Sumário
decisão rápida sobre a resposta do tumor após o tratamento anti-câncer ainda é uma necessidade médica não atendida. Aqui nós investigamos se
in vivo
imagem da apoptose, utilizando o formulário de ApoPep-1, um peptídeo que reconhece histona H1 exposta em células em apoptose linear e cíclica (dissulfeto-ligado), numa fase inicial após o tratamento poderia prever tumor resposta ao tratamento posterior. O tratamento de células tumorais com cistplatin estômago ou cetuximab isoladamente induziu apoptose, enquanto que a combinação de cisplatina com cetuximab mais eficientemente induzida apoptose, como detectado através da ligação com a forma linear e cíclica de ApoPep-1. No entanto, as diferenças entre o único agente e combinação de tratamento eram mais notável, como detectado com a forma ciclica em comparação com a forma linear. Nos ratinhos portadores de tumor, apoptose de imagem foi realizada 1 semana e 2 semanas após o início do tratamento, enquanto que os volumes tumorais e os pesos foram medidos 3 semanas após o tratamento.
In vivo
fluorescência sinais de imagem obtidos pela absorção de ApoPep-1 para tumor foi mais notável no grupo injectado com forma cíclica de ApoPep-1 a 1 semana após o tratamento combinado com cisplatina com cetuximab. A análise de correlação mostrou que os sinais de imagem por ApoPep-1 cíclica em 1 semana após o tratamento com cisplatina com cetuximab em combinação foram mais estreitamente relacionado com alterações do volume do tumor (r
2 = 0,934). Estes resultados demonstram que
in vivo
apoptose imagem usando Apopep-1, especialmente cíclica ApoPep-1, é um instrumento sensível e preditivo para decisão rápida sobre a resposta do tumor no estômago após o tratamento anti-cancro.
citação: Jung HK, Wang K, Jung MK, Kim é, Lee BH (2014)
In Vivo
Near-Infrared fluorescência de imagem da apoptose Usando histona H1-peptídeo alvo Probe após Anti-Cancer O tratamento com cisplatina e Cetuximab de decisão rápida sobre a resposta do tumor. PLoS ONE 9 (6): e100341. doi: 10.1371 /journal.pone.0100341
editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Estados Unidos da América
Recebido: 02 de abril de 2014; Aceito: 23 de maio de 2014; Publicação: 20 de junho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Jung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados são incluídos no manuscrito
Financiamento: Este estudo foi apoiado por uma bolsa da National R D Programa de Controle do Câncer, Ministério da Saúde . Bem-estar, República da Coreia (0720550-2 para Byung-Heon Lee) e uma subvenção NRF-2012M2A2A7035589 (para Byung-Heon Lee), através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer gástrico é a segunda principal causa de morte por câncer em todo o mundo [1]. Quimioterapia com agente único para o cancro gástrico avançado inclui capecitabina ou 5-fluorouracil, enquanto a terapia de combinação inclui a cisplatina com 5-fluorouracil ou cisplatina e capecitabina [2]. Infelizmente, o câncer gástrico mostrou baixa responsabilidade à quimioterapia. A taxa de resposta de gamas de cancro gástrico avançados a partir de 10-30% para a terapia com um único agente e 30-60% para a quimioterapia combinada de [2]. Além disso, molecular, tais como drogas (anticorpo anti-receptor de factor de crescimento epidérmico), cetuximab e trastuzumab (anticorpo receptor de anti-HER2) têm sido utilizados em combinação com quimioterapia dirigida, resultando em diversas taxas de resposta [3] – [5]. À luz destas baixas taxas de resposta, acompanhamento e decisão precoce de resposta do tumor no estômago após o tratamento com drogas anti-câncer, é muito importante na gestão da terapia do cancro.
Tradicionalmente, tem sido realizada decisão sobre a resposta do tumor medindo as alterações no tamanho do tumor por meio de tomografia computadorizada (TC). Tal decisão baseado no tamanho do tumor em resposta ao tumor, no entanto, é normalmente possível aos dois meses após o início do tratamento. De acordo com as orientações dos critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos (RECIST), quando há uma redução de pelo menos 30% do tamanho do tumor, o tratamento é considerada como uma resposta parcial, enquanto que quando existe um aumento de 20% ou superior no tamanho do tumor, que é definido como uma doença progressiva [6]. Para reduzir o consumo de tempo e de custos para uma terapia anti-tumor, que é necessário para fazer o go /no-go decisão sobre a terapia mais cedo do que o actual método baseado na medição do tamanho do tumor pelo CT.
Medição a absorção de
18F-fluorodeoxyglucose (
18F-FDG) pelo tumor por meio de tomografia por emissão de positrões (PET) imagiologia nos permitiu tomar uma decisão anterior sobre a resposta tumoral após a terapia anti-tumoral do que a tomografia computadorizada baseada em tamanho.
captação de 18F-FDG do tecido tumoral é diminuída por redução do metabolismo e a carga de células tumorais após quimioterapia. No entanto, sabe-se que a absorção de
18F-FDG depende principalmente de tipos de cancro gástrico histopatológicos. Por exemplo, carcinoma de células do anel de sinete e absorção de adenocarcinoma mucinoso
18F-FDG em níveis baixos devido aos baixos níveis de GLUT-1 transporter [7], [8]. Estas características tornam a decisão sobre a resposta câncer gástrico por
18F-FDG limitado. Além disso, alguns tipos de tumores, como câncer de mama, mostrar alargamento metabólica, um aumento temporário de
captação de 18F-FDG após a quimioterapia, que é difícil discriminar-lo de reincidência do tumor [9].
quando as células de tumor são tratadas com quimioterapia e drogas-alvo molecular, que geralmente morrem de apoptose [10] – [12]. A morte celular apoptótica parece ocorrer antes que a mudança anatómica ou a redução no tamanho do tumor [13], [14]. Nesta matéria, a imagem latente de apoptose nos permita decidir se tumor é sensível a um tratamento numa fase mais precoce do que a imagem de redução de tamanho. Além disso, a apoptose representa diretamente a morte de células tumorais, enquanto
captação de 18F-FDG representa o metabolismo do tumor e, assim, representa indiretamente a morte de células tumorais. As células apoptóticas colocar assinaturas ou biomarcadores na sua superfície, tais como a fosfatidilserina e histona H1, que são pouco ou ausente na superfície das células saudáveis [15] – [17]. sondas de imagem apoptose, como a anexina V e dipicoyl amida de zinco que se ligam a fosfatidilserina foram exploradas para a apoptose de células monitoramento tumor
in vivo
[15] – [17].
Temos anteriormente identificados ApoPep -1 reconhecido que as células apoptóticas e necróticas através da ligação a histona H1 na superfície de células apoptóticas e no núcleo de células necróticas, respectivamente [18]. ApoPep-1 tem sido mostrado para ser acumulado no tumor após tratamento com doxorrubicina [18]. Além disso, tem sido utilizada para imagiologia de morte celular do miocárdio na fase inicial depois de enfarte do miocárdio para a avaliação da função cardíaca a longo prazo [19]. Para fins terapêuticos, ApoPep-1 foi utilizado como uma porção de direccionamento para melhorar a droga e células T para a entrega do tumor após a indução da apoptose pela quimioterapia [20], [21]. Neste estudo, nós examinamos se
in vivo
sinais de imagem de apoptose obtido pela absorção de forma linear e cíclica (ligado por dissulfureto) de ApoPep-1 numa fase inicial após o tratamento são correlacionados com as mudanças no volume do tumor mais tarde e são capazes de fazer uma decisão rápida sobre a resposta do tumor possível.
Materiais e Métodos
Síntese e rotulagem de fluorescência de peptídeos
Linear (CQRPPR) ou cíclico (CQRPPRC, ciclização por meio de ligação dissulfureto em terminais amino e carboxi) forma de péptidos ApoPep-1 foram sintetizados e purificados utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) a . 90% de pureza por Peptron Inc. (Daejeon, Coreia do Sul). Peptídeos foram marcadas com FPR675 do infravermelho próximo (NIR) corante de fluorescência (Bioacts Inc., Incheon, Coreia.)
A ligação in vitro de peptídeos para células apoptótica
SNU16 linha de células de cancro do estômago humano era comprado de KCLB (Seul, Coréia). Para induzir a apoptose, as células foram tratadas com cisplatina (300 ng /ml), cetuximab (200 ug /ml), e a cisplatina (300 ng /ml) mais o cetuximab (200 ug /ml) em combinação, durante 24 h. As concentrações de cisplatina e cetuximab foram escolhidos de acordo com os relatórios anteriores [22], [23]. Após o tratamento, as células foram incubadas com 10? M de isotiocianato de fluoresceína (FITC) de cadeia linear ou de forma ciclica -conjugated de ApoPep-1 a 4 ° C durante 1 h. Como controlo, as células foram coradas com (Life Technologies, Carlsbad, CA), Alexa488-anexina V conjugada durante 15 min a RT. Percentagens de células fluorescentes foram medidos por fluxo (ou anexina V-bound ligada ao péptido) citometria.
O tratamento anti-tumoral de ratos e tamanho do tumor medição
Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com diretrizes institucionais e de acordo com o protocolo de animais aprovado pela orientação do Comitê Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade Nacional Kyungpook (permissão No. KNU 2012-15).
com oito semanas de idade atímicos fêmea (
nu /nu
) camundongos Balb /c foram adquiridos de laboratórios Orient (Seongnam, Coreia) e foram alojados sob condições específicas de cada isentos de agentes patogénicos com ração de laboratório e água
ad libitum
. xenoenxertos de tumores de estômago foram estabelecidas por injecção subcutânea 1 x 10
7 SNU-16 células em 100 ul de solução salina no flanco direito. Os tumores foram deixados para atingir 50-60 mm
3 do volume antes da randomização e início do tratamento. O tratamento de ratinhos portadores de tumor com cisplatina e o cetuximab foi conduzida de acordo com um protocolo previamente descrito [24]. Os ratinhos foram divididos em quatro grupos de tratamento (
N
= 6 por grupo) e tratados durante duas semanas: 1) controlo de solução salina; 2) a cisplatina (5 mg /kg, por via intraperitoneal (i.p.), uma vez por semana, durante duas injecções totais); 3) cetuximab (1,5 mg /kg, i.p., duas vezes por semana, durante quatro injecções totais); 4) a cisplatina (5 mg /kg, i.p., uma vez por semana, durante duas injecções totais) mais cetuximab (1,5 mg /kg, i.p., duas vezes por semana para o total de quatro injecções). Uma rodada de tratamento inclui a injeção de cisplatina no dia 1 por semana e cetuximab no dia 1 e no dia 4 por semana. Alterações na dimensão do tumor foram medidos ao longo de três semanas. Diâmetros de tumor foram medidos com paquímetro automática. Os volumes dos tumores foram calculados utilizando a fórmula: volume = (comprimento x largura x altura) /2, onde o comprimento, largura e altura, a dimensão mais longa, mais curta dimensão paralela ao corpo do rato, e o diâmetro do tumor perpendicular ao comprimento e largura , respectivamente. Os pesos dos tumores foram medidos após o isolamento da massa tumoral.
In vivo
NIR fluorescência de imagem da apoptose tumor
In vivo
NIR imagens de fluorescência foi realizada após o primeiro e segundo ciclo de tratamento. Cada grupo de tratamento (
N
= 6) foi dividido em dois subgrupos (
N
= 3) para geração de imagens com linear e de forma cíclica ApoPep-1, respectivamente. Lineares e de forma cíclica FPR675 marcado ApoPep-1 (1,45 mg /kg e 1,54 mg /kg, respectivamente; equivalente a 800 nmol /kg para cada péptido) foi injectado através da veia da cauda em ratinhos. Aos 90 min após a administração, os ratinhos foram anestesiados e submetidos a imagiologia. NIR de fluorescência (tipicamente, entre 650 e 1100 nm) é favorecido para
in vivo
imagens ópticas devido à sua absorção de tecido baixa e propriedades de penetração nos tecidos profundos [25]. O comprimento de onda de excitação /emissão do corante FPR675 utilizado neste estudo foi de 675/698 nm. As imagens foram tiradas usando o Explorar Optix sistema de imagem óptico (ART Inc., Montreal, Canadá). Este sistema de tomografia de domínio de tempo tem sido mostrado para ser mais sensível com maior profundidade de detecção e resolução espacial do que um sistema de ondas planar contínua de imagem [26]. O tempo de aquisição para um mapeamento de corpo inteiro foi de 15 min por mouse. A intensidade da fluorescência na região de interesse (ROI) foi medida usando um software de análise fornecido pelo fabricante (ART Inc.).
A análise histológica da apoptose
Depois de
in vivo
imagiologia, os ratinhos foram eutanizados e os tumores foram rapidamente removidos e congelados em OCT meio de fixação (Sakura Finetechnical, Tóquio, Japão). Os tecidos foram cortados em secções de 6 um e coradas com DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindol) para contracoloração núcleo. dUTP mediada por transferase de rotulagem nick-fim (TUNEL) coloração desoxi-nucleotidil terminal foi realizada utilizando Apoptag Red No kit de detecção da apoptose in situ de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (Millipore, Billerica, MA). As secções de tecido foram observadas sob um microscópio de fluorescência (Carl Zeiss, Jena, Alemanha).
A análise de correlação entre a intensidade da fluorescência e volume tumoral
Em 3 semanas após o tratamento (endpoint de experimentos), os volumes tumorais foram medidos e os tumores foram isolados para a medição do peso. A correlação entre a intensidade de fluorescência NIR e o volume do tumor foi avaliada por análise de regressão linear utilizando o software Graphpad.
Estabilidade de péptidos na
soro
Péptido estabilidade no soro, foi analisada como anteriormente descrito [ ,,,0],27]. O sangue de ratinhos foi recolhido e deixado coagular, e, em seguida, o soro foi obtido por centrifugação a 4 ° C, duas vezes, seguido de filtração (0,22 um de poro). O péptido (100 ug em 50 ul de PBS) foi incubado com 50 ul de soro filtrada a 37 ° C durante o período de tempo indicado. As amostras incubadas foram diluídas 100 vezes e fraccionadas por FPLC de fase reversa C18 com um gradiente linear de acetonitrilo (Vydac proteína e péptido C18, 0,1% de trifluoroacetato em água para atingir o equilíbrio, e 0,1% em acetonitrilo para trifluoroacetato de eluição). Para confirmar a identidade do pico a partir dos perfis de C18 de fase inversa de FPLC, cada pico foi recolhido, seco sob vácuo e analisado por espectrometria de massa (EM) utilizando um espectrómetro de massa MALDI-TOF (Life Technologies, Carlsbad, CA).
A análise estatística
A significância estatística de diferenças entre os grupos experimental e controle foram analisados utilizando a análise de variância (ANOVA).
resultados
In vitro
detecção de apoptose das células tumorais do estômago usando ApoPep-1 após o tratamento com cisplatina e cetuximab
Para examinar a detecção de apoptose por ApoPep-1, as células tumorais do estômago foram tratados com cisplatina, cetuximab, e cisplatina + cetuximab e, em seguida, incubadas com forma linear e cíclica de ApoPep-1. forma cíclica de ApoPep-1 (CQRPPRC) foi preparada por adição de resíduo de cisteína no terminal carboxi de forma linear de ApoPep-1 (CQRPPR) e a ciclização através de pontes de dissulfureto. As percentagens de células apoptóticas detectadas pela forma linear de ApoPep-1 foram de aproximadamente 28%, 25%, e 34% após o tratamento com cisplatina, cetuximab e cisplatina + cetuximab, respectivamente (Figura 1A). As percentagens de células apoptóticas detectadas pela forma cíclica de ApoPep-1 foram de aproximadamente 56%, 49%, e 78% após o tratamento com cisplatina, cetuximab e cisplatina + cetuximab, respectivamente (Figura 1B). As percentagens de células apoptóticas detectadas por anexina V foram, aproximadamente, 43%, 40%, e 45% após o tratamento com cisplatina, cetuximab e cisplatina + cetuximab, respectivamente (Figura 1C). Estes resultados mostram que o tratamento combinado de cisplatina e cetuximab induz a apoptose de células de tumor do estômago em níveis mais elevados do que o tratamento de cisplatina ou cetuximab isoladamente faz. Além disso, estes resultados sugerem que a forma cíclica de ApoPep-1 detecta mais sensibilidade a apoptose de células de tumor do estômago do que a forma linear de ApoPep-1 ou anexina V se.
As células foram incubadas com cisplatina (300 ng /mL ), cetuximab (200 ug /ml), e a cisplatina (300 ng /ml) mais o cetuximab (200 ug /ml) em combinação, durante 24 h. As células foram colhidas e incubadas com ApoPep-1 marcado com FITC a 4 ° C durante 1 h com anexina V ou à temperatura ambiente durante 15 min. Os dados representam percentagens de células apoptóticas tal como medido por citometria de fluxo. (A-C) Percentagem de células apoptóticas detectadas por forma linear de ApoPep-1, de forma cíclica ApoPep-1, e anexina V, respectivamente. PBS, solução salina tamponada com fosfato; CPT, cisplatina; CET, cetuximab; CPT + CET, a cisplatina com o cetuximab.
In vivo
imagem de apoptose de tumor no estômago usando ApoPep-1 em resposta a cisplatina e cetuximab
Para examinar
in vivo
detecção e imagem da apoptose de tumor no estômago usando ApoPep-1, medimos a intensidade de fluorescência no tumor pela acumulação de NIR corante fluorescente marcado com ApoPep-1 para tecido tumoral após a primeira e segunda rodada de tratamento (equivalente a uma semana e duas semanas após o início do tratamento, respectivamente). A quantificação da intensidade de fluorescência no local do tumor por qualquer forma linear ou cíclica de ApoPep-1showed que as intensidades foram significativamente maiores nos grupos tratados com cisplatina, cetuximab e cisplatina + cetuximab, em relação ao grupo de controlo não tratado, após a primeira ou na segunda etapa de tratamento (Figura 2A, 2B). por intensidades de fluorescência linear ApoPep-1 foram maiores no grupo tratado com cisplatina com cetuximab em comparação com o grupo tratado apenas com (cisplatina
P
0,05 e
P
0,05, após o primeiro e segunda ronda de tratamento, respectivamente, Figura 2A) e cetuximab isoladamente (
P
0,01 e não significativa após a primeira e segunda ronda de tratamento, respectivamente, Figura 2A). Notavelmente, as intensidades de fluorescência no local do tumor por cíclico ApoPep-1 eram notavelmente maior no grupo tratado com cisplatina com cetuximab em comparação com o grupo tratado com cisplatina sozinha (
P
0,01 e
P
0,01 depois da primeira e segunda rodada de tratamento, respectivamente, Figura 2B) e cetuximab isoladamente (
p Art 0.001 e
p Art 0,01 depois da primeira e segunda rodada de tratamento , respectivamente, a Figura 2B). imagens de fluorescência de corpo inteiro representativas de forma linear e cíclica das ApoPep-1 foram mostrados (Figura 2C, 2D, respectivamente). foram observados sinais de fluorescência de fundo pequenos em outros órgãos, incluindo o fígado e pulmão (Figura 2C, 2D).
SNU-16 estômago camundongos portadores de tumor foram tratados com cisplatina, cetuximab e cisplatina com cetuximab. Após a primeira e segunda ronda de tratamento, forma linear ou cíclica de FPR675 NIR fluorescência corante-rotulados ApoPep-1 foi injectado intravenosamente em ratos.
In vivo
NIR imagens de fluorescência foram tomadas a 90 minutos após a administração. (A) (B) Quantificação da NIR intensidade do sinal de fluorescência da região de interesse (ROI) em grupos injectados com linear e cíclica ApoPep-1. As barras representam a intensidade do sinal para o ROI obtido a partir de três ratinhos individuais (média ± D.P.). Asteriscos representam significância estatística em comparação com PBS. Os asteriscos em parênteses representam significância da diferença entre os dois grupos. *
p Art 0,05, **
p Art 0,01 e ***
p Art 0,001 por ANOVA de uma via (
n
= 3 por grupo). imagens de fluorescência (C) (D) NIR representante pela absorção de linear e cíclica ApoPep-1 para tumor foram mostrados. As barras de escala representam a intensidade de fluorescência normalizada. Os círculos representam o ROI.
Medição dos volumes tumorais e os pesos após o tratamento anti-tumor com cisplatina e cetuximab
Para analisar o crescimento efeito anti-tumoral da cisplatina ou cetuximab isoladamente e em combinação , os volumes tumorais e os pesos foram medidos após o tratamento. O tratamento com cisplatina, cetuximab e cisplatina e os volumes tumorais cetuximab reduzida, em comparação com o controlo não tratado, no grupo linear ApoPep-1 (
P
0,05,
P
0,05, e
P
0,001, respectivamente, Figura 3 a) e no grupo de 1-ApoPep cíclico (
P
0,05,
P
0,01, e
P
0,001, respectivamente, Figura 3B). O tratamento combinado de cisplatina e cetuximab reduzida de forma mais eficiente os volumes dos tumores, em comparação com o tratamento com cisplatina ou cetuximab isoladamente, no grupo ApoPep-1 linear (
P
0,05 e
P
0,05 , respectivamente, Figura 3 a) e no grupo cíclico ApoPep-1 (
P
0,01 e
P
. 0,01, respectivamente, Figura 3B)
SNU-16 estômago portador de tumor ratinhos que foram analisadas para sinais de imagem depois da primeira e segunda ronda de tratamento foram mantidas para a medição do tamanho do tumor. (A) (B) de medição dos volumes de tumor em 3 semanas após o tratamento. (C) (D) Medição de pesos de massa tumoral isolado em 3 semanas após o tratamento.
* p Art 0,05, **
p Art 0,01 e ***
p Art 0,001 por ANOVA one-way. As setas representam os pontos de tempo de tratamento. Asteriscos representam significância estatística em comparação com PBS. Os asteriscos em parênteses representam significância da diferença entre os dois grupos. (E) TUNEL coloração de tecidos tumorais. células verdes, apoptóticos; Azul, núcleo. PBS, solução salina tamponada com fosfato; CPT, cisplatina; CET, cetuximab; CPT + CET, a cisplatina com o cetuximab. As barras de escala representam 50 mm.
padrão semelhante de alterações no peso do tumor após o tratamento com cisplatina, cetuximab e cisplatina com cetuximab em comparação com controlo não tratado foram observadas no grupo linear ApoPep-1 (
p
0,01,
P
0,01, e
P
0,001, respectivamente, Figura 3C) e no grupo de 1-ApoPep cíclico (
p
0,01,
P
0,01, e
P
0,001, respectivamente, a Figura 3D). O tratamento com cisplatina mais cetuximab reduzida de forma mais eficiente os pesos dos tumores, em comparação com o tratamento com cisplatina ou cetuximab isoladamente, no grupo linear ApoPep-1 (
P
0,05 e
P
0,05, respectivamente, Figura 3C) e no grupo cíclico ApoPep-1 (
P
0,01 e
P
0,01, respectivamente, a Figura 3D). Os níveis de redução dos volumes tumorais e os pesos após o tratamento entre os grupos injectados com linear e de forma cíclica ApoPep-1 foram semelhantes, e não houve diferenças nos volumes dos tumores entre esses dois grupos no momento de imagiologia. Níveis mais elevados de apoptose após tratamento com cisplatina com cetuximab em combinação, em comparação com cisplatina ou cetuximab isoladamente, foi ainda demonstrada pela coloração TUNEL dos tecidos tumorais (Figura 3E).
A correlação entre a intensidade de fluorescência e o volume do tumor
Nós examinamos a correlação entre a intensidade de fluorescência
in vivo
imagem de apoptose depois da primeira e segunda rodada de tratamento (equivalentes a uma semana e duas semanas após o início do tratamento, respectivamente) e volume de tumor mais tarde (às 3 semanas após o início do tratamento). As intensidades de fluorescência das imagens captadas pela cíclica ApoPep-1 após a primeira rodada de tratamento foram inversamente correlacionados com os volumes tumorais com o acordo mais forte (coeficiente de correlação r
2 = 0,934, Figura 4C), em comparação com as tomadas por ApoPep- cíclica 1 após a segunda rodada de tratamento (r
2 = 0,705, Figura 4D) e pela ApoPep-1 linear após o primeiro (r
2 = 0,631, Figura 4A) e segunda rodada de tratamento (r
2 = 0,402, Figura 4B).
Os dados representam a correlação entre as intensidades de fluorescência NIR obtidos na Figura 2A e 2B e volumes tumorais obtidas na Figura 3A e 3B. (A) (B) A correlação entre as intensidades de fluorescência obtida pela ApoPep-1 linear após a primeira e segunda ronda de tratamento e os volumes de tumor. (C) (D) Correlação entre intensidades de fluorescência obtidos por cíclico ApoPep-1 depois da primeira e segunda rodada de tratamento e tumorais volumes.
Estabilidade da linear e cíclica ApoPep-1 no soro
foi examinado se os níveis mais elevados de sinais de imagem por o cíclico ApoPep-1 em comparação com aqueles da ApoPep-1 linear foi, devido à diferença na estabilidade do soro de péptidos. Após incubação da forma linear e cíclica de ApoPep-1 com soro de rato até 24 h, foi analisada a quantidade do péptido que permanece no soro. O pico de péptido foi separáveis picos inespecíficos de soro e a quantidade de forma linear e cíclica do péptido que permanece no soro, tal como calculado pela área do pico, não foi significativamente alterado até 24 h (Figura 5A e 5B, respectivamente). A análise por MS de cada pico de péptido confirmou a identidade do linear (Figura 5C) e forma cíclica (Figura 5D) de ApoPep-1. Estes resultados sugerem que ambas as formas linear e cíclica das ApoPep-1 são estáveis no soro até 24 horas com nenhuma diferença em termos de estabilidade durante o período de tempo de incubação.
lineares e péptidos cíclicos ApoPep-1 foram incubadas com soro de rato a 37 ° C durante os períodos de tempo indicados. (A) (B) de cadeia linear e de forma cíclica ApoPpep-1 Amostras de soro de ratinho e foram fraccionadas por C18 de fase inversa de FPLC. eixo Y representa a unidade de absorvância a 215 nm. Cada pico peptídeo foi indicado por uma seta e separável de picos de soro. (C) (D) espectro de MS do pico de péptido cíclico linear e recolhidos a partir de 24 h fração FPLC e lineares sintético e cíclica ApoPep-1.
Discussão
Aqui nós mostramos que o
in vivo
imagiologia de apoptose pela absorção de ApoPep-1 de tumor numa fase anterior (uma semana após o tratamento) poderia prever a resposta do tumor do estômago e subsequente redução no volume do tumor, numa fase posterior (três semanas depois do tratamento). Além disso, a forma cíclica de ApoPep-1 apresentaram maiores níveis de
in vitro
ligação às células em apoptose e
in vivo
sinais de imagem e diferença mais notável entre a cisplatina ou cetuximab sozinho e cisplatina com cetuximab em combinação do que a forma linear de 1 fez-ApoPep (detecção mais sensível). As intensidades de sinais de imagem tomadas pela cíclica ApoPep-1 após a primeira rodada de tratamento apresentaram correlação mais estreita com as mudanças no volume do tumor do que aqueles por linear ApoPep-1 (detecção mais específica). Estes resultados indicam que a imagem da apoptose usando o cíclica ApoPep-1 poderia ser uma ferramenta útil para uma decisão anterior da resposta do tumor no estômago após o tratamento anti-câncer do que ferramenta atualmente disponíveis com base na medição do tamanho do tumor por tomografia computadorizada.
apoptose de imagem que reconhecem diferentes biomarcadores foram marcadas com diversas porções de imagem e explorado para o monitoramento da resposta tumoral após o tratamento anti-cancro. Por exemplo, a fluorescência marcado com corante de anexina V foi determinada em ratinhos portadores de tumor do cólon após uma semana de tratamento com cetuximab e mostrou uma acumulação de pico às 24 h após a administração intravenosa, que foi associada a uma diminuição da absorção do factor de crescimento epidérmico e a activação de caspase -3 [28].
butil-2-metil-malónico de ácido que se liga ao fosfolípido aniónico foi determinado em ratinhos portadores de tumor do cólon 24 h após a quimioterapia e foi acumulado no tumor por 2 h após a injecção marcada com 3H, a qual foi acompanhada por uma redução de os pesos dos tumores [29]. A fluorescência corante-sonda marcada com péptido baseado em actividade de caspase foi determinada em ratinhos portadores de tumor do cólon, às 12 h após o tratamento com Apomab para induzir a apoptose, o que por sua vez mostrou sinais de fluorescência a 50 min após a injecção de [30]. anticorpo fosfatidilserina
124I-marcada foi injectada em ratinhos portadores de tumor da próstata em 24 h após tratamento com quimioterapia ou radioterapia, em que as imagens foram feitas 48 horas após a injecção de anticorpos e mostraram aumento da absorção do anticorpo no tumor e correlação inversa entre a absorção de anticorpos e a alteração no volume do tumor (R
2 = 0,85) [13]. Em comparação com os relatórios anteriores, nossos resultados sugerem que ApoPep-1 é uma sonda promissora em termos de taxa rápida absorção (2 h) e estreita correlação com a variação do volume tumoral (r
2 = 0,934).
uma forma cíclica de um péptido é geralmente mais estáveis contra a degradação pela protease e mais selectiva do que a sua ligação em forma linear [31] alvo. Uma forma cíclica do péptido RGD, por exemplo, mostra estabilidade melhorada contra a variação do pH [32]. Os ensaios clínicos como um potencial inibidor da angiogénese são submetidos com a forma cíclica de péptido RGD [31]. Em alguns casos, no entanto, a forma linear de um péptido mostrou uma actividade e sinais de imagem melhor ligação [31]. No presente estudo, comparamos forma linear e cíclica das ApoPep-1 para ver qual formulário apresenta melhor atividade na detecção de apoptose. Descobrimos que forma cíclica de ApoPep-1 foi mais sensível na ligação e detecção de células em apoptose do que sua forma linear. Por que a forma cíclica de ApoPep-1 mostrar melhor
e
actividade in vitro
vinculativo vivo
detecção de células em apoptose? Foi examinada a estabilidade de péptidos no soro. Foi anteriormente descrito que ApoPep-1 era estável até 2 h no soro [33]. Neste estudo, que prolongou o período de tempo de incubação e descobriu que tanto a forma cíclica de uma ApoPep-linear e foram estáveis na presença de soro até 24 h. Isto sugere que a diferença em termos de estabilidade no soro não contribui para a actividade de segmentação aperfeiçoado da forma cíclica da ApoPep-1 sobre a forma linear de ApoPep-1. Uma explicação alternativa pode ser que a formação da estrutura restrita por ligação dissulfureto pode conduzir à ligação mais favorável para as células apoptóticas pelo cíclico ApoPep-1 mais a sua forma linear.
Para além de corantes de fluorescência, ApoPep-1 pode ser marcados com isótopos radioactivos, tais como
123I,
18F, e
68Ga, por meio de ligadores químicos e ser utilizado como uma sonda para a tomografia de emissão de fotão único (SPECT) ou imagiologia de PET. Como futura direção, imagens PET de apoptose utilizando
linear 18F marcado ou cíclico ApoPep-1 continua a ser investigado para o monitoramento da resposta tumoral. imagem baseado em ApoPep-1 de apoptose seria útil no estudo de estratégias terapêuticas em clínicas e contribuir para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos anti-cancro.