com triplicado. Colunas, quer dizer; bares, SD; NS, não é estatisticamente significativa.

Discussão

SGR, também conhecida como salsaparrilha, foi relatado para mostrar anticâncer em potencial [8,21]. Vários SGR contendo fórmulas à base de plantas utilizadas no Sudeste Asiático foram comprovadas para inibir o cancro

in vitro

e

in vivo

[20,26]. A maioria dos estudos anteriores focada no efeito inibitório do SGR sobre o crescimento de células de cancro, e apenas alguns avaliado o seu efeito sobre a capacidade de invasão das células cancerosas. A fórmula à base de plantas contendo SGR foi mostrado para suprimir a metástase de carcinoma do pulmão [27]. Os compostos isolados a partir de SGR, isto é, 5-O-caffeoylshikimic ácido, taxifolina e astilbina, mostraram ter efeito inibidor na adesão e /ou migração de células imunitárias [22]. Em estudo anterior, verificou-se a inibição do crescimento de células de SGR foi um efeito relativamente de longo prazo ( 24 h) sob doses elevadas [21]. No presente estudo, nós, pela primeira vez, relatou o efeito inibidor do extracto de SGR na invasividade de três células cancerosas, provavelmente através da supressão da via de TGF-β1. Deve ser mencionado que todas as

In vitro

experimentos foram realizados com doses baixas de SW dentro de curto prazo para minimizar o viés resultaram da inibição do crescimento induzida pelo SW.

adesão focal é a estrutura básica unidade de módulo de adesão celular, quaisquer alterações na sua estrutura ou composição pode influenciar a força de adesão de células em toda a [24,25]. A formação de adesão focal passa por várias etapas, incluindo a adesão nascente, complexo focal e adesão focal, em seguida, [25]. A dimensão e maturidade de adesões focais foram relatados para ser inversamente correlacionado com a velocidade de migração de células [24]. No presente estudo, observou-se uma mudança gradual das manchas de adesão do corpo celular para perímetro celular em células HepG2 e T24 tratada-SW, com o sinal mais forte e vinculin tamanho maior aderência sobre o córtex celular. Este fenómeno foi, pelo menos em parte, devido a uma mudança de espaço e dirigida ao local de proteínas relacionadas com a adesão, especialmente em células T24. Curiosamente, induzidas SW aderências periféricos grandes e firmes se assemelhavam aos quinase de adesão focal (FAK) células -deficient [25,28]. Além disso, as células falta tanto tirosina fosfatases como quinases SHP-2 ou o Src também exibiu um padrão de adesão semelhante [24,29]. Assim, a danificação da FAK-Src via pode mediar este efeito induzido-SW, que requer uma investigação mais aprofundada.

O resultado de chips indicou uma repressão da sinalização TGF-β1 em células tratadas-SW. Genes incluindo

HMOX1

[30,31],

PSAT1

[32],

TGFBR1

[33],

EDNRA

[34,35],

NTS

[36,37],

ID1

[38,39],

ID2

[40,41] e

ID3

[42,43 ], todos relacionados com a adesão celular, a migração e a invasão, foram directamente ou indirectamente regulada pela via de sinalização de TGF-β1. A inactivação do domínio de cinase do TGFBR1 poderia impedir a sinalização de TGF-β1 de propagação para baixo [33]. Enquanto isso, a revogação da sinalização TGF-β1 usando TGFBR dominante negativo poderia bloquear interruptor epitelial-mesenquimal de transição (EMT)

in vivo

[44], sugerindo que a supressão de TGFBR pode fornecer um meio viável para reprimir sinalização TGF-β1 . No presente estudo, induzida por TGF-β1 TGFBR1 foi diminuída por SW. Além disso, SW revogada impulso induzida por TGF-β1 em migração, o que confirma o efeito inibitório de SW na via de TGF-β1.

Deve ser mencionado que a sinalização de TGF-β1 foi encontrado para aumentar a adesão celular e promover a adesão focal [45], a adesão celular, portanto, induzida por SW e adesão focal pode contar com mecanismos distintos. Isto levanta a possibilidade de que a capacidade de invasão de células de cancro SW-inibiu os efeitos poderiam ser integrados vários eventos de sinalização. Outras vias também foram previstos para ser afectado por SW na análise de microarray, tais como o metabolismo e o stress oxidativo. Estudos recentes destacar as contribuições do metabolismo desregulado e estresse oxidativo a capacidade de invasão de células de câncer [46,47]. Se SW poderia utilizar estas vias para regular a capacidade de invasão de células de câncer merecem uma investigação mais aprofundada.

Juntos, encontramos SGR poderia promover a adesão celular, possivelmente aumentando o tamanho ea força de adesões focais, e inibir a migração e invasão de HepG2, MDA células -mb-231 e T24. Repressão de TGF-β1 sinalização parcialmente contribui para a inibição da migração induzida por SW. Embora estes resultados foram obtidos a partir de um subconjunto de linhas celulares de cancro, a nova função anti-câncer da SGR pode fornecer uma base molecular possível para a sua futura aplicação clínica no tratamento do câncer.

Informações de Apoio

S1 Fig. Não foi observada focos metastáticos no fígado de ratinhos

representativos de imagens de H . E coradas tecidos hepáticos em PBS e o grupo tratado com SW. fígados embebidos em parafina foram seccionados a intervalos de 30 mm e 10 células de cancro MDA-MB-231 foram identificados como focos metastáticos. barra de escala, 200 mm, ampliação, × 10

doi:. 10.1371 /journal.pone.0118287.s001

(TIF)