Abstract

E74-like factor de 5 (Elf5) tem sido associada com a supressão do tumor no câncer de mama. No entanto, seu papel no câncer urotelial (UC) é completamente desconhecido. A imuno-histoquímica (IHQ) e metilação PCR específico (MSP) foram realizados para detectar o nível de expressão Elf5 e sua metilação do promotor. Os resultados revelaram que a baixa expressão de Elf5 em proteína e níveis de mRNA foram associados com a progressão tumoral, recidiva precoce e baixa sobrevida. In vitro, a regulação negativa de Elf5 pode aumentar a transição epitelial-mesenquimal (EMT). Aberrantes de metilação Elf5 foi identificado como um importante mecanismo para o silêncio gene Elf5. Por conseguinte, a restauração de Elf5 por infecção ou tratamento desmetilação efectivamente invertida processos EMT. Em conclusão, nós identificamos Elf5 como um novo biomarcador da UC em vários níveis biológicos e estabeleceu uma ligação causal entre a Elf5 e EMT na UC

Citation:. Wu B, Cao X, Liang X, Zhang X, Zhang W , Sun G, et al. (2015) regulação epigenética da Elf5 está associado com epitelial-mesenquimal Transição em câncer urotelial. PLoS ONE 10 (1): e0117510. doi: 10.1371 /journal.pone.0117510

Editor do Academic: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, United States |

Recebido: 01 de agosto de 2014; Aceito: 29 de dezembro de 2014; Publicação: 28 de janeiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability: Nossos dados são na verdade, obtido a partir do terceiro (Tianjin Instituto de Urologia), mas eles só estão disponíveis mediante solicitação por causa das restrições éticas impostas pela segunda Hospital da Universidade de Medicina de Tianjin. Os leitores podem entrar em contato com Dongwen Wang ([email protected]) para solicitar os dados

Financiamento:.. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses: Os autores declararam que nenhum existem interesses conflitantes.

Introdução

A EMT afeta as etapas críticas de mudanças marcantes na adesão celular, polaridade e migratório por interconversão de células epiteliais em células mesenquimais com /célula (SC) estado [1-tronco, 2,3]. EMT e do seu programa reversa, mesenquimal-epitelial (MET), foram ativados nas células tumorais e este progresso ativar essas células para adquirir características celulares associadas com alto grau, invasão e recorrência [3,4,5]. Dada a complexidade e a natureza dinâmica da EMT, é impossível de ser mantida por uma única via de sinalização. TGF-β, Wnt, Notch, Sonic Hedgehog, EGF e vias FGF foram provou ser importante para que rege estas transições no desenvolvimento e progressão do câncer [2,3,6,7]. Mais recentemente, modificações epigenética como a metilação /desmetilação também têm sido mostrados para ser envolvido na EMT [8,9,10]. No entanto, os mecanismos de sinalização que induzem e manter esta mesenquimais estado /SC ainda permanecem obscuros.

Elf5 é um membro do subgrupo específico epitélio da grande E-vinte e seis fator familiar (ETS) da transcrição. Provou-se como determinante de transcrição chave da linhagem do cancro da mama por suprimir sensibilidade estrogênio em células luminais e melhorar características basais em células de cancro da mama basal [11]. Estudos mais recentes mostram Elf5 é não só como um regulador chave da linhagem celular, mas também como um supressor de EMT reprimindo a transcrição de Snail2 [12]. Além disso, Elf5 silenciamento do gene é desencadeada por hipermetilação do promotor dinâmica nos processos de desenvolvimento e formação de placenta humana linhagem de células embrionárias [13,14]. No entanto, os papéis de Elf5 em câncer urotelial (UC) desenvolvimento e progressão permanecem indefinidos.

bexiga UC é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo, com cerca de 386.000 novos casos em 2008 e cerca de 150.000 mortes [15]. No primeiro diagnóstico de UC, cerca de 80% dos pacientes apresentam-se com não-muscular câncer de bexiga invasivo (NMIBC), enquanto os demais com doenças musculares invasiva [16,17]. Destes pacientes com NMIBC, 50% -70% terão pelo menos uma recorrência em 5 anos, e mais de 20% apresentam infiltração muscular [18] e causar uma taxa de mortalidade de até 50% no prazo de 2 anos de diagnóstico [19] . O problema associado com a UC é o seu potencial altamente imprevisíveis para a recorrência e progressão. Por isso, queríamos determinar se inativação epigenética de Elf5 está associada com a progressão da UC e recidiva precoce

Materiais e Métodos

declaração de Ética, pacientes e amostras

Os grupos 1.:

Um total de 182 amostras de UC da bexiga embebidos em parafina fixadas em formalina foram obtidos entre os 275 pacientes consecutivos entre 2004 e 2008 a partir dos departamentos de patologia de Tianjin Instituto de Urologia (Tabela 1). Também foram obtidos 10 contemporânea urotélio normal, embebido em parafina fixado em formalina (NU). Entre os pacientes analisados, 115 bexigas principais UCs ​​foram submetidos a ressecção transuretral de tumor de bexiga (TURBT) (

Cohort 1A

) e permaneceram 67 pacientes foram submetidos a cistectomia radical (

Cohort 1B

). Nenhum dos pacientes primários recebeu qualquer tratamento anticâncer pré-operatório. informações de acompanhamento foi obtido a partir dos prontuários de pacientes que preencheram os critérios de inclusão no estudo. Em resumo, os pacientes apresentaram no pós-operatório a cada 3 meses para os primeiros 2 anos após a terapia e semestralmente depois. A recidiva foi definido como um novo tumor observado na bexiga após TURBT. sobrevida livre de recidiva (RFS) foi calculado como o tempo desde TURBT à data de recorrência. sobrevida específica de doença (DSS) foi calculado como o tempo desde a cistectomia radical para a data da morte da UC. O seguimento médio foi de 49,4 meses (variação de 6 a 90) e 56,4 meses (intervalo de 6-106) em

Cohort 1A

e

Cohort 1B

, respectivamente.

coorte 2:

Uma série de 10 NU e 50 tecidos UC foram obtidos de registro retrospectivo de Tianjin Institute of Urology. Estes tecidos foram flash-congelados em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C entre 2010 e 2013. Não houve recidiva confirmada e morte no estudo.

Os diagnósticos patológicos e os fatores clínico-patológico dos dois coortes foram estabelecidos com base na orientação geral para câncer de bexiga primária, tal como definido pela classificação 2002 TNM e 1973 sistema de classificação da OMS por patologistas experientes. O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Segunda Universidade Médica Tianjin, e consentimento informado por escrito para o uso das amostras de cada paciente inscrito foi obtido em conformidade. Todas as amostras de tecido e gravar dados médicos foram anónimos antes de o acesso e análise pelos pesquisadores.

Cultura celular e tratamento

As linhas de células de bexiga humanos UROtsa, RT112, HT1376, J82 e T24 foram originalmente obtido a partir do ATCC. A linha de células EJ foi um presente do Dr. Ruifa Han (Tianjin Medical University, China. Ele obteve a linha de células a partir da ATCC). UROtsa foi cultivada em DMEM (Gibco, Xangai). HT1376 foi cultivada em Mínimo de Eagle Essential Médium (EMEM, ATCC). Outras linhas de células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Gibco, Xangai). Todos os meios de cultura foram suplementados com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS, Gibco, Melbourne) e 1% de penicilina /estreptomicina. infecção por micoplasma foi regularmente testados usando o PlasmoTest

TM (Invivogen, San Diego, CA). Quando necessário, as células foram tratadas com 5 uM 5-aza-2′-desoxicitidina (5-Aza, Invivogen) de acordo com a concentração previamente determinada durante 6 dias de incubação [20,21].

extracção de ARN e RT -PCR

o ARN foi isolado utilizando o GenElute (Sigma-Aldrich, Xangai) de acordo com as instruções do fabricante. transcrição reversa foi realizada utilizando transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Xangai). RT-PCR foi realizada em um BioRad iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories) máquina de PCR (Applied Biosystem) utilizando SYBR Verde Mistura Mestre. Os conjuntos de iniciadores específicos para o gene foram utilizados a uma concentração final de 0,2 � e as suas sequências estão listadas na Tabela S1. Cada amostra foi corrida e analisadas em triplicado.

Bissulfito-modificação e MSP

O ADN genómico foi obtido a partir de amostras de tecido utilizando DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) seguindo o protocolo do fabricante. O DNA extraído foi tratado com bissulfito para converter citosinas não metiladas em uracilos, antes da reacção em cadeia da polimerase-metilação específico (MSP) usando EpiTect Bissulfito Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. DNA modificado foi amplificada utilizando iniciadores de MSP (S1 Tabela), que o reconhecimento específico ou o não metilado (tamanho do produto 258 bp) ou metilados (258 pb) Elf5 sequência promotora após a conversão de bissulfito. ADN normal do apêndice vermiforme humanos foi tratada in vitro com SSSI metiltransferase (New England Biolabs, Beverly, MA) para gerar um controlo positivo para os alelos metilados [22].

IHC coloração

incluídas em parafina seções embutidos (4μm) foram desparafinados e hidratada em xileno seguida de álcoois graduados para a água. A recuperação antigênica foi realizada em citrato 0,01 M de duas vezes 10 minutos em um forno de microondas seguido por um 60 min arrefecer. As lâminas foram então incubadas com vários anticorpos primários seguido de Envision-plus (ponte Zhong Shan ouro, Pequim) marcado polímero conjugado com peroxidase de rábano e coloração monitorização DAB. Em seguida, as lâminas foram contrastadas e desidratada para visualização e tratamento de imagens. Os anticorpos foram:. Anti-Elf5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-caderina-E (Abcam, Cambridge, MA), anti-N-caderina (Abcam), anti-vimentina (Abcam)

Scoring de IHC coloração

pontuação Elf5: A secção inteira foi avaliada por dois respectivos observadores não ter conhecimento dos dados clínicos. As células tumorais foram determinados positiva quando uma coloração claramente visível foi detectado no núcleo. NU tecidos foram incluídos para ser como controlos internos. Percentagem de células positivas para a coloração foi classificada como sendo de 1% a 100% com um intervalo de 5%. percentuais contados foram arredondadas para as engrenagens mais próximos. Um valor de corte de 10% foi determinada arbitrariamente, e de acordo com este valor, dois grupos (baixa e alta de coloração Elf5) foram atribuídos

Vimentin e pontuação E-caderina:. Foram selecionados cinco campos aleatórios de baixa ampliação , em seguida, a proporção de zona positiva foi determinada por programa ImageJ. Os valores de corte foram determinados pela média, segundo a qual, dois grupos (baixa e alta expressão) foram atribuídos.

A clonagem molecular e infecção viral

Os plasmídeos Plex (Open Biosystems) contendo complementar Os ADN para GFP controlo e Elf5 foram gerados através de técnicas de clonagem molecular de rotina. O HA-marcado WT Elf5 cDNAs foi subclonado a partir de pCMV-HA vector de plasmídeos Plex utilizando enzimas de restrição BamH1-Not1. produção lentivírus foi realizado essencialmente como previamente descrito [23]. As células infectadas por vírus foram selecionadas com puromicina.

siRNA knockdown

Para experiências knockdown, siRNA visando o gene Elf5 (5′-AGCCCTGAGATACTACTATAA-3 ‘, número de catálogo GS2001) e controle de siRNA negativo foram adquiridos de Qiagen. Em seguida, as transfecções foram realizadas com Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen).

imunotransferência

A proteína foi extraída com tampão de lise RIPA. Os lisados ​​de proteína foram resolvidos em gel 10% Bis-Tris, transferido para membranas de PVDF, sondados com anticorpos secundários ligados a HRP (GE Healthcare), e visualizado com reagente de ECL (Thermo Scientific). Os anticorpos foram anti-Elf5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-caderina-E (Abcam, Cambridge, MA), anti-N-caderina (Abcam), anti-vimentina (Abcam), anti-Snail ( Cell Signaling Technology, Beverly, MA), anti-ZEB1 (Abcam).

a viabilidade celular ensaio

células indicadas foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5000 por poço em meio contendo 10% de FBS. No ponto de tempo indicado, o meio foi removido e meio sem soro contendo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT; 0,5 mg /ml; Sigma) foi então adicionado em cada bem. Quatro horas após a incubação a 37 ° C, os produtos celulares de formazan foram dissolvidos com isopropanol acidico e a absorvância a 570 nm foi medida por espectrofotometria (Beckman Du640B). Seis cavidades replicadas foram utilizados para cada amostra em cada ponto de tempo.

ensaios de migração

Vinte e cinco mil células foram semeadas em cultura de células de 24 poços insere com 8 poros mm (BD Falcon). Após 24-48 horas, as células sobre a superfície superior dos filtros foram removidos com um cotonete. Para a visualização, as células sobre as superfícies inferiores do filtro foram fixadas e coradas com azul de toluidina a um. campos inteiros de filtro foram contadas. Os dados são apresentados como células que migraram por campo

Esfera ensaio

Os ensaios foram realizados como previamente descrito com modificações [24]:. 1000 células /poço foram semeadas em placas de 6 poços ultra-baixa aderência (Costar) em meio MEGM contendo 10% de substituição Serum (KO) suplementado com 1 x MEM de ácido não essencial amino (Gibco), 20 ng /ml de EGF (R D Systems), 10 ng /ml de bFGF (R D Systems ) e B27 (Gibco).

a análise estatística

Os dados foram apresentados como média ± sE, salvo indicação contrária. O one-way ANOVA e Student

t

teste foram utilizados para analisar as diferenças entre /entre os grupos, respectivamente. SPSS (V.19, IBM, EUA) foi utilizado para avaliar a data.

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

expressão de mRNA Elf5 é diminuído em câncer urotelial da bexiga humana

níveis Elf5 relativos no tecido tumoral a partir de 50 pacientes UC foram determinados por qRT-PCR abrangendo 90 pb, normalizado pela GAPDH e foram comparados com a média de 10 amostras de tecido de controlo normais (Fig. 1a). expressão Elf5 Relativa em tecidos normais foi variável dentro de uma gama de 0,39-10,56 vezes de níveis medianos. amostras de tumor mostrou uma diminuição nos níveis Elf5 dentro de uma gama de 0,03-2,02 vezes em comparação com o mesmo controlo que os tecidos normais, com uma mediana de 0,40 vezes menor expressão (Fig. 1a). Para determinar se o nível Elf5 mostraram qualquer diferença significativa entre as diferentes fases do tumor, foi calculada a mudança vezes na expressão Elf5. redução intermediário de mRNA Elf5 foi detectado em NMIBC e baixo risco UC, enquanto foi observada perda muito significativa de expressões de mRNA Elf5 no invasiva (pT2-4,

P

. 0,01, Fig 1b) e alto risco UC (Alto grau pta, CIS e invasivo UC,

P

. 0,01, Fig 1c), em comparação com NMIBC e baixo risco UC (baixo grau PTA), respectivamente. Com base nestes resultados, a diminuição da expressão Elf5 parece ser um evento importante no desenvolvimento e progressão da UC.

a, a expressão de ARNm Elf5 é investigada em 50 UC e 10 amostras de tecido NU por PCR em tempo real. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). b e c, diagramas de caixa demonstrar significativamente regulada mRNA Elf5 em ambos os invasivos (pT2-4) e de alto risco UCs (Hg-R). As linhas horizontais: medianas agrupados. Caixas: 25-75% quartis. As linhas verticais: mínimo e máximo; NS: não significativo, *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. Baixo risco UC (Lw-r): baixo pTa grau; Hg-r UC: Alto grau de pta, CIS e UC invasivo. Os resultados apresentados são a partir de duas ou três experiências independentes.

Elf5 proteína é diminuída em cancro urotelial e associada com a progressão do tumor

Em seguida, a imunohistoquímica análises de espécimes NU e UC humanos foram realizados para verificar se a expressão Elf5 diminuiu em UC no nível de proteína. coloração IHC foi quantificada pela contagem proporção de núcleo positivo de vitral. De acordo com os dados de mRNA, encontramos proteína Elf5 foi manchado na maioria das células normais uroteliais epiteliais (Fig. 2A). Em contraste, a expressão Elf5 foi proeminentemente diminuiu em tecidos de UC (Fig. 2b) e quase completamente perdido em tumores invasivos (Fig. 2c). Em seguida, a expressão Elf5 foi quantificado de acordo com as fases de tumor. coloração Elf5 forte foi demonstrada em amostras NU com uma média de 34,10 ± 10,21 taxa positiva, ao passo que a coloração Elf5 moderada e fraca foram observados em PTA (19,36 ± 1,77,

P Art 0,05) e UCs invasivos (11,03 ± 2,56,

P

. 0,01, Fig 2d), respectivamente. Isto sugeriu que Elf5 silenciamento pode contribuir para a UC invasividade. Nós ainda avaliados o valor prognóstico da Elf5 em duas bases de dados clínicos (

Cohort 1A e 1B Cohort

) da UC por análise de Kaplan-Meier univariada. Coorte 1A foi composta por paciente com NMIBC, que receberam terapia de TURBT. Os pacientes deste grupo raramente são confrontados com a morte, mas sempre recidiva da doença, por isso foi utilizado o RFS. Descobrimos que pacientes com alta expressão Elf5 tendem a ter melhores RFS (HR = 0,34,

P

= 0,001, Fig. 2E). Em contraste, os pacientes de 1B coorte tendem a ser confrontado com a morte, de modo que o DSS foi selecionado. O resultado também revelou tendência significativa de prognóstico favorável para pacientes Elf5-elevadas (HR = 0,49,

P

= 0,04, Fig 2f.). Em addtion, os resultados com base em pontos de corte de 5% e 15% também foram conduzidos (S1 Fig.). As mesmas tendências com resultados semelhantes foram obtidos, embora um DSS não significativamente mais elevado foi detectado em pacientes com expressão Elf5 mais do que 15%. No geral, nossos dados clínicos apoiam o suposto papel que Elf5 pode funcionar se opor a progressão do cancro da bexiga.

a, forte coloração Representante Elf5 IHC nas células epiteliais dos NU (85%). Barras de escala, de 100mm. b, Representante moderada coloração Elf5 em tumores PTA não-invasivos (30%). c, coloração fraca Representante na NU invasiva ( 5%). d, Box trama mostra a coloração IHC Elf5 em NU (n = 10), PTA-1 (n = 146) e UC invasivos (n = 36). As linhas horizontais: medianas agrupados. Caixas: 25-75% quartis. As linhas verticais: mínimo e máximo; *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. e, curvas de Kaplan-Meier de sobrevida livre de recidiva (RFS) segundo o nível de coloração Elf5 em NMIBC primária tratada por TURBT. f, curvas de Kaplan-Meier de sobrevida específica da doença (DSS) de acordo com nível de coloração Elf5 em pacientes UC após cistectomia radical.

knockdown Elf5 em células HT1376 epiteliais-como induz EMT

evidências anteriores revelaram um mecanismo de Elf5 inibir EMT no cancro da mama [12]. Para investigar se Elf5 pode também regula EMT no contexto da UC, testámos os padrões de expressão Elf5 num painel de linhas de células uroteliais. Significativamente baixo nível de Elf5 foi observada em linhas de células caracterizadas por marcadores mesenquimais (EJ e T24), células mesenquimatosas semelhante, sugerindo um papel potencial inibidor de Elf5 em EMT (Fig. 3a). Em epitelial semelhante UROtsa, RT112 e células HT1376 (identificado pela alta expressão de marcadores epiteliais), elevado nível de expressão Elf5 foi demonstrado (Fig. 3a). Para testar a possível relação entre Elf5 e EMT, curto interferindo RNAs (siRNAs) foram usados ​​para derrubar Elf5 em células epiteliais HT1376-like. Em contraste com as células epiteliais formando-ilha, parentais, as células tratadas com siRNA consistiu em células polarizadas, única frente com costas (Fig. 3b). Semelhante a células EMT anteriormente relatada [6,12], células tratadas com siRNA redução expressa em E-caderina e aumento em N-caderina, vimentina, bem como EMT-promover factores de transcrição (por exemplo. Caracol e ZEB1) (Fig. 3c) .

a, Elf5 e EMT marcadores são detectados por análise de Western blot em linhas de células uroteliais. b, microscopia de fase brilhante: Células T24 transduzidas com células vetoriais ou HA-Elf5 e HT1376 tratados com controlo ou Elf5 siRNA. c, análises de Western blot de Elf5 e EMT marcadores em células T24 transduzidas com células vetoriais ou HA-Elf5 e HT1376 tratados com controlo ou Elf5 siRNA. d, e, ensaio Sphere (n = 6) e ensaio de Migração (n = 3): brilhante fase imagens de microscopia e quantificação de T24 parental, T24-vector, T24-Elf5 e HT1376 parental, bem como controle e Elf5-siRNA células HT1376 tratados. Os dados são apresentados como média ± EPM, **

P

0.01.f e G, A viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio de MTT. Os dados são apresentados como média ± SEM. Seis cavidades replicadas foram realizadas para cada amostra em cada ponto de tempo.

O ensaio mede a proliferação independente de ancoragem esfera na densidade clonal in vitro tem sido associada com a presença do estado epitelial-mesenquimal [6]. Estudámos, portanto, habilidades de formação de esfera de células HT1376 para avaliar o seu estado de EMT. Relativamente às células parentais e ARNsi de controlo (Ctrl) siRNA, silenciamento de Elf5 eram 3 vezes enriquecidas em células formadoras de esfera (Fig. 3d). Para testar outra marca funcional do estado mesenquimal, realizamos em ensaios in vitro invasivos. células knockdown-Elf5 eram mais invasiva (de 18 vezes comparado com as células parentais e de controlo, fig. 3E). Além disso, ensaios de viabilidade celular por MTT confirmado que o efeito de Elf5 silêncio sobre a capacidade de formação de esfera e invasividade não é uma consequência do aumento do número de células (Fig. 3F e 3G). Juntas, nossas observações indicam que Elf5 é um inibidor da EMT em células UC.

Elf5 promove MET em células T24 mesenquimais-like

Enquanto isso, a relação entre Elf5 e EMT foi confirmado pela superexpressão estável de Elf5 em células T24-mesenquimais semelhantes, que não expressam detectável Elf5 endógeno (Fig. 3a). Encontramos Elf5 superexpressão efetivamente aumento da formação de ilha epitelial em células T24 (Fig. 3b). Além disso, a sobre-expressão Elf5 diminuiu o nível de vários marcadores de células mesenquimais, tais como N-caderina e vimentina expressão, e aumento da expressão de E-caderina (Fig. 3c). Além disso, diminuiu factores de transcrição relacionados com o EMT também foram detectados em células T24 Elf5-sobre-expressos (Fig. 3C). Funcionalmente, 5 vezes habilidades de formação de esfera e invasão de 4 vezes foram diminuiu após estável-expressão forçada de Elf5 em células T24 comparar com o grupo de plasmídeo vazio (Fig. 3d e 3e). TEM induzida por Elf5 foi ainda confirmada em células PC3, uma linha celular de cancro da próstata mesenquimais, como com poderosa capacidade de invasão (dados não mostrados). Coletivamente, nossas observações indicam que Elf5 é um executor de MET em células UC.

Elf5 está associada a E-caderina e vimentina em UC humana

Para confirmar a in vitro descobrindo que o Elf5 é um inibidor da EMT e um executor de MET em células UC, foram analisados ​​os níveis de expressão de Elf5, e-caderina e vimentina por IHC em

coorte 1

amostras do paciente (Fig. 4a). Baixa expressão de Elf5 (por exemplo, o caso 2) é detectado em 56,6% (103 de 182) das amostras e significativamente associada com a baixa expressão da caderina-E (

P Art 0,05) e alta expressão de vimentina (

P Art 0,05, Fig 4b).. Estes dados sugerem que a Elf5 é inversamente associado com o fenótipo mesenquimal em pacientes com UC.

A e b, coloração IHC da E-caderina e vimentina em casos representativos de alta (caso 1) e baixa amostra de expressão Elf5 ( caso 2). Barras de escala, de 100mm. b, análise de correlação de Elf5 e EMT marcadores de E-caderina /vimentina.

Elf5 promotor hipermetilação inversamente correlacionada com a expressão de mRNA Elf5 na UC humana

Depois de a expressão perda de Elf5 em humanos tecidos UC é reconhecido, nós ainda ir para consultar as razões potenciais. estudo recente demonstrou que a expressão Elf5 placentário é regulada para baixo com o aumento da idade gestacional e regulação epigenética foi provado ser como ‘gatekeeper’ [13]. Em seguida, testamos se o estado de atividade de Elf5 na UC humano é também epigenetically controlada por sua metilação do DNA. Em primeiro lugar, nós projetamos primers para MSP usando MethPrimer [25]. MSP para a sequência do promotor de Elf5 entre -1000 pb e o local de início da transcrição mostrou apenas um metilação em 10 amostras nu (1/10, Fig. 5a). Posteriormente, foram analisados ​​estado de metilação do promotor de Elf5 em amostras de cancro da bexiga (

coorte 2

, n = 50) (Fig. 5a), e encontraram uma frequência de metilação de 72% (36/50). Para determinar se o promotor Elf5 metilação contribui para Elf5 perda de expressão na UC, nós correlacionados nível de metilação e expressão de mRNA em pacientes de

coorte 2

. Como na Fig. 1a, 10 tecidos NU serviram como controle e sua taxa de expressão mediana foi definida como valor absoluto 1.0. Em comparação com esses tecidos NU, não metilado UC mostraram uma expressão Elf5 quase igual, sem considerar o estágio do tumor ou grau (média: 0,80,

P

= 0,08, Fig 5b.). Em contraste, tecidos de tumor desnaturado mostrou uma perda significativa da expressão de mRNA Elf5 (mediana: 0,33,

P

0,01, Figura 5b.). Essa correlação entre a perda de expressão de mRNA Elf5 e Elf5 promotor metilação aberrante sugere metilação Elf5 parece ser um importante mecanismo de silenciamento de genes Elf5 na UC.

a, resultados Representante MSP da metilação do promotor Elf5 em NU, PTA e amostras de tecidos invasivos UC, bem como em controlos negativos e positivos. L e M representam DNA não metilado e metilado. Bissulfito-convertido genómico não metilado, o ADN genómico polymethylated e não-molde são usadas como controlos. b, a expressão de ARNm Elf5 por PCR em tempo real é investigada de acordo com Elf5 estado de metilação do promotor em 10 NU e 50 amostras de tecido de UC. Os dados são apresentados como média ± SEM. c, Box gráfico mostra perda de expressão de mRNA Elf5 em pacientes com promotor Elf5 metilado. As linhas horizontais: medianas agrupados. Caixas: 25-75% quartis. As linhas verticais: mínimo e máximo. **

P Art 0,01.

Segmentação metilação do promotor conduz a expressão Elf5 em linhas de células UC

estados Promotor de metilação em linhas celulares de cancro de bexiga humana foram analisados ​​utilizando MSP. As linhas de células mesenquimais UC-EJ como T24 e revelou uma hipermetilação nas suas regiões promotoras, enquanto que a hipometilação foi detectada em células HT1376 baixo-invasivos (Fig. 6A). Mediu-se o nível de expressão de ARNm de Elf5 utilizando um ensaio de RT-PCR. Se o fizer, revelou maior expressão de mRNA Elf5 em linhas celulares hypomethylated (Fig. 6B). Para confirmar a relação entre o estado de metilação do promotor e expressão Elf5, nós tratamos estas linhas celulares UC HT1376, J82, EJ e T24 com 5 � agente demetilante 5-aza. a expressão de ARNm foi significativamente Elf5 restaurado após o tratamento com 5-aza excepto que foi em hypomethylated HT1376 (Fig. 6b). Além disso, a expressão da proteína Elf5 também foi revertida por desmetilação em linhas de células T24 e EJ (Fig. 6c e 6d).

a, MSP resultados representativos que ilustram o estado de metilação do promotor Elf5 de linhas de células uroteliais. b, análise de RT-PCR quantitativa a expressão de ARNm em linhas de células Elf5 UC parentais HT1376 e tratou-aza-5, J82, EJ e T24. NS: não significativo, *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. c e d, análises de Western blot de marcadores Elf5 e EMT em EJ e células T24 tratadas com ou sem 5-aza. E e F, o ensaio de migração: quantificação de T24, bem como EJ tratadas com ou sem 5-aza, n = 3. G e H, Esfera ensaio: quantificação, n = 6. Os dados são apresentados como média ± EPM, **

P Art 0,01.

Para determinar se a proteína Elf5 recém expressa é funcional, os fabricantes de EMT e fatores de transcrição relacionados com a EMT foram analisados ​​por immunoblotting, bem como ensaios de invasão e de formação esfera. Encontrámos marcador de célula epitelial aumentada e marcadores de células mesenquimais diminuíram após o tratamento com 5-aza em duas linhas de células mesenquimais UC semelhante (Fig. 6c e 6d). Após 6 dias de pré-tratamento, 5-aza reduzida 2,4 vezes e 2,7 vezes a invasividade de células T24 e EJ, respectivamente (Fig. 6E e 6F). Para a formação de esfera, 5-aza respectivamente introduzido de 3,2 vezes e a redução de 4,7 vezes nas células T24 e EJ (Fig. 6g e 6h). É razoável concluir que a hipermetilação do promotor contribui para a perda de expressão Elf5 em linhas celulares de UC.

Discussão

Três observações significativas foram observadas neste estudo. Em primeiro lugar, Elf5 é um fator de prognóstico em pacientes com UC. Nós mostramos que a expressão Elf5 foi negativamente correlacionada com o grau do tumor e estágio. A morte recorrência e doença específica precoce também foram observados em pacientes com baixa expressão de Elf5.

In vitro

, baixa expressão Elf5 está associada com alta capacidade de invasão, que pode ser efetivamente diminuído por excesso de expressar Elf5 de propósito. Em segundo lugar, resulta de IHC coloração de espécimes UC revelou uma relação negativa entre o fator de transcrição Elf5 e EMT, o que é crucial para a manutenção de características celulares associadas com alto grau, invasão e recorrência. Além disso, esta observação foi demonstrado em linhas de células por regulação artificial de expressão Elf5. Em terceiro lugar, o gene Elf5 é hipermetilado em células de cancro, de modo que a expansão do compartimento do mesenquimais e subsequente SCS é induzida e mantida.

Ao contrário de rato, o gene humano Elf5 abriga quatro tipos de transcrição com duas variantes de início da transcrição alternativa Sites, que identifica um local de início com o gene ortólogo de rato e dá origem à isoforma Elf5-2b, enquanto o outro uma coberta no intrão de Elf5-2b produz uma variante mais Elf5-2a. Outra variante transcrição é emendado isoforma de Elf5-2b com o motivo ets consenso retidos falta dos exons codificantes 3 e 4 (SAM /domínio pontas), um domínio generalizado na sinalização e proteínas nucleares [13]. No estudo recente, a variante Elf5-2b foi distinguido como uma das principais formas de Elf5 expresso em humanos, de modo que esta isoforma foi escolhida no nosso estudo, bem como noutro papel, em que Elf5 foi demonstrado como sendo um inibidor de EMT no cancro da mama [12].

Vários estudos têm demonstrado que a regulação epigenética do gene Elf5 é um gatekeeper linhagem entre os compartimentos de linhagem embrionárias e trofoblastos, bem como entre basal e células epiteliais luminais [14,26]. Aqui, mostramos que as funções de metilação do DNA como uma barreira de EMT em células UC. O promotor Elf5 é CpG rico, mas não satisfaz os critérios de uma ilha CpG (https://cpgislands.usc.edu). caracterização detalhada do perfil Elf5 promotor metilação por análise de sequenciação de bissulfito revelou que a vasta maioria de resíduos de CpG em 1 kb a montante da região foram metilados nas células com a perda de expressão Elf5 [14,26]. Assim, os iniciadores exigentes sequência dentro desta região foram concebidos neste estudo. Na análise de dados adicionais, descobrimos que a perda de expressão Elf5 não estava restrita apenas em pacientes com hipermetilação no promotor do gene Elf5. É evidente a partir dos dados que o promotor metilação não é o único determinante de expressão Elf5 em células UC. Estudos anteriores demonstraram hormonal como um estímulo eficazes que podem induzir a expressão Elf5 em células epiteliais luminais, embora os mecanismos subjacentes a esses efeitos continuam a ser elucidado [27,28]. Além disso, alguns repressores transcricionais tais como o receptor do estrogénio (ER) podem suprimir a expressão Elf5 na ausência de metilação do promotor, porque descobrimos que Elf5 é predominantemente expresso no ER células epiteliais luminais negativos [29], e um local de ligação ao DNA para RE tem