Abstract

Fundo

BIRC6 é um membro dos inibidores de apoptose Protein (IAP) família que é pensado para proteger uma variedade de células cancerosas da apoptose. O principal objetivo do presente estudo foi investigar se BIRC6 desempenha um papel no câncer de próstata e pode ser útil como um novo alvo terapêutico.

Métodos

expressão BIRC6 em linhas celulares foi avaliada usando Ocidental blot análise e em amostras clínicas utilizando imuno-histoquímica de microarrays de tecido. O significado biológico de BIRC6 foi determinada pela redução induzida por siRNA de

expressão BIRC6

em células LNCaP seguido por ensaios funcionais.

Resultados

expressão da proteína Elevated BIRC6 foi encontrado na próstata linhas celulares de cancro e amostras clínicas distintas de suas contrapartes benignas. Aumento da expressão BIRC6 foi associado a cânceres Gleason 6-8 e resistência à castração. Redução da expressão em células LNCaP BIRC6 levou a uma redução acentuada na proliferação de células, que foi associada com um aumento da apoptose e uma diminuição na formação autophagosome. A apoptose induzida por doxorrubicina foi encontrado para ser acoplado a uma redução da expressão da proteína BIRC6.

Conclusão

Os dados sugerem um papel para BIRC6 na progressão do cancro da próstata e a resistência ao tratamento, e indicar para o primeiro tempo em que o

BIRC6

gene e seus produtos são alvos potencialmente valiosos para o tratamento de cancros da próstata

Citation:. baixa CG, Luk ISU, Lin D, Fazli L, Yang K, Xu Y, et ai. (2013) Protein BIRC6, um inibidor da apoptose: Papel na sobrevivência de células cancerosas humanas da próstata. PLoS ONE 8 (2): e55837. doi: 10.1371 /journal.pone.0055837

editor: Kin Mang Lau, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 16 de Agosto de 2012; Aceito: 02 de janeiro de 2013; Publicação: 08 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Low et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancros da próstata geralmente se apresentam como tumores andrógeno-dependentes, suscetíveis ao crescimento de detenção /apoptose induzida por terapia de ablação do andrógeno [1]. Embora inicialmente eficaz, ablação de androgénio conduz frequentemente ao desenvolvimento de cancro resistente à castração (independente de androgénios) da próstata, que é em geral também resistentes a outros tratamentos disponíveis. Como tal, a resistência à castração comumente marca a forma de fase terminal de cancro da próstata e é o principal obstáculo na gestão da doença [1]. Desenvolvimento do cancro da próstata resistente à castração está caracteristicamente associada com aumentos significativos na resistência à apoptose, a principal via de morte por acção da droga [1] – [3]. A resistência à apoptose resultante da sobre-regulação de genes anti-apoptóticos e os seus produtos se pensa ser um factor-chave no desenvolvimento da resistência à castração, assim como a resistência geral para tratamentos anti-cancro. Elucidar o papel do anti-apoptóticos genes /proteínas na progressão do câncer de próstata é, portanto, susceptível de conduzir a melhorias no tratamento da doença refratária.

Os inibidores de apoptose Protein (IAP) família foi avaliado para jogar um papel na resistência à apoptose numa variedade de linhas de células de cancro e é caracterizada pela presença de proteínas de um a três cópias de um domínio de repetição de IAP de baculovírus (BIR). Os PAI Foi demonstrado que se ligam a e inibem uma variedade de factores pró-apoptóticos, assim efectivamente suprimir a apoptose induzida por uma grande variedade de efectores, incluindo quimioterápicos e irradiação [4]. O domínio BIR é essencial para a interacção das IAP com factores pró-apoptóticos, incluindo caspases. As caspases são uma família de proteases específicas de ácido cisteína-aspártico, presente numa forma pró-que, uma vez activado através de clivagem, é responsável pela degradação de substratos de morte, tais como poli-ADP-ribose-polimerase (PARP) accionando assim a apoptose. Caspase-3 clivada e PARP clivada pode ser prontamente detectada por análise de Western blot, e são vulgarmente utilizados como marcadores para apoptose [5].

A apoptose é muitas vezes associada com autofagia, um processo que envolve a degradação lisossomal dos próprios componentes de uma célula [6]. Trata-se de embalagens de proteínas e organelos dentro autofagossomas, seguido por fusão com lisossomas que conduzem à degradação das proteínas e organelos. O papel da autofagia no desenvolvimento de câncer e seu tratamento é complexo, pois há evidências de que a autofagia pode promover e suprimir o crescimento do câncer [7]. A inibição da autofagia por disrupção de genes essenciais autophagy foi mostrado para promover a tumorigénese e, portanto, autofagia pode ter um efeito supressor do tumor-[8] – [11]. No entanto, há evidências crescentes de que a autofagia pode actuar como um mecanismo de sobrevivência para as células do cancro em resposta a uma vasta gama de tensões, incluindo o tratamento com agentes anti-cancro [7].

Para detectar a actividade autophagic em células cultivadas , detecção de Western blot de LC3B-II é frequentemente utilizado. LC3B-II está especificamente associada com autofagossomas e níveis de LC3B-II tem sido demonstrada estar correlacionada com o número de autofagossomas dentro das células [12] – [15]. No entanto, desde LC3B-II é degradada após a fusão autophagosome-lisossoma, os níveis LC3B-II oferecem apenas um instantâneo do número de autofagossomas em células de uma só vez de apontar e não indicam um aumento da regulação ou para baixo-regulação da autofagia na sua totalidade [13], [15]. Em conformidade, um decréscimo no número de autofagossomas numa célula pode ocorrer por uma diminuição na formação autophagosome ou um aumento da degradação autophagosome. Detecção de outras proteínas autofagia críticos como beclin-1 pode oferecer uma visão mais aprofundada a ativação da autofagia dentro dessas células. Esta proteína está envolvida na activação de ambos os autofagia via de sinalização e, no passo inicial da formação do autophagosome [12], [16]. Atualmente não há evidências sugerindo um papel para IAPs na regulação da autofagia em seres humanos.

A proteína BIRC6 é a 528 kDa, uma invulgarmente grande membro da família IAP. É constituída por um único domínio BIR N-terminal e um domínio de conjugação de ubiquitina C-terminal (UBC); esta última tem uma actividade de ubiquitina-ligase quimérico E2 /E3, assim como actividade anti-apoptótica [17]. Através de seu domínio BIR, BIRC6 é capaz de se ligar e inibir caspases ativos, incluindo caspases-3, 6, 7 e 9, e tais interações foram mostrados estar subjacente a capacidade do BIRC6 para inibir a cascata de caspase e, finalmente, a apoptose [17]. Através de seu domínio UBC, BIRC6 facilita a degradação proteossómica de proteínas pró-apoptóticos caspase-9 [18], SMAC /DIABLO [18], [19] e HTRA2 /OMI [17], [20]. BIRC6 é também um regulador crítico da citocinese e, consequentemente, desempenha um papel importante na proliferação de células [21].

Evidência recente suporta um papel alargado para BIRC6 em conferir resistência à apoptose de células cancerosas, tal como indicado pela

In vitro

estudos com células de gliomas [22], cancros do pulmão [23], cânceres cervicais [19], [21], [24], [25], fibrossarcomas [18], [24], osteossarcomas [21] , cancros da mama [24], [26] e cancros do cólon [27]. Em células da mama e cancro do pulmão, a apoptose desencadeada pela perda de expressão BIRC6 foi demonstrada para envolver estabilização de p53 [23], [26]. expressão BIRC6 em amostras de câncer clínicos tem sido observado para o cancro colorectal [28] e da infância

de novo

leucemia mielóide aguda (LMA) [29]. Na última expressão, elevada de

BIRC6

mRNA foi associada a uma resposta desfavorável à quimioterapia e sobrevida livre de recidiva pobres [29]. Um papel para BIRC6 no câncer de próstata, no entanto, não tem sido relatada.

elevações No presente estudo, a análise das linhas celulares de cancro da próstata humana e espécimes clínicos mostraram marcados na expressão BIRC6 pelos malignos células /tecidos como distinto de suas contrapartes benignas. Em particular, o aumento da expressão BIRC6 foi associada com cancros de Gleason 6-8 e resistência castração. Além disso, knockdown induzida por siARN da BIRC6 levou a uma redução acentuada na proliferação celular de células de cancro da próstata LNCaP. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que BIRC6 representa um novo alvo terapêutico para o tratamento de câncer de próstata refratário.

Materiais e Métodos

Materiais

Chemicals, foram obtidos solventes e soluções da Sigma-Aldrich Canada Ltd, Oakville, ON, Canadá, salvo indicação em contrário.

Clinical Câncer de próstata tecidos

as amostras foram obtidas de pacientes, com o seu consentimento informado, seguindo um protocolo aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa clínica da University of British Columbia e do BC Cancer Agency. Gleason-graduadas microarrays de tecido (TMAs) foram utilizadas com 35 espécimes benignas da próstata, 6 espécimes neoplasia prostática-intraepitelial e 157 amostras de cancro prostatectomia radical da próstata. As amostras de cancro consistiu de 74 Gleason score 6, 23 Gleason score 7, 43 Gleason 8, 2 escore de Gleason 9 e 15 de Gleason marcar 10 tecidos que não haviam sido submetidos ao neo-adjuvante terapia hormonal e 10 tecidos de câncer de próstata que tinha sido submetido a terapia hormonal neo-adjuvante e tinha progredido para a doença resistente à castração. Os últimos 10 tecidos tiveram pontuação de Gleason de 8 (n = 6) e 10 (n = 4) antes da terapia. As amostras para a construção TMA foram selecionados aleatoriamente a partir de coleções no Centro de próstata Vancouver, Vancouver General Hospital (fornecido pelo Departamento de Patologia da Universidade de British Columbia, Vancouver, BC, Canadá). Preparação do tecido e construção TMA foram realizadas como descrito [30].

A imuno-histoquímica

análises de imuno-histoquímica foi realizada como descrito [31] utilizando um anticorpo policlonal de coelho anti-BIRC6 (Novus Biologicals, Littleton, CO ; NB110-40730) a uma diluição 1:100. Todas as seções utilizados para imuno-histoquímica foram contrastadas com 5% (w /v) hematoxilina de Harris

BIRC6 Protein Scoring

coloração BIRC6 dos tecidos foi avaliada por um patologista e atribuída uma pontuação de 0, 1. , 2 ou 3, representando nenhuma coloração BIRC6, fraca, moderada e forte intensidade de coloração BIRC6, respectivamente. positividade por cento (como uma medida da frequência de coloração) foi calculada para cada grupo com base no número de secções com intensidades de coloração de ‘1’ ou superior.

Linhas Celulares

célula cancerosa Six próstata humana linhas (LNCaP; PC3; PC3-M; DU145; C42; VCaP), duas linhas prostática benigna celulares (BPH1, RWPE1) e duas linhas de células que se sabe expressarem BIRC6 (OVCAR-8, HeLa) foram mantidas em meio suplementado com FBS ( 10%), penicilina G (100 UI /mL) e estreptomicina (100 ug /ml) numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO

2 [22]. As células cancerígenas foram cultivadas usando meio RPMI-1640, as células foram cultivadas utilizando BPH1 DMEM, e as células de queratinócitos RWPE1 utilizando-SFM (Gibco-BRL; Burlington, ON, Canadá). As linhas celulares foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Para determinar o efeito da apoptose em BIRC6 expressão em células LNCaP, 600.000 células foram semeadas em placas de 6 poços e incubadas durante a noite e, em seguida, incubadas com doxorrubicina (1 ug /ml).

Western Blotting

Os lisados ​​celulares foram preparados utilizando tampão de lise celular (1% de NP-40, 0,5% de ácido desoxicólico de sódio). Para a detecção de BIRC6 (528 kDa), 10 ug inteiro lisado celular foi executado em uma de duas partes (5% e 12,5%) em gel de SDS-poliacrilamida. Os geles foram cortados, e BIRC6 foi electrotransferidas para uma membrana de PVDF em tampão Tris (25 mM) glicina (191,5 mM), metanol (10%), SDS (0,05%), usando um aparelho de transferência semi-seca. As membranas foram sondadas para BIRC6 com anticorpo anti-BIRC6 policlonal de coelho (1:500; Novus Biologicals). Para a detecção da PARP, caspase-3, LC3B-I, II e LC3B-beclin-expressão da proteína 1, 5-15 ^ g de lisado de células inteiras foi executado no dia 10 ou 12,5% géis de SDS-poliacrilamida e, a seguir a transferência de proteína, as membranas eram sondado utilizando anticorpo de coelho anti-PARP e-caspase-3 anti-anticorpos (1:1000; Cell Signaling; Beverly, MA), anticorpos anti-coelho (LC3B 0.85:1000; Abcam, Cambridge, MA) e anticorpos de coelho anti-beclin-1 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Actina ou vinculina foram utilizados como controlos de carga e detectados nas membranas, utilizando anticorpo de coelho anti-actina policlonal (1:2000; Sigma-Aldrich) e de rato anti-anticorpo vinculina. (1:3000; Sigma-Aldrich)

pequeno ARN interferente (siRNA) e transfecção celular

siRNAs personalizado sintetizados por Dharmacon (Lafayette, CO) e conhecidos por alvejar

BIRC6

tinham as seguintes sequências: siRNA-1, sentido, 5′ GUU-UCA-AAG-CAG-GAU-GAU-L-dTdT-3 ‘[23] e siRNA-2, sentido, 5′-AGG-CUC-AGA-gua-CUG-CUC-A-dTdT-3’ [ ,,,0],21]. Non-targeting siRNA (siGENOME não Segmentação SmartPool; Dharmacon) foi usado como controle. Para examinar o efeito dos siRNAs na expressão da proteína BIRC6, as células LNCaP foram plaqueadas em placas de 6 poços em meio RPMI-1640 livre de antibióticos suplementado com soro fetal de bovino (10%). Após 24 h, as células foram transfectadas com 100 nM de ARNsi no reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen; Burlington, ON) seguindo as instruções do fabricante. controlo do veículo e não segmentação de siRNA foram aplicados a culturas de células de replicar.

MTT Assay Viabilidade

Vinte e cinco mil células foram semeadas por poço de um prato de 24 cavidades e foram transfectadas com ARNsi-2 . Aos 0, 24, 48 e 72 h após a transfecção, 50 ul de MTT (5 mg /mL) foi adicionado a cada poço e as culturas foram incubadas numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO

2 durante 4 h . Quinhentos mL de solução de SDS a 20% foi então adicionada a cada poço e incubou-se durante a noite à temperatura ambiente na ausência de luz. As amostras (100 ul) foram então transferidas para placas de 96 poços. A absorvância foi medida a 570 nm.

Ciclo Celular

A distribuição do ciclo celular de células LNCaP foi determinada por citometria de fluxo de iodeto de propídio (PI) células coradas. As células foram cultivadas em RPMI-10% de FBS forma e subsequentemente tratado com

BIRC6

siARN. Quarenta e oito horas após o tratamento com siRNA, as células foram fixadas em 70% de etanol e, em seguida, armazenada a 4 ° C durante a noite. As células fixadas foram lavadas uma vez com PBS. Após centrifugação, as células foram coradas com 10 ug /mL de iodeto de propídio (PI), 1 mg /ml de RNase e 0,1% de Triton X-100 por 30 minutos em gelo. histogramas de ADN foram obtidos por análise de 10.000 células. Determinou-se a proporção de células em G1, S, e G2 + M do ciclo celular.

Anexina-V Ensaios

A apoptose foi medida por separador de células activado por fluorescência (FACS) com anexina -V conjugado com isotiocianato de fluoresceína (anexina V-FITC) (BD Biosciences Pharmingen) para a apoptose precoce e iodeto de propídio (PI) para a coloração de apoptose tardia seguindo o protocolo do fabricante. As células foram cultivadas em RPMI-10% de FBS forma e subsequentemente tratado com

BIRC6

siARN. Quarenta e oito horas após o tratamento com siRNA, as células foram colhidas, lavadas com PBS frio e, em seguida, ressuspensas em 1X tampão de ligação (BD PharMingen, San Diego, CA) a uma concentração de ~ 1 × 10

6 células /ml. As suspensões de células (100 ul; ~ 1 × 10

5 células) foram transferidos para novos tubos, e foram adicionadas alíquotas de 5 ul PI Anexina V-FITC e 5 uL. As células foram incubadas no escuro durante 15 min a 21 ° C. Anexina-FITC de fluorescência foi medida no canal FL1 (utilizando um filtro passa-banda de 530/30) e PI no canal FL3 (BP 660/20 filtro passa-banda do filtro). Dez mil eventos foram recolhidas. A apoptose foi avaliada por meio da contagem da percentagem de células AnnexinV-positivos. Os dados são apresentados como médias ± DP de cultura em triplicado.

Formação LC3-GFP puncta Ensaio e quantificação

células LNCaP foram semeadas em lamelas em placas de 6 cavidades e foram transfectadas com 100 nM não-alvo siRNA ou BIRC6 siRNA-2 no dia seguinte usando Oligofectamine. Quarenta e oito horas após o siARN transfecção, as células foram transfectadas com 3? G de LC3-GFP por poço por XtremeGENE (Roche) e as células foram fixadas em 4% de paraformaldeído 27 horas após a transfecção. formação de pontos lacrimais LC3-GFP foi induzida por 6 horas antes da fixação por meio de tratamento com 10 uM de cloroquina em meio isento de soro. Após a fixação, lamelas foram montadas com solução de montagem DAPI. As imagens fluorescentes foram tomadas por microscópio confocal. A quantificação de células autofágicos: autophagic células foram referidas como células contendo mais do que 15 pontos lacrimais LC3-GFP. Percentagem de células autofágicos foi calculada como o número de células autofágicos dividido pelo número de células positivas para GFP-LC3 × 100.

Análise estatística

de Student

t

-test foi utilizado e resultados com um

P

-valor. 0,05 foram considerados significativos

resultados

Elevated BIRC6 Níveis de proteína em linhas de células cancerosas humanas da próstata

transferência de Western revelou a expressão da proteína BIRC6 forte em todas as linhas celulares de cancro da próstata examinados (Fig. 1). Em contraste, apenas baixos níveis de expressão da proteína BIRC6 foram detectados em linhas celulares da próstata benigna e BPH1 RWPE1. Moderada a forte expressão BIRC6 foi detectada em células HeLa e OVCAR8 como relatado por outros [17], [22]. Os resultados são representativos de três experiências independentes.

BIRC6 expressão da proteína em células malignas da próstata (Pistas 1-6), controlo positivo de células cervicais e ovarianos malignos (pistas 7-8) e células benignas da próstata (pistas 9-10 ).

Elevated BIRC6 Níveis de proteína em Gleason Golos de cancro da próstata tecidos

secções de tecido da próstata clínicos clínicos, morfologicamente classificados em tecido benigno e câncer de Gleason score 6-8 e 9-10 , estavam manchados e marcou para a expressão BIRC6. coloração citoplasmática positiva para BIRC6 era, em geral, baixa no epitélio benigna, substancialmente mais intenso no bem diferenciado de Gleason de grau 3 e mais forte em tecidos de cancro da próstata de Gleason 4 fracamente diferenciados (Fig. 2A-D). Gleason de grau 5 tecidos expressa geralmente níveis mais baixos de BIRC6 coloração em relação aos outros tecidos do cancro da próstata, semelhantes a tecidos benignos. As secções que contêm tecido benigno e tecido de cancro (Gleason de grau 3) mostraram forte coloração positiva BIRC6 no epitélio maligno e expressão ausente ou fraco no epitélio benigna (dados não mostrados). Significam intensidades de coloração de PIN foram ligeiramente elevada em comparação com epitélio benigna, embora não significativamente elevados (dados não mostrados). No Gleason marcou tecidos (Fig. 2E), expressão de BIRC6 foi baixa para tecidos benignos e aumentou de forma constante, atingindo o pico em Gleason score 7 tipos de câncer. Expressão na escala de Gleason 8 cancros foi menor e uma nova queda para níveis semelhantes aos de tecidos benignos foi visto pela escala de Gleason 9-10 espécimes. As intensidades de coloração médios para cada grupo foram de 1,00 ± 0,80 DP para epitélio benigna e 1,53 ± 0,92 S.D. (

P

= 3,24 × 10

-3) para Gleason score 6, 2,22 ± 0,90 DP (

P

= 4.45 × 10

-6) para Gleason score 7 e 1,60 ± 0,82 DP (

P

= 1,63 × 10

-3) para a escala de Gleason 8 tecidos de câncer de próstata. A intensidade de expressão BIRC6 em Gleason 9-10 tecidos de cancro da próstata foi semelhante à dos tecidos benignos (0,71 ± 0,47 D.P. .;

P

= 0,10). Além disso, a baixa intensidade de expressão observada na escala de Gleason 9-10 tecidos de câncer de próstata era um reflexo da grande proporção de geralmente fracos grau Gleason expressando BIRC6 5 cânceres encontrados neste grupo.

A, setas indicando citoplasmática fraca coloração BIRC6 em células luminais prostática benigna (score ‘1’). B, setas indicando coloração BIRC6 citoplasmática moderada no grau 3 células cancerosas da próstata Gleason (score ‘2’). C, as setas que indicam forte coloração BIRC6 citoplasmática em Gleason grau 4 células cancerosas da próstata (score ‘3’). D, setas indicando fraca coloração BIRC6 citoplasmática no grau 5 células cancerosas da próstata Gleason (score ‘1’). E, barras pretas representam a intensidade da coloração média BIRC6 no epitélio da próstata benigna (n = 35) e classificação de Gleason 6 (n = 74), 7 (n = 23), 8 (n = 43) e 9-10 (n = 17) paciente tecidos de câncer de próstata. barras cinzentas representam frequência de expressão BIRC6 (pontuação ≥1). intensidades de coloração elevadas foram observadas na escala de Gleason 6 (*

P

= 3,24 × 10-3), 7 (*

P

= 4.45 × 10-6) e 8 (*

P

= 1,63 × 10-3) tecidos de câncer de próstata, em comparação com o epitélio benigna da próstata. As barras de erro representam os desvios padrão. F, barras pretas representam média intensidade de coloração BIRC6 no grau alta não tratada (escore de Gleason 8-10) tecidos de câncer de próstata (n = 60) e câncer de próstata resistente à castração (CRPC) tecidos que tinham desenvolvido a partir de Gleason score 8-10 cancros seguintes neo terapia hormonal -adjuvant (n = 10). barras cinzentas representam frequência de expressão BIRC6 (pontuação ≥1). tecidos de câncer de próstata resistente à castração mostrou uma média BIRC6 coloração de intensidade significativamente maior do que os tecidos de câncer de próstata não tratados alto grau (*

P

= 1,38 × 10-3). As barras de erro representam os desvios padrão.

Gleason score 6, 7 e 8 epitélios maligna mais frequentemente expressa BIRC6 (coloração pontuação intensidade ≥1) do epitélio benigna da próstata (Fig. 2E). Todos os tecidos malignos mostraram uma alta frequência de expressão BIRC6 acoplado a intensidade alta BIRC6, exceto para marcar Gleason 9-10 tecidos que mostraram uma alta frequência de expressão BIRC6 acoplado a uma intensidade média baixa. Tomados em conjunto, os dados sugerem que a progressão do câncer de próstata de benigno a escala de Gleason 8 cancros da próstata está associada a aumentos na expressão de proteínas BIRC6.

Elevated BIRC6 Níveis de proteína em clínica do cancro da próstata resistente à castração tecidos

As secções de tecido a partir de cancros da próstata dos pacientes (Gleason 8-10) que tinha progredido para a resistência à castração seguintes terapia hormonal neo-adjuvante (n = 10) foram coradas para a expressão e teve BIRC6 e comparação com as secções de cancros da próstata de alto grau (Gleason marcar 8-10), que não tinha sido submetido a terapia hormonal neo-adjuvante (n = 60). A média intensidade de coloração para BIRC6 foi significativamente maior nos cânceres de próstata resistente à castração que nos controlos não tratados (2,30 ± 0,67 e 1,35 ± SD 0,84 SD, respectivamente;

P

= 1,38 × 10

-3) (Fig . 2F). frequência BIRC6 expressão foi muito elevada em ambos os tipos de tecido. Os dados sugerem que o desenvolvimento de cancro da próstata resistente à castração está associada a aumentos na expressão de proteínas BIRC6.

Redução de BIRC6 expressão decresce a viabilidade celular do cancro da próstata e proliferação

Tem sido relatado que a redução de expressão BIRC6 induz a apoptose (por exemplo, em células de câncer de mama). Utilizou-se a linha celular LNCaP para estudar o efeito de reduzir a expressão BIRC6 sobre a viabilidade celular do cancro da próstata. A incubação de células LNCaP transfectadas com

BIRC6

-targeting siRNA-1 e -2 (pistas 3, 4, 7, 8, 11, 12) resultou em perda substancial de proteína BIRC6, em comparação com as células tratadas com lipofectamina única (pistas 2, 6, 10), lipofectamina + não segmentação de siRNA (pistas 5, 9, 13) ou sem tratamento (pista 1) (Fig. 3A). O efeito foi evidente após 30 h de transfeco e tornou-se mais proeminente em 54 e 78 h. Pode notar-se que as células transfectadas com lipofectamina apenas, ou com lipofectamina + não segmentação de siRNA, mostrou um pequeno aumento na expressão BIRC6, presumivelmente devido ao veículo. Todos os experimentos knockdown subsequentes foram conduzidos utilizando siRNA-2.

A, tratamento de culturas de células LNCaP com siRNAs segmentação BIRC6 leva à redução da expressão da proteína BIRC6. expressão BIRC6 proteína em células LNCaP não tratadas (pista 1; a 78 h) e em células LNCaP incubadas apenas com lipofectamina (pistas 2, 6, 10), de siRNA-1 segmentação BIRC6 (pistas 3, 7, 11), de siRNA-2 segmentação BIRC6 (pistas 4, 8, 12) ou não segmentação de siRNA (pistas 5, 9, 13) durante 30, 54 e 78 h após a transfecção. Os resultados são representativos de três experiências independentes. B, o tratamento de culturas de células de LNCaP com siRNA alvejando-2 BIRC6 leva à proliferação celular reduzida, como mostrado pelo ensaio de MTT. As culturas foram tratadas durante 30 h com lipofectamina única ou com mais lipofectamina quer não segmentação de siRNA ou siRNA alvejando-2 BIRC6 e, em seguida, incubadas durante 24, 48 e 72 horas em meio fresco. Os números de células relativas nas siRNA-2 culturas foram consideravelmente inferiores aos das culturas não-alvo siRNA tratadas por 2,85%, 10,78% e 25,88% de 54, 78 e 102 h, respectivamente. As barras de erro representam os desvios padrão.

A seguir à transfecção, o siRNA-2 culturas transfectadas mostrou uma redução acentuada da viabilidade celular em relação aos não-alvo culturas tratadas com ARNsi (Fig. 3B). Assim, a viabilidade celular de culturas de siRNA-2 foi consideravelmente inferior do que a do não-segmentação culturas tratadas com ARNsi de 2,85%, 10,78% e 25,88% às 54, 78 e 102 h, respectivamente. Houve uma tendência para as células tratadas com siRNA-2-estruturas para formar sincícios tipo em que os conjuntos de células foram unidas por projecções longas fusiformes. Resultados são representativos de dois experimentos independentes. O efeito de silenciamento BIRC6 na progressão do ciclo celular foi também examinada. O knockdown de BIRC6 em células LNCaP não resultou em alteração significativa no ciclo celular (Fig. S1).

O efeito de redução BIRC6 também foi estudada em células PC-3 de cancro da próstata. Semelhante a células LNCaP, siRNA-2 transfectadas células PC-3 revelou uma diminuição significativa da viabilidade celular em comparação com as células não tratadas segmentação-siRNA 72 h após a transfecção (fig. S2).

Redução de BIRC6 Expressão induz apoptose e inibe a formação Autophagosome

redução BIRC6 induz a apoptose em células LNCaP como demonstrado por coloração com Anexina-V e immmunoblotting. Como mostrado na Fig. 4A, houve um aumento significativo em células positivas para a Anexina-V em células de siRNA-2 transfectadas (12,19% ± 1,9%) em comparação com não-alvo ARNsi (3,65% ± 0,60%, p = 0,0104) e Lipofectamine células tratadas (3,55% ± 0,0447%, p = 0,0123). Consistente com os resultados do ensaio de Anexina-V, BIRC6 células knock-down mostrou alterações marcantes na expressão de marcadores de apoptose (Figura 4B). Um aumento da caspase-3 clivada, PARP perda de comprimento completo e um aumento em um PARP clivada foram observadas em comparação com as células LNCaP transfectadas com ARNsi não segmentação (pista 3, 4). Curiosamente, foi observada uma diminuição de comprimento total de PARP a seguir à transfecção de células LNCaP com lipofectamina ou não segmentação (controlo) siRNA (pistas 2, 4), que pode ter sido causado por degradação não-específico de PARP comprimento total particularmente em células LNCaP. A perda de PARP comprimento completo nestes controlos não foi associado com um aumento correspondente na PARP clivada e não foi acoplado a um aumento significativo da caspase-3 clivada, indicando que estes controlos não resultou na indução de apoptose.

a, a apoptose de células LNCaP transfectadas com Lipofectamina (Lipo), controlo não segmentação de siRNA (NT) ou

BIRC6

siRNA2 e subsequentemente incubadas durante 48 h, tal como avaliado por análise de citometria de fluxo de anexina V /PI coradas células. Com base nos valores Q2 Q3 + (populações de células apoptóticas),

BIRC6

siARN marcadamente aumentou a apoptose de células de LNCaP em comparação com Lipo (p = 0,0104) ou NT siRNA células tratadas (p = 0,0123). (Os dados são representativos de 3 expericias independentes); B, o tratamento de células LNCaP com ARNsi-2 segmentação BIRC6 leva a activação de caspase-3 (tal como mostrado pela aparência de caspase-3 clivada) e degradação do seu substrato, de PARP (como demonstrado por perda de PARP de comprimento completo e a aparência de um produto de PARP clivada). células LNCaP tratadas (pista 1); As células LNCaP foram incubadas com apenas lipofectamina (pista 2), siRNA alvejando-2 BIRC6 (pista 3) ou não segmentação de siRNA (pista 4) durante 96 h após a transfecção. C, o tratamento de células LNCaP com siRNA-2 BIRC6 segmentação leva à diminuição da beclin-1 expressão e redução da LC3B-II. células LNCaP tratadas (pista 1); As células LNCaP foram incubadas com apenas lipofectamina (pista 2), siRNA alvejando-2 BIRC6 (pista 3) ou não segmentação de siRNA (pista 4) para 113 h após a transfecção. D, formação autophagosome em células BIRC6-silenciados foi significativamente menor em comparação com as células tratadas com o controle não-alvo siRNA. As células transfectadas com os não-alvo de controle siRNA (esquerda) mostrou mais puncta LC3-GFP do que as células transfectadas com siRNA-2 visando BIRC6 (à direita), que mostrou difundida expressão de LC3-GFP. E, Redução células LNCaP que expressam BIRC6 mostra significativamente menos células autofágicos (33,6%) em comparação com células de controlo (51%). células autofágica foram quantificados por contagem de células com mais de 15 LC3-GFP puncta sob um microscópio confocal.

A transfecção de células LNCaP com siRNA-2 (pista 3) levou a mudanças marcantes na expressão autofagia marcador ( A Fig. 4C). Uma diminuição na proteína LC3B-II (forma lipidada da LC3-I) foi observada com nenhum efeito nos níveis de proteína LC3B-I, bem como uma diminuição no 1 beclin-expressão da proteína (em comparação com os controlos; pistas 1, 2, 4) . Além disso, a formação autophagosome em células silenciou-BIRC6 foi significativamente menor em comparação com as células tratadas com o controle não-alvo siRNA (

P

= 0,036) como revelado pelo acúmulo LC3 puncta fluorescente no citoplasma (Fig. 4D, E) . Tomados em conjunto, os resultados mostram que a redução da expressão da proteína em BIRC6 tratadas com ARNsi de LNCaP-2 células resulta em um aumento da apoptose e uma diminuição na formação autophagosome. Os resultados são representativos de três experiências independentes.

A apoptose induzida por doxorrubicina em células LNCaP está associada a uma redução na BIRC6 Protein Expression

doxorrubicina, um medicamento utilizado para a terapia do cancro da próstata [32], tem sido relatada a desencadear a apoptose, juntamente com uma acumulação significativa de p53 [33]. Para investigar o efeito de apoptose induzida por doxorrubicina em BIRC6 expressão em células de cancro da próstata, células LNCaP foram incubadas durante 24 h com ou sem doxorrubicina (1 ug /ml). Tal como mostrado por análise de transferência de Western, o tratamento com doxorrubicina resultou na redução substancial da expressão BIRC6 (Fig. 5A). Além disso, houve uma redução na expressão da proteína de comprimento completo da PARP e um aumento em um PARP clivada indicativo de apoptose. Além disso, houve uma redução da densidade de célula com evidência de deterioração celular (Fig. 5B). O tratamento de células LNCaP com doxorrubicina mostraram uma redução da dose e dependente do tempo da expressão BIRC6 (Fig. S3). Para compreender se a redução BIRC6 era uma causa ou resultado da doxorrubicina induzida por apoptose, expressão temporal de BIRC6 e PARP após tratamento com doxorrubicina foi estudada.