Abstract

Frizzled receptor homólogo 3 foi regulado para cima em vários cancros gastrointestinais, tais como esôfago e cancros gástricos. Além disso, homólogo frizzled 3 relatou recentemente a ser expressa em amostras de adenoma colorrectal. No presente estudo, investigamos o significado clínico da frizzled proteína homólogo 3 em pacientes com câncer colorretal. Usando marcação imunocitoquímica, frizzled expressão homólogo 3 foi examinada em 186 espécimes de câncer colorretal, 79 espécimes colorectal adenoma, 133 amostras de pólipos colorretais, 127 amostras de cancro colorectal com nódulo linfático e /ou metástases à distância, 310 espécimes de vários carcinomas metastáticos de câncer não-colorretal e 40 espécimes com ocorrência simultânea de câncer colorretal, adenoma colorretal e pólipo colorretal. A análise estatística foi utilizado para correlacionar a expressão da proteína frizzled homólogo 3 a fatores clinicohistopathological, recorrência /metástase e sobrevida após o follow-up de 42 meses em pacientes com câncer colorretal. Frisado proteína homólogo 3 foi expressa em 100% dos espécimes câncer colorretal, 89% dos espécimes adenoma colorretal, 75% dos espécimes pólipo colorretal e 69% tecidos epiteliais colorretais normais. Além disso, frisado pontuações imunocitoquímicos homólogo 3 foram altamente correlacionados com a progressão do cancro colorectal. Além disso, frizzled homólogo 3 foi expressa em percentagem relativamente mais baixos do carcinoma hepatocelular metastático e carcinoma de células renais metastático clara com coloração focal e muito fraca do que os outros tipos de tumores metastáticos. Por outro lado, os frizzled homólogo de 3 pontos imunocitoquímicos de adenomas colorectais com carcinomas colorrectais síncronos foram significativamente mais elevados do que aqueles de adenomas colorectais puros. A análise estatística mostrou que homólogo 3 pontos imunocitoquímicos frizzled foram associados com o estágio de Dukes e status do nó de linfa. Finalmente, os grupos estratificados de pacientes com câncer colorretal teve diferenças significativas na sua recorrência /metástase e sobrevivência. Em conclusão, o presente estudo em grande escala mostrou claramente que frizzled proteína homólogo 3 pode gerar informações clinicamente importantes para pacientes com câncer colorretal.

Citation: Wong SCC, Ele CW, Chan CML, Chan AKC, Wong HT, Cheung MT, et al. (2013) Significado Clínico da Frizzled homólogo 3 Proteína em colorretais pacientes com câncer. PLoS ONE 8 (11): e79481. doi: 10.1371 /journal.pone.0079481

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 05 de maio de 2013; Aceito: 23 de setembro de 2013; Publicação: 08 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção directa a partir da Universidade chinesa de Hong Kong (Código do projeto: 2.041.412) e uma doação privada. No entanto, os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais freqüentemente diagnosticado em todo o mundo, sendo responsável por mais de. 1 milhão de casos e 600.000 mortes por ano [1]. O desenvolvimento de CRC é um processo multi-passo e esta doença pode ser controlado se detectado na sua fase inicial, quando é principalmente assintomática [2-4]. Apesar da considerável melhora a detecção, diagnóstico e tratamento de CRC nas últimas décadas, o prognóstico a longo prazo de pacientes com câncer colorretal metastático continua pobre [5,6]. Evidências clínicas mostram que os critérios de estadiamento atuais que são baseados em informações clínicas e patológicas, embora recentemente revisto, não refletem a variação no prognóstico e sobrevivência para câncer colorretal metastático [7]. Portanto, um marcador de prognóstico preciso que 1) determina a natureza biológica e comportamento do CRC, e 2) reflete as diferenças de sobrevivência e experiências clínicas, seria de extrema importância para otimizar o tratamento individual de pacientes com CCR.

fatores Wnt compreendem uma grande família de glicoproteínas segregadas que participam na regulação do desenvolvimento embrionário por padronização tecidual, organogénese, especificação do plano do corpo e promover a homeostase dos tecidos no adulto [8]. Ao nível celular, factores de Wnt controlar a proliferação, diferenciação, sobrevivência, motilidade e polaridade [9]. O controlo rigoroso da sinalização de Wnt é crucial para o desenvolvimento de orquestração correcto e aberrante de activação constitutiva da via de sinalização Wnt levará a proliferação descontrolada de células, o crescimento e sobrevivência, por conseguinte, promover o desenvolvimento do cancro [9]. Frizzled proteína homólogo (FZD) é um receptor do tipo transmembranar de sete passagens e dez membros (FZD1-FZD10) foram identificados em seres humanos [10]. Wnt é um ligando de FZDs e consiste em 19 genes familiares em humanos [11]. A ligação de ligandos aos seus receptores Wnt da superfície celular transduz sinais intracelular através de via Wnt-sinalização quer canónico ou não canónicas. Na via de sinalização Wnt canónica, Wnts se ligam a um complexo de FZD e receptores relacionados com a lipoproteína de baixa densidade 5 e 6 [12-14]. Os sinais resultantes impedir a fosforilação β-catenina por um complexo multiproteico composto da polipose adenomatosa coli, glicogénio sintase quinase 3β, casin cinase 1 e axins, e promover a estabilização da citosólica β-catenina que alguns dos que vai translocar para o núcleo [12- 14]. A β-catenina nuclear vai associar com factores de transcrição potenciador de células T /factor de linfócitos para activar genes de alvo que participam na sobrevivência celular, a proliferação ou a invasão [12-14]. A via de sinalização Wnt não-canônico consiste no Wnt /Ca

2 + via e Wnt /c-Jun N-terminal quinase (polaridade celular planar) via e Wnts se ligam a um complexo composto por FZD, receptor tirosina-quinase-like receptor órfão 2 /receptor relacionado com a tirosina-quinase para a activação de sinalização a jusante [12-14]. Em Wnt /Ca

2 + caminho, Wnt ativa intracelular Ca

2 + de sinalização, bem como Ca

2 + – proteínas quinases dependentes, como a proteína quinase C e calmodulina proteína quinase dependente II [12- 14]. Na via de Wnt /JNK, a estimulação do receptor activa Dishevelled, que por sua vez activa a família Rho de GTPases RhoA, tais como e Rac [12-14]. RhoA estimula a expressão de c-Jun através da fosforilação de c-Jun por quinase Rho associada [12-14]. Em resumo, FZD desempenha um papel crucial em ambas as vias canônicas e não canônicas.

Human

FZD3

foi mapeado no cromossomo 8p21 [10,15].

FZD3

mRNA é expresso em vários tecidos normais (músculo esquelético, rim, pâncreas, cerebelo e córtex cerebral) [10] que é regulado para cima em vários tipos de câncer (carcinoma de esôfago, carcinoma de células escamosas do pulmão, aguda primária e leucemia linfoblástica, mieloma, linfoma e sarcoma de Ewing) [16-19]. Um relatório recente mostrou que

FZD3

ARNm foi expressa em um pequeno grupo de adenoma esporádica e tecidos de adenoma polipose adenomatosa familiar [20]. O significado disto ainda não é conhecido e, portanto, será interessante para examinar a expressão de proteína FZD3 em um grande grupo de amostras de CRC primários e metastáticos e adenoma colorrectal amostras (CAD). A informação obtida será muito útil para nós para examinar o potencial prognóstico da proteína FZD3 em pacientes com CRC. Além disso, a expressão da proteína FZD3 em outros tipos de cancros metastáticos também foi examinado a fim de explorar se a proteína FZD3 pode ser usado como um marcador de diagnóstico para auxiliar CRC metastático.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

O estudo foi realizado de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes ou o parente mais próximo para a utilização dessas amostras na pesquisa. Desde consentimento do paciente não era possível para tecidos de arquivo como alguns pacientes foram falecido no momento do estudo, a comissão de ética dispensada especificamente a necessidade de consentimento dos pacientes. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Clínica Ética do Hospital Rainha Elizabeth, Hong Kong Região Administrativa Especial (RAE de Hong Kong).

Tissue espécimes

Sete coortes de formalina fixo, embebido em parafina (FFPE espécimes) foram recrutados: 1) CRC com Dukes sistema de classificação estágio A (43), fase B (48), fase C (63), fase D (32), no total: 186, 2) CAD com displasia leve (25), displasia moderada (28), displasia grave (26), no total: 79, 3) pólipo colorretal que é especificamente definido como pólipos não-adenomatosos ou não neoplásicas que consistem em juvenil (35), hiperplásico (40), de Peutz-Jeghers ( 28) e pólipos inflamatórios (30), total: 133, 4) um bloco de FFPE com metástases em linfonodos de cada espécime Dukes C, no total: 63, 5) uma quadra FFPE cada um com linfonodo e metástase distante de cada espécime Dukes D, Total: 64, 6) trezentos e dez carcinomas metastáticos não CRC que o tumor primário foi, respectivamente, de carcinoma hepatocelular (HCC) (23), o carcinoma das células renais claras (RCCC) (25), o carcinoma de células escamosas (SCC1s) (30) , adenocarcinoma do pulmão (LAC) (25), carcinoma do pulmão de não-pequenas células (LNSCC) (27), carcinoma papilar da tiróide (PTC) (24), carcinoma da mama (BC), (28), carcinoma de células claras ovário (OCCC) ( 30), o carcinoma do colo do útero não-pequenas células (CNSCC) (20), trompa de Falópio adenocarcinoma seroso (FTSAC) (22), carcinoma de células transicionais (TCC) (23), o carcinoma de células pequenas (CAA2) (15) e de carcinoma com neuroendócrino diferenciação (CND) (18), 7) espécimes de quarenta pacientes com CCR (10 Dukes a, 10 Dukes B, 12 Dukes C, 8 Dukes D) com ocorrência simultânea de CRC, adenoma e pólipo (120), foram recuperados dos arquivos (2005-2008) da Anatomia Patológica e Citologia Laboratory, Departamento de Patologia, Hospital Rainha Elizabeth, da RAEHK, por FZD3 imunocitoquímica (ICC) coloração.

A maioria dos casos de adenocarcinomas colorretais na primeira coorte foram moderadamente diferenciado (78%), enquanto o resto ou foram bem diferenciados (5%) ou pouco diferenciado (17%). A distribuição por sexo dos pacientes de adenocarcinoma foi de 58% do sexo masculino e 42% do sexo feminino. A idade variou de 42 a 89 anos de idade. Dos 79 espécimes de adenoma examinados em 2 coorte, 59% foi tubular, 35% foi tubuloviloso, e 6% foi adenomas vilosos. As percentagens de displasia leve, moderada e severa em adenomas foram 32, 35 e 33, respectivamente. A distribuição por sexo dos pacientes adenoma foi de 53% do sexo masculino e 47% do sexo feminino. A idade variou de 28 a 85 anos de idade. Os pólipos avaliadas em três coorte foram juvenil (26%), hiperplásico (30%), de Peutz-Jeghers (21%), e pólipos inflamatórios (23%). Dos 133 pólipos, a distribuição por sexo foi de 51% do sexo masculino, 49% do sexo feminino ea idade variou de 23 a 76 anos de idade. A informação clínica dos pacientes com ocorrência simultânea de CRC, adenomas e pólipos no sétimo coorte foram moderadamente diferenciado (75%), bem diferenciado (7%) ou pouco diferenciado (18%). A distribuição por sexo dos pacientes de adenocarcinoma foi de 60% do sexo masculino e 40% do sexo feminino. A idade variou de 45 a 87 anos

Antibody

anticorpo FZD3 monoclonais, anti-humano (diluição 1: 100, clone 169310, MAB1001, R D Systems, Inc., Minneapolis. , EUA) foi utilizado.

coloração ICC e avaliação

secções de tecido de série (4 mm de espessura) foram cortadas e recuperação antigênica foi realizada utilizando ligação de epitopos recuperação Solução 2 na bond-max automatizado imunohistoquímica (Visão Biosystems, Mount Waverley, Austrália) a 100 ° C durante 25 minutos. A coloração foi realizada de acordo com um protocolo padrão na imunohistoquímica. Sistema de detecção de polímero foi seleccionado para evitar o problema de coloração inespecífica biotina endógena. carcinoma esofágico foi usada como um controlo positivo [16], que foi montado em cada placa de teste e os controlos negativos foram realizados através da substituição do anticorpo com Tris salina. A fim de medir a expressão FZD3 em cada amostra de pacientes com precisão, um número máximo de células alvo com a intensidade de coloração que reflete o padrão de expressão geral é o principal critério para pontuação. As lâminas coradas foram avaliados em pelo menos 5 campos com o maior número de células alvo em microscópio de luz no X400 ampliação por 2 observadores independentes sem o conhecimento dos resultados clínicos e, no caso de desacordo, o consenso foi alcançado após uma discussão detalhada e exame lâminas usando um microscópio multi-dirigida. Aproximadamente 250 células seriam contados em cada campo e, portanto, pelo menos 1.250 células seriam contados para cada amostra de doente. Todas as lâminas foram marcados semi-quantitativamente e expresso como uma pontuação ICC multiplicando a “percentagem de células positivas” e a “intensidade de coloração”, tal como descrito anteriormente [21]. intensidade da coloração foi pontuada como segue: 0 = negativo; 1 = fraco; 2 = moderada; 3 = forte; e 4 = muito forte. A pontuação ICC variou de 0 a 400. A pontuação da porcentagem e coloração intensidade foi alvejado a 1) células CRC, 2) células-CAD e 3) células epiteliais normais adjacentes. a coloração das membranas deve ser o resultado esperado. No entanto, a nossa experiência mostrou que a coloração ICC utilizando diaminobenzidina como cromogénio iria produzir uma coloração membranoso espessa que foi semelhante a coloração citoplasmática. Além disso, o anticorpo utilizado neste estudo teve o melhor desempenho entre os anticorpos que tinham sido testados.

A análise estatística

A diferença na pontuação do ICC de proteína FZD3 entre CRC, CAD e células epiteliais normais adjacentes colorretal foi estudada usando teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Além disso, não paramétrico teste de correlação de Spearman foi utilizado para examinar se pontuações ICC FZD3 foram correlacionados com a progressão da CRC e estágios classificação de Dukes. Mann Whitney U foi usado para examinar se a pontuação do ICC de CAD com carcinomas colo-rectais síncronos teve diferença significativa daqueles de CAD puro. Para correlação com parâmetros clínicos, regressão multivariada foi utilizada para analisar se pontuações ICC FZD3 foram correlacionados com os fatores clínico-histopatológico dos pacientes e teste do qui-quadrado foi usado para examinar a associação entre a pontuação do ICC FZD3 e recorrente ou metastático CRC. A sobrevida global foi definida como aquela a partir da data da operação para a data de morte por câncer. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para determinar a probabilidade de sobrevivência e teste log-rank foi utilizado para comparar a sobrevivência entre os grupos e Cox modelo de risco proporcional foi aplicada para determinar os fatores prognósticos independentes de sobrevivência. (Statistical Package for a 16,0 software Ciências Sociais versão para Windows, estatísticas IBM SPSS, Chicago, IL., EUA). A

P

valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo em todas as análises. Todos

valores

P são bicaudais.

Resultados

ICC coloração

Como mencionado na seção de coloração ICC e avaliação, foi detectada uma coloração membranoso espessa que se assemelhava a coloração citoplasmática. Entre as 955 lâminas que examinamos, a variação inter-individual foi encontrado apenas em 16 slides (1,7%) e o consenso foi alcançado após discussão usando um microscópio multi-dirigida.

ICC coloração mostrou que a proteína FZD3 foi expressa em 100% (186/186) das amostras de CRC, 89% (70/79) dos espécimes de CAD, 75% (100/133) das amostras de pólipos colorretais e 69 % (129/186) dos tecidos epiteliais colo-rectais normais adjacentes aos tecidos CRC. A fotomicrografia representativa de cada tipo de amostra na primeira coorte foi mostrado na Figura 1. O controlo positivo de carcinoma de esôfago mostrou intensa coloração citoplasmática positiva enquanto o controlo negativo não têm qualquer coloração ICC (Figuras 1E e 1F). A análise detalhada mostrou que a Presença da proteína FZD3, como mostra a pontuação do ICC, houve diferença significativa entre CRC, CAD, pólipo colorretal e tecidos epiteliais normais colorretal (Figura 2,

P Art 0,0001, Kruskal-Wallis teste) e do intervalo e mediana das pontuações ICC em vários tipos de amostra foram apresentados na Tabela 1. FZD3 pontuação do ICC foram altamente correlacionados com os estágios da progressão da CRC (

P Art 0,0001, teste de Spearman ). Além disso, a pontuação do ICC de proteína FZD3 em amostras de CRC foi significativamente correlacionada com o estádio Dukes (Figura 3,

P Art 0,0001, Spearman teste de correlação de classificação). Além disso, os nossos resultados mostraram que a proteína FZD3 foi expressa em 100% de células metastáticas de CRC nos gânglios linfáticos e /ou órgãos distantes de Dukes 3 e 4 amostras, respectivamente (Figura 4). Em linha com esses resultados, continuamos a examinar se FZD3 pode ser usado como um marcador diagnóstico adjuvante para câncer colorretal metastático realizando FZD3 ICC coloração em 310 não-CRC espécimes de carcinoma metastático. Os resultados mostraram que a proteína FZD3 foi expressa em 17% (4/23) de HCC, 12% (25/03) de RCCC, 80% (24/30) de SCC1s, 84% (21/25) de ALC, 82% (22/27) do LNSCC, 88% (21/24) da PTC, 86% (24/28) do BC, 80% (24/30) do OCCC, 85% (17/20) dos CNSCC, 82% (18/22) de FTSAC, 74% (17/23) de CTP, 100% (15/15) de CAA2 e 100% (18/18) de CND (Figuras 5A e 5B). Em casos com resultados positivos, a análise detalhada mostrou que a coloração era focal e muito fraca no carcinoma hepatocelular, RCCC quando comparados com os de outros tipos de tumores (Figuras 5B e 6).

câncer colorretal

Colorectal adenoma colorretal

pólipo

normal adjacente epitelial do tecido

Número de specimens18679133186Range de ICC scores243 para 4000-3470 a 3600 a pontuação do ICC 279Median 32724119297.5Table 1. A gama ea mediana das pontuações ICC em vários tipos de amostra.

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(A) Percentagem de vários carcinomas metastáticos não CRC com coloração e ICC FZD3 (B ) pontuação do ICC de FZD3 em vários carcinomas metastáticos não-CRC. (HCC = carcinoma hepatocelular, RCCC = carcinoma de células claras renais, SCC1 = carcinoma de células escamosas, LAC = adenocarcinoma de pulmão, carcinoma de células não-pequenas LNSCC = pulmão, PTC = carcinoma de tireóide papilar, carcinoma BC = mama, OCCC = carcinoma de células claras ovário , CNSCC = cervical carcinoma de células não-pequenas, FTSAC = trompa de Falópio adenocarcinoma seroso, TCC = carcinoma de células transicionais, CAA2 = carcinoma de células pequenas e CND = carcinoma com diferenciação neuroendócrina).

Similar observações foram encontrados para espécimes com ocorrência simultânea de carcinoma colorretal, CAD e pólipo colorretal. coloração ICC para FZD3 foi observada em 100% (40/40) de CRC, 93% (37/40) de DAC, 70% (28/40) de pólipo colorretal. Além disso, a pontuação do ICC FZD3 foram altamente correlacionados com os estágios da progressão da CRC (

P Art 0,0001, Spearman teste de correlação de classificação). De interesse, a pontuação do ICC de CAD com carcinomas colo-rectais síncronas foram significativamente maiores do que os de CAD puro (

P Art 0,001, teste de Mann Whitney U, Figura 7).

multivariada análise de regressão

A análise de regressão multivariada foi aplicada para examinar se pontuações ICC FZD3 foram correlacionados com os fatores clinicohistopathological do 186 Dukes A a D pacientes CRC. Foram encontradas associações significativas com estágio de Dukes (

P Art 0,001), e estado dos linfonodos (

P Art 0,05), mas não para a idade (

P

= 0,547) , sexo (

P

= 0,813), estágio do tumor (

P

= 0,284) e grau de diferenciação (

P

= 0,462).

recorrente ou metastático CRC

O número médio de FZD3 pontuação do ICC do 154 Dukes A a pacientes C CRC foi 321,5. Usando este número mediano como ponto de corte, 27 pacientes com FZD3 pontuação ICC 321,5 e 8 pacientes com FZD3 pontuação ICC ≤ 321,5 teve CRC recorrente ou metastático, após seguimento por 42 meses ea associação entre os escores FZD3 ICC e recorrente ou metastático CRC foi altamente significativa de teste (qui-quadrado: χ

2 = 13,34 ;

P Art 0,001).

sobrevida global dos pacientes CRC

curvas de sobrevida global foram plotados para pacientes de CRC com FZD3 ICC pontuações 327 e aqueles com FZD3 pontuações ICC ≤ 327, onde 327 é o número médio de FZD3 coeficiente de CCI a partir de 1

st coorte de 186 Dukes A para pacientes D CRC. Nossos resultados mostraram que a sobrevivência para os 2 grupos de pacientes foi significativamente diferente (

P Art 0,0001, teste log-rank, Figura 8A). A fim de analisar os dados de uma forma mais específica, as pontuações FZD3 ICC foram divididos em 4 grupos após alinhamento que, por ordem decrescente: 1) expressão de alto FZD3: mais alto de 25% (76% a 100%) obteve ICC, 2) moderadamente alta expressão FZD3: segundas mais altas de 25% (51% a 75%) marca ICC, 3) moderadamente baixa expressão FZD3: segunda mais baixa de 25% (26% a 50%) pontuações ICC e 4) baixa expressão FZD3: menor de 25% (0 % a 25 pontuações%) ICC. Como mostrado nas Figuras 8B e 8C, a sobrevivência entre os grupos 1 e 4 e os grupos 2 e 3 foram significativas (

P Art 0,0001 para A vs D e

P Art 0,05 para B vs C, teste log-rank). Finalmente, os fatores prognósticos independentes de sobrevida global identificado pelo modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox foram encontrados para ser FZD3 pontuação ICC (

P

= 0,016) e estado dos linfonodos (

P

= 0,037) .

Discussão

FZD3 é um receptor para a via Wnt-sinalização e é necessário proteína FZD3 para o desenvolvimento de grandes feixes de fibras no sistema nervoso central rostral [22], da crista neural [23] e desenvolvimento do folículo piloso [24]. Além disso, a proteína FZD3 tem um papel predominante no crescimento de neurites induzido por Wnt em Ewing células tumorais sarcoma [25] e é altamente expressa em pouco diferenciados tecidos de carcinoma de esôfago de células escamosas [16]. Para o melhor de nosso conhecimento, este estudo é o primeiro a examinar o significado clínico da expressão da proteína FZD3 em uma grande coorte de CRC e seus CAD e pólipos colorectal espécimes pré-malignas. Apesar do facto de a proteína FZD3 foi expressa em 100% das amostras de CRC, 89% dos espécimes de CAD, 75% das amostras de pólipos colorectais e tecidos epiteliais colo-rectais normais de 69% adjacentes, a imunorreactividade de FZD3 houve diferença significativa entre os 4 grupos de amostras. Além disso, a expressão da proteína FZD3 em CAD, como mostrado por nós combina com os de um estudo anterior que FZD3 mRNA expresso em 79% (11/14) das amostras de CAD com uma mudança dobra mediana de 6,5 [26]. No entanto, FZD3 ARNm só foi encontrada para ter uma sobre-regulação significativa em 39% (9/23) amostras de CRC no mesmo estudo [26]. As razões são responsáveis ​​para este resultado conflituoso pode ser explicado pelas seguintes razões: 1) Um pequeno número (23) de amostras de CRC foram recrutados em comparação com a nossa, 2) ARNm foi detectada enquanto que foi detectada proteína no nosso estudo, 3) normal adjacente os tecidos foram misturados com os tecidos de CRC como não micro dissecção foi realizada no seu estudo. O último ponto é particularmente significativa porque os graus variáveis ​​de tecidos normais adjacentes serão geralmente encontrados em amostras cirúrgicas e os nossos resultados mostraram que a proteína FZD3 não foi expresso apenas em 69% dos tecidos epiteliais colo-rectais normais adjacentes, mas também em fibroblastos, células endoteliais, linfócitos e histiócitos (dados não mostrados). ICC coloração de uma secção de tecido permite-nos a examinar a célula individual ao microscópio e, por conseguinte, a expressão da proteína FZD3 em células tumorais e normais pode ser quantificada separadamente. Na realidade, a coloração com ICC de proteína FZD3 era mais forte, não só na parte da frente invasiva do que no centro do tumor, mas também é muito intensa em todos os linfonodos metastáticos e órgãos distantes. Esta constatação notável pode mostrar que a proteína FZD3 tem um papel importante não só na carcinogénese CRC início, mas também em CRC caminho metastático para nodos linfáticos e órgãos distantes. No entanto, a distribuição polarizada focal de FZD3 como mostrado por Pourreyron et ai. não foi encontrado em nossa coorte de espécimes [27]. Continuamos a investigar o potencial de proteína FZD3 como um marcador diagnóstico adjuvante no câncer colorretal metastático através da realização de coloração ICC em vários tipos de carcinomas metastáticos não-CRC. Nossos resultados são muito interessantes porque coloração ICC para FZD3 foi positivo em graus diferentes em todos os carcinomas metastáticos. No entanto, a coloração positiva em apenas 17% dos HCC e 12% de RCCC mostra que a proteína FZD3 pode não ser tão essencial para o processo metastático desses carcinomas 2 (Figuras 5A e 5B). Em resumo, FZD3 ICC coloração pode ser útil para excluir esses 2 carcinomas em cima do diagnóstico patológico porque a coloração era focal e muito fraco naqueles FZD3 coloração casos de carcinoma hepatocelular e RCCC positivos quando comparados com os de outros tipos de tumores. Por outro lado, a proteína FZD3 foi expressa em carcinomas metastáticos que incluem SCC1, LAC, LNSCC, PTC, BC, OCCC, CNSCC, FTSAC, TCC, CAA2 e CND. Esses novos resultados mostram que a proteína pode FZD3 podem estar envolvidos no processo de metástase desses carcinomas. Na realidade, a forte coloração de proteína FZD3 em todos os casos de CND e CAA2 não é surpreendente porque a proteína FZD3 é bem conhecido por estar envolvido no desenvolvimento do sistema nervoso central [22,23,28]. Em linha com esses resultados, que atualmente são examinar a expressão da proteína FZD3 em seus respectivos tumores primários para os 11 tipos de carcinomas-CRC não metastáticos que têm alto nível de expressão da proteína FZD3, a fim de ter uma maior compreensão sobre o papel da proteína FZD3 em várias vias de carcinogénese.

Outro resultado interessante deste estudo é que a pontuação ICC médio do DAC associada com carcinomas colorrectais síncronas é muito mais elevada do que a de um grupo consistindo de CAD puro, sugerindo que uma proteína de alta FZD3 expressão em CAD pode significar um potencial de malignidade superior.

O objetivo final deste estudo é explorar o significado clínico da proteína FZD3 em pacientes com CRC. Como atualmente não há escassa marcador prognóstico patologicamente usado para CRC e, portanto, é de valor inestimável para investigar o potencial prognóstico da proteína FZD3 que é demonstrado neste estudo pela correlação significativa do coeficiente de CCI FZD3 a fase Dukes, estado linfonodal, recorrência ou metástase. Além disso, a longo prazo de seguimento desses pacientes CRC mostrou que pacientes com uma pontuação elevada ICC FZD3 pode ter uma menor chance de sobrevivência. Na verdade, os espécimes com pontuações FZD3 ICC 327 eram principalmente de estágios III e IV pacientes enquanto aqueles com FZD3 pontuações ICC ≤ 327 eram na maioria dos estádios I e II pacientes. Esta pode ser uma explicação para as fases III e IV pacientes têm um maior risco de recorrência, metástase e sobrevida mais curta do que as fases I e II, os doentes. Uma análise mais detalhada dos dados, classificando-a em 4 grupos com base em seu nível de expressão pode nos fornecer mais informações sobre o significado prognóstico da proteína FZD3 em pacientes com CCR. A diferença significativa na sobrevida entre os grupos de alta e baixa expressão é esperado enquanto a diferença marginal significativa (

P Art 0,05) na sobrevivência entre os grupos de expressão moderadamente altos e moderadamente baixa fornece uma evidência sólida de que a proteína FZD3 tem importante prognóstico poder. Tomadas todas essas conclusões juntos, FZD3 ICC coloração pode, potencialmente, ser uma ferramenta valiosa para o prognóstico da CRC. Para validar esses achados, um grande estudo multicêntrico com um longo prazo de seguimento em examinar seu significado prognóstico está agora a ser preparado. Wnt5a humana, Wnt5B e Wnt11 são representativos não-canônico Wnts transdução de sinais de polaridade celular Wnt /planares através de receptores FZD3 [10,29-31]. Um estudo recente mostrou que as vias de resposta Wnt foram re-organizados em carcinogênese colorretal cedo como o regulador negativo da via de sinalização Wnt, cutícula nua homólogo 1 de indução foi acompanhado por aumento da regulação do receptor FZD3 β-independente-catenina em CAD e CRC [26]. Além disso, FZD3 não respondeu a estabilização da β-catenina

in vitro

e exigiu um sinal de ligante Wnt [26]. Portanto, FZD3 pode fornecer uma indicação do grau de sinalização Wnt ligando no tumor colo-rectal. De facto, um pequeno grupo de amostras (20) com FZD3 forte e fracamente positivos foram recrutados e uma comparação directa de FZD3 imunocoloração para aqueles de beta-catenina foi realizada e verificou-se que não havia qualquer correlação entre FZD3 e imunocoloração beta-catenina (dados não mostrados). Este achado pode reforçar o papel da FZD3 na via de sinalização Wnt não-canônico. Juntamente com os resultados deste estudo, a expressão da proteína FZD3 em vários estágios clínicos de CRC pode demonstrar ainda mais o significado clínico de FZD3 em pacientes com CCR. Nosso próximo passo é examinar os mecanismos moleculares subjacentes que regulam a expressão FZD3 e os genes diretos transcrição alvo de FZD3 usando knockdown específico de FZD3 por pequeno RNA de interferência em linhas celulares de CRC, porque terapia-alvo por meio de marcadores moleculares é uma meta importante para melhorar os resultados de pacientes com CCR. Além disso, a detecção de proteína FZD3 no soro do doente utilizando o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima também vai ser explorado de modo a avaliar se a proteína FZD3 soro pode ser utilizada como um marcador não-invasiva. No entanto, uma limitação importante deste estudo é que não temos a informação clínica para avaliar o desempenho de proteína FZD3 comparando a sua expressão a marcador CRC convencional, tal como antígeno carcinoembrionário soro.

Em resumo, a expressão da proteína FZD3 como mostrado por coloração ICC está estreitamente correlacionada com a carcinogênese colorretal e progressão, e pode potencialmente servir como um novo marcador de prognóstico. Além disso, FZD3 ICC coloração pode ser útil para excluir HCC e RCCC em locais metastáticos.

Reconhecimentos

Estamos gratos ao Professor Benjamin Y.M. Yung e Sr. Chiu Ka Yue pelo apoio excepcional.