Abstract
fator de crescimento semelhante à insulina 1 receptor (IGF1R) é um receptor transmembranar que é ativado pelo insulin-like factor de crescimento 1 (IGF-1) e por uma hormona relacionada chamada IGF-2. Pertence à classe grande de receptores tirosina-quinase e desempenha um papel importante na etiologia do cancro colo-rectal e de progressão. Neste estudo, foram utilizados análises de bioinformática para procurar miRNAs que potencialmente alvo IGF1R. Foram identificados locais alvo específicos para miR-143 e miR-145 (miR-143/145) na região 3 ‘não traduzida (3′-UTR) do gene do IGF1R. Estes miARNs são membros de um conjunto de miARNs que foram relatados como exibindo actividade supressora de tumor. Consistente com as análises de bioinformática, identificamos uma correlação inversa entre o miR-143/145 níveis e níveis de proteína IGF1R em tecidos de cancro colorrectal. Por superexpressão de miR-143/145 em Caco2, HT29 e células de câncer colorretal SW480, nós validada experimentalmente que o miR-143/145 reconhece diretamente o 3’-UTR do transcrito IGF1R e regula a expressão do IGF1R. Além disso, as consequências biológicas da segmentação de IGF1R por miR-143/145 foram examinadas por ensaios de proliferação celular
em
vitro
. Foi demonstrado que a repressão do IGF1R por miR-143/145 suprimiu a proliferação de células Caco2. Tomados em conjunto, os nossos resultados fornecem evidência para um papel do aglomerado de miR-143/145 como um supressor tumoral no cancro colo-rectal, através da inibição da tradução do IGF1R
citação:. J Su, Liang H, W Yao, Wang N, Zhang S, X Yan, et ai. (2014) miR-143 e miR-145 Regular IGF1R para suprimir a proliferação celular no cancro colorectal. PLoS ONE 9 (12): e114420. doi: 10.1371 /journal.pone.0114420
editor: Cecilia Williams, da Universidade de Houston, Estados Unidos da América
Recebido: 19 de maio de 2014; Aceito: 10 de novembro de 2014; Publicação: 04 de dezembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Su et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (973 Programa) (No. 2014CB542300), a National Science Foundation Natural da China (nºs 81101330, 31271378 e 81250044.) e da Fundação de Ciência Natural da província de Jiangsu (Nos BK2011013 e BK2012014.)
Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal é o terceiro tipo de câncer mais comumente diagnosticado no mundo, e é mais prevalente nos países desenvolvidos [1]. Estima-se que a incidência média bruta de câncer colorretal no Sudeste Asiático para ambos os sexos foi de 6,95 /100.000 população em 2008 ea incidência aumenta com a idade [2]. Ao nível molecular, o cancro colo-rectal surge a partir de uma série de alterações genéticas e epigenética que inactivam genes supressores de tumores e activar oncogenes [3]. No entanto, os mecanismos básicos subjacentes iniciação e progressão do cancro colorectal são ainda desconhecidas.
receptor Insulin-like growth factor 1 (IGF1R), um receptor tirosina cinase do IGF-1 e IGF-2, é frequentemente sobre-expressos em tumores e tem sido bem documentada na cultura de células, os estudos em animais e seres humanos para desempenhar um papel na transformação maligna, a progressão, a protecção contra a apoptose, e metástase [4], [5]. A família de receptores de IGF consiste de três proteínas de transmembrana, e o gene de IGF1R está localizado no cromossoma 15q26, que codifica um único polipéptido de 1367 aminoácidos que é constitutivamente expressa na maioria das células [5]. IGF1R activação leva a auto-fosforilação em tirosinas 1131, 1135 e 1136 no domínio de cinase, seguido de fosforilação de tirosinas da justamembrana e serinas carboxi-terminal [6]. Isto é seguido por recrutamento de intermediários de acoplamento específicos, incluindo o receptor de insulina-substrato-1 (IRS-1), Shc e 14-3-3 proteínas [7], [8]. Estas moléculas de ligação do IGF1R para diversas vias de sinalização, permitindo a indução de crescimento, transformação, a diferenciação e a protecção contra a apoptose [9]. Após a ligação de IGF-1, IGF1R activa o /Akt cascata de PI3K, que promove G1 a progressão do ciclo celular e S eleva a proliferação de células [10], [11]. IGF1R é sobre-expressa durante a carcinogénese colorrectal, com a mais alta expressão observada nas células em proliferação na base das criptas do cólon [11], [12]. No entanto, o papel de IGF1R em cancro colorrectal permanece por esclarecer.
Ao longo da última década, uma nova classe de pequenas moléculas de RNA conhecido como microARNs (miARNs) tem emergido como importantes reguladores da iniciação e progressão de humano cancros, incluindo o cancro colorectal [13] – [15]. miARNs são pequenos (± 22 nucleótidos de comprimento), de cadeia simples, moléculas de RNA não codificante que regulam negativamente a expressão do gene através da ligação à região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) de moléculas de mRNA-alvo, o que resulta na degradação tanto do transcrito ou a inibição da tradução [16] – [18]. Muitos miRNAs trabalham em conjunto com um outro para a expressão da proteína afinar em um nível global. Assim, miARNs desempenhar um papel significativo na regulação de genes pós-transcricional. Importante, estudos recentes indicam que a desregulação dos miRNAs está associada a doenças malignas humanas e sugerem um papel causal de miRNAs na etiologia do câncer [19]. miARNs presumivelmente desempenhar um papel no cancro porque podem afectar a tradução e estabilidade de oncogenes segmentados ou supressores de tumor, o que acaba por influenciar a fisiologia celular [19], [20]. Por exemplo, o miR-143 e miR-145 (miR-143/145), que estão localizados em um aglomerado dentro da região cromossómica 5q32-33, são regulados negativamente em muitos tipos de cancros, incluindo o cancro colorrectal [21], [22] . miR-143 e miR-145 ter sido demonstrado que possuem actividade anti-tumorigénica, incluindo o envolvimento em vários processos relacionados com o cancro, tais como a proliferação, invasão e migração [23].
Embora desregulação do IGF1R e miARNs está associada com tumorigênese no cancro colorectal humano, pouco se sabe sobre miRNAs que atuam sobre IGF1R. Neste estudo, descobrimos que IGF1R foi diretamente regulada por miR-143 e miR-145 em células de câncer colorretal. Além disso, mostramos que miR-143/145 pode inibir a expressão de IGF1R para suprimir a proliferação de células de câncer colorretal.
Materiais e Métodos
tecido humano
tecidos câncer colorretal e emparelhados tecidos não cancerosos adjacentes foram obtidas de pacientes submetidos a procedimentos cirúrgicos na primeira Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Anhui (Hefei, China). Ambos os tumores e tecidos não cancerosos foram submetidos à análise histológica para confirmação diagnóstica. O tipo patológico de cada câncer foi identificado como adenocarcinoma. consentimento por escrito foi fornecido por todos os pacientes ou seus responsáveis, e Comité das Primeiro Hospital Filiado de Anhui Medical University de Ética aprovou todos os aspectos deste estudo. Os fragmentos de tecido foram imediatamente congeladas em azoto líquido no momento da cirurgia e armazenado a -80 ° C. As características clínicas dos pacientes estão listadas na Tabela S1in S1 Arquivo.
cultura celular
As linhas celulares de cancro colorrectal humanos Caco2, HT29 e SW480 foram comprados do Instituto Xangai de Biologia Celular, Chinês Academy of Sciences (Xangai, China). células Caco2 foram cultivadas em DMEM (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco) numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO
2; células HT29 e SW480 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco) numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO
2.
isolamento de ARN e RT-PCR quantitativo
o ARN total foi extraído a partir das células cultivadas e tecidos utilizando Trizol Reagent (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Ensaios para quantificar miARNs maduros foram realizados usando sondas TaqMan microRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, 1 jag de RNA total foi transcrito reverso-em ADNc utilizando transcriptase inversa de AMV (Takara, Dalian, China) e um iniciador de haste-laçada RT, e um décimo de ADNc foi utilizada por reacção de qPCR (Applied Biosystems). As condições de reacção foram as seguintes: 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min e 85 ° C durante 5 min. PCR em tempo real foi realizado utilizando um kit de PCR TaqMan e um Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Applied Biosystems). As reacções foram incubadas numa placa óptica de 96 poços a 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. Todas as reacções foram corridas em triplicado. Após as reações foram completo, o limite de ciclo (C
T) Os dados foram determinados usando configurações de limites fixos, ea média C
T foi determinada a partir PCRs em triplicado. Um método C
T comparativa foi utilizado para comparar cada uma das condições para as reacções de controlo. U6 snRNA foi usada como um controlo interno, e a quantidade relativa de miRNA normalizado para U6 foi calculada com a equação 2
-ΔΔCT, em que ΔΔC
T = (C
T miRNA-C
T U6)
-Alvo (C
T miRNA-C
T U6)
controle.
Para quantificar IGF1R e mRNA GAPDH, 1 pg de RNA total foi reverso transcrito em cDNA utilizando oligo d (T) 18 primers (Takara) e transcriptase inversa ThermoScript (Invitrogen). As condições de reacção foram as seguintes: 42 ° C durante 60 min e 70 ° C durante 10 min. PCR em tempo real foi realizada em seguida, com o produto de RT, SYBR corante verde (Invitrogen) e iniciadores específicos para o IGF1R e GAPDH. As sequências dos iniciadores eram as seguintes: IGF1R (sentido): 5′-GCCAAGCTAAACCGGCTAAA-3 ‘; IGF1R (anti-sentido): 5’-TATCCTGTTTTGGCCTGGACATA-3 ‘; GAPDH (sentido): 5’-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 ‘; e GAPDH (anti-sentido): 5’-CGCTCATTGCCGATAGTG-3 ‘. As reacções foram incubadas a 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 1 min. Após as reacções estarem completas, o C
valores T foram determinadas por fixação de um limiar fixo. A quantidade relativa de ARNm de IGF1R foi normalizado para GAPDH.
miARN superexpressão
miARN sobre-expressão foi alcançada através da transfecção de células com um miARN imitador, um duplex de ARN oligonucleótido sintético imitando o precursor de miARN. moléculas de ARN sintéticos, incluindo pré-miR-143, pré-miR-145 e um ARN controlo negativo mexidos (pré-miR-controlo), foram adquiridos da GenePharma (Xangai, China). Caco2, SW480 e células HT29 foram semeadas em placas de 6 cavidades e foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) no dia seguinte quando as células foram de aproximadamente 70% confluentes. Para as experiências sobre-expressão de miARN, 100 pmol de pré-miR-143, 100 pmol de pré-miR-145 ou 50 pmol de ambos pré-miR-143 e miR-pré-145 foram usadas. Às 6 horas após a transfecção, o meio para as células Caco2 foi mudado para DMEM suplementado com soro fetal bovino a 2%, e o meio para as células HT29 e SW480 foi mudado para meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino a 2%. As células foram colhidas às 24 h ou 48 h após a transfecção para o isolamento de ARN total ou proteína, respectivamente.
construção de plasmídeo e siRNA ensaio de interferência
Um plasmídeo de expressão de mamífero (pReceiver-M02 -IGF1R) especialmente concebido para expressar o quadro completo de leitura aberta (ORF) de IGF1R humano sem o miR-143/145 responsivo 3′-UTR foi comprado de GeneCopoeia (Germantown, MD, EUA). Um plasmídeo vazio serviram como um controlo negativo. O siARN (sentido: 5′-GCGGCUGGAAACUCUUCUATT-3 ‘; anti-sentido: 5′-UAGAAGAGUUUCCAGCCGCTT-3’) a segmentação do IGF1R humano foi desenhado e sintetizado por Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Um siARN mexidos (Invitrogen) foi incluído como um controlo negativo. A sobre-expressão de plasmídeo ou siRNA foram transfectados em células Caco2 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. ARN ou proteína total foi isolado de 24 h ou 48 h após a transfecção. Os níveis de ARNm do IGF1R e expressão de proteína foram analisados por RT-PCR quantitativo e Western blotting.
repórter luciferase ensaio
O todo 3’UTR do IGF1R humano foi amplificado por PCR utilizando ADN genómico humano como um modelo. Os produtos de PCR foram, em seguida, inserido no plasmídeo p-MIR-repórter (Ambion, Austin, TX, EUA). A inserção foi confirmada como sendo correcto por sequenciação do ADN. Para testar a especificidade de ligação, as sequências que interagem com a sequência de semente de miR-143 e miR-145 foram mutados (a partir de UUGGGAG para AACCCUC para o local de ligação de miR-143 e de UUGGGAG para AACCCUC para o local de ligação de miR-145), e o mutante do IGF1R 3′-UTR foi inserido num plasmídeo repórter de luciferase equivalente. Para os ensaios de repórter de luciferase, Caco2, células HT29 e SW480 foram semeadas em placas de 24 poços e co-transfectadas com 0,8 ug de pirilampo plasmídeo repórter de luciferase, 0,8 ug de β-galactosidase (β-gal) plasmídeo de expressão (Ambion), e igual montantes (20 pmol) de miR-143/145 mímica ou um ARN de controlo negativo misturados usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). O plasmídeo β-gal foi utilizado como controlo da eficiência de transfecção. As células foram colhidas 24 h após a transfecção e analisadas quanto à actividade da luciferase utilizando um kit de ensaio de luciferase (Promega, Madison, WI, EUA).
isolamento de proteínas e Western blotting
células ou tecidos foram lisadas em um tampão de lise RIPA (Tris-HCl a 50, 150 mM de NaCl, 0,1% de SDS, 1% de NP-40, 0,25% de desoxicolato de sódio e 1 mM de EDTA, pH 8,0) com o cocktail de fresco adicionado inibidor de protease (Roche) durante 30 min sobre gelo e foram, então, centrifugadas a 16.000 x g a 4 ° C durante 10 min. O sobrenadante foi recolhido e a concentração de proteína foi calculada com um kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA). As proteínas foram separadas por SDS-PAGE (Bio-Rad). Após a electroforese, as proteínas foram electrotransferidas para membranas de PVDF (Bio-Rad) e depois bloqueadas com leite desnatado a 5% durante 1 h. As membranas foram, então, incubadas com anticorpos primários, a 4 ° C durante 12 h. Após três lavagens em TBST, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano durante 1 h à temperatura ambiente. Após três lavagens, as membranas foram incubadas com o substrato de quimioluminescência SuperSignal West Pico (Pierce). O mesmo também membrana foi sondada com um anticorpo GAPDH para servir como um controlo de carga. anticorpos IGF1R e GAPDH foram adquiridos a partir de Cell Signaling (# 3018) e Santa Cruz Biotechnology (SC-25778), respectivamente.
proliferação celular ensaio
células Caco2 foram plaqueadas a 5 x 10
4 culas por po em placas de 96 poços e em seguida incubadas durante a noite em DMEM suplementado com FBS a 10%. As células foram colhidas às 12, 24, 48 e 72 h pós-transfecção. Após a transfecção, 10 uL de contagem celular Kit-8 (# C0038, Beyotime) foi adicionada dentro do poço de ensaio correspondente e incubou-se durante 1 h. A absorvância foi medida a um comprimento de onda de 450 nm.
EdU proliferação ensaio
Para avaliar a proliferação celular, as células Caco2 foram semeadas em placas de 24 poços. As células foram incubadas sob condições padrão em meio completo. A transfecção das células foi realizada no dia seguinte, conforme descrito acima. Quarenta e oito horas após a transfecção, a proliferação celular foi detectada utilizando a incorporação de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) com o Ensaio de Proliferação celular EdU Kit (Ribobio, Cantão, China). Resumidamente, as células foram incubadas com 50 uM EdU durante 3 h antes da fixação, a permeabilização e coloração edu, que foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante. Os núcleos das células foram coradas com DAPI (Sigma) a uma concentração de 1 ug /ml durante 10 min. A proporção de células que incorporaram EdU foi determinada por microscopia de fluorescência.
A análise estatística
Todas as imagens blotting e Ensaio de proliferação ocidentais são representativos de pelo menos três experiências independentes. Os ensaios de RT-PCR e repórter de luciferase quantitativas foram realizadas em triplicado e cada experiência particular foi repetido várias vezes. Os resultados são apresentados como a média ± SE de pelo menos três experiências independentes. diferenças observadas foram consideradas estatisticamente significativas a p . 0,05 usando o teste t de Student
Resultados
Identificação conservada miR-145 locais-alvo dentro da 3’UTR do IGF1R
três algoritmos computacionais, incluindo TargetScan [24] e RNAhydrid [25], foram utilizados em combinação para identificar potenciais miARNs que têm como alvo o IGF1R. Todos os três algoritmos previram miR-143 e miR-145 como reguladores do IGF1R. As interacções entre preditos miR-143/145 e os locais-alvo no interior da 3’UTR do IGF1R são ilustrados na Figura 1A. foi observada uma hibridação entre ambos previu miR-143 e miR-145 e a 3’UTR do IGF1R. Embora os dois locais alvo dentro da 3’UTR do IGF1R estavam perto um do outro, os locais foram não-sobreposição. Houve complementaridade perfeita entre a região da semente (a sequência de núcleo que abrange os primeiros 2-8 bases da madura miRNA) e os alvos cognatos. Os valores de energia livre mínima das hibridações entre o miR-143 e miR IGF1R e entre 145 e IGF1R foram -19,8 e -24,8 kcal /mol, respectivamente, os quais estão bem dentro da gama de pares de miARN alvo genuínos. Além disso, as sequências de ligação de miR-143/145 na IGF1R 3′-UTR foram altamente conservado entre as espécies. Assim, o miR-143 e miR-145 foram seleccionados como candidatos para verificação experimental adicional.
(A) Representação esquemática dos duplexes hipotéticos formados pelas interacções entre os locais de ligação do IGF1R 3′-UTR (topo ) e miR-143/145 (inferior). O valor de energia livre previsto de cada híbrido é indicado. Os locais de reconhecimento de sementes são indicados, e em todos os nucleótidos estas regiões são altamente conservadas através de várias espécies, incluindo a humana, de ratinho e de rato. (B) Análise de RT-PCR quantitativo de miR-143 e miR-145 em níveis de seis pares de tecido colorectal câncer (C) e de tecido não canceroso amostras (P). (C e D) análise de transferência de Western dos níveis de proteína IGF1R em seis pares de amostras C e P. C: Imagem representativa; D: análise quantitativa. * P 0,05; ** P . 0,01
Identificação de uma correlação inversa entre miR-143/145 níveis e níveis de proteína IGF1R em tecidos de câncer colorretal
Interesse no cluster miR-143/145 IGF1R e também foi suportada pela recente identificação destes dois miARNs como supressores tumorais candidatos [26] e do IGF1R como um oncogene no cancro colo-rectal [8]. A seguir, investigou se miR-143/145 níveis foram inversamente correlacionada com a expressão da proteína IGF1R em tecidos de cancro colorrectal. Depois de determinar os níveis de miR-143/145 e os níveis de proteína de IGF1R em seis pares de tecidos de cancro colorectal e tecidos cancerosos correspondentes, que mostrou que o miR-143 e os níveis de miR-145 foram consistentemente regulados negativamente em tecidos de cancro colo-rectal (Figura 1B) , enquanto que os níveis de proteína IGF1R eram dramaticamente mais elevada nos tecidos de cancro colo-rectal (Figura 1C e 1D). Estes resultados indicaram que miR-143/145 níveis de expressão são inversamente correlacionada com a expressão da proteína IGF1R em tecidos de câncer colorretal humanos.
Validação de IGF1R como um alvo direto de miR-143/145
A correlação entre o miR-143/145 e IGF1R foi adicionalmente examinada avaliando a expressão do IGF1R em linhas celulares de cancro colorrectal humano Caco2, SW480 HT29 e depois a sobre-expressão de miR-143/145. Nestas experiências, a sobre-expressão foi conseguida por transfecção de Caco2, SW480 células HT29 e com pré-miR-143 e /ou pré-miR-145, que são oligonucleótidos de ARN sintéticos que mimetizam os precursores de miR-143 e miR-145. A sobre-expressão eficiente de miR-143/145 é mostrado na Figura 2A, 2F e 2K. Como antecipado, a sobre-expressão de miR-143 e /ou o miR-145 suprimiu significativamente os níveis de proteína do IGF1R em Caco2, SW480 e células HT29 (Figura 2B, 2C, 2G, 2H; e 2L, 2M). Para determinar o nível de controlo em que o miR-143/145 influenciada expressão do IGF1R, repetiu-se as experiências acima e examinaram a expressão de mARN do IGF1R após a transfecção. A sobre-expressão de miR-143/145 não afecta a estabilidade do IGF1R ARNm (Figura 2D, 2I e 2N). Estes resultados demonstraram que o miR-143/145 regula especificamente a expressão do IGF1R ao nível pós-transcricional, o qual é o mecanismo mais comum para miARNs animais.
(A, F e K) Análise de RT-PCR quantitativo de miR -143/145 níveis de Caco2, SW480 e células HT29 tratados com um controlo scrambled, pré-miR-143, pré-miR-145 ou ambos pré-miR-143 e miR-pré-145. (B, C; G e H; e L, M) Análise de mancha de Western dos níveis de proteína IGF1R em células Caco2 tratados com um controlo scrambled, pré-miR-143, pré-miR-145 ou ambos pré-miR-143 e pré -miR-145. B, G e L: imagem representativa; C, H e H: análise quantitativa. (D, I e N) Análise de RT-PCR quantitativa de níveis de ARNm de IGF1R em Caco2, SW480 e células HT29 tratados com um controlo scrambled, pré-miR-143, pré-miR-145 ou ambos pré-miR-143 e pré- miR-145. (E, J e O) reconhecimento directo do IGF1R 3′-UTR por miR-143/145. Caco2, SW480 e células HT29 foram co-transfectadas com os repórteres de luciferase de pirilampo contendo quer de tipo selvagem (WT) ou mutante (MUT) miR-143 sítios de ligação /145 do IGF1R 3′-UTR e um controlo scrambled, pré-miR- 143, pre-miR-145 ou ambos pré-miR-143 e pré-miR-145. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram analisadas utilizando um kit de ensaio de luciferase. Os resultados são apresentados como a razão entre a actividade da luciferase do pirilampo nas células de miR-143/145 transfectadas com a actividade nas células de controlo. * P 0,05; ** P . 0,01
Para determinar se os efeitos reguladores negativos de miR-143/145 na expressão do IGF1R eram mediados através da ligação de miR-143/145, para os locais alvo previstos na três ‘-UTR do ARNm do IGF1R, o comprimento total 3’UTR do IGF1R, contendo os dois previu miR-143 sítios de ligação /145 foi inserido a jusante do gene da luciferase de pirilampo num plasmídeo repórter. O plasmídeo resultante foi transfectado para Caco2, SW480 HT29 e células juntamente com um plasmídeo de controlo da transfecção (β-gal) e ou pré-miR-143/145 ou mexidos RNAs de controlo negativo. Como esperado, a actividade de luciferase foi marcadamente reduzida em células transfectadas com pré-miR-143 e /ou pré-miR-145 (Figura 2E, 2J e 2o). Além disso, introduzimos mutações pontuais nos locais complementares correspondentes no 3′-UTR do IGF1R para eliminar o miR-143/145 locais de ligação previstos. Este repórter de luciferase mutante não foi afectada por sobre-expressão de miR-143/145 (Figura 2E, 2J e 2o). Esse achado sugere que os locais de ligação de miRNA contribuiu fortemente para a miRNA: interação mRNA que mediou a repressão pós-transcricional da expressão IGF1R. Em conclusão, nossos resultados demonstraram que miR-143/145 reconhece direta e liga-se ao 3’-UTR do mRNA transcrito IGF1R para suprimir a expressão de IGF1R em células de cancro colorrectal.
miR-143 e miR-145 pode suprime a proliferação de células de câncer colorretal
a seguir focado em estudar os papéis de miR-143/145 em regulação IGF1R. Por causa do IGF1R é essencial para a regulação da proliferação e progressão do ciclo celular, foram avaliados os efeitos de miR-143/145 na proliferação de células do cancro colo-rectal, utilizando um ensaio de CCK-8. Em apoio à noção de que o miR-143/145 funcionam como miRNAs chave câncer suprimida [26], as células Caco2, HT29 e SW480 transfectadas com a proliferação de pré-miR-143/145 mostrou suprimido (Figura 3A, 3E e 3I). Além disso, avaliou-se o papel de IGF1R sobre a proliferação celular. Para derrubar IGF1R, um siRNA alvo IGF1R foi projetado e transfectado em Caco2, HT29 e células SW480. IGF1R para sobre-expressar, um plasmídeo que expressa o IGF1R ORF foi transfectado para Caco2, HT29 e células SW480. A sobre-expressão eficiente ou knockdown de IGF1R é mostrado na Figura S1 S1 Ficheiro. Consistente com estudos anteriores que mostraram que o IGF1R promove a proliferação de células [27], as células Caco2, HT29 e SW480 transfectadas com o plasmídeo do IGF1R superexpressão proliferaram a uma taxa significativamente mais elevada (Figura 3C, 3G e 3K), ao passo que o IGF1R knockdown com o siRNA proliferação significativamente suprimida (Figura 3B, 3F e 3J). Assim, o efeito anti-proliferativo de IGF1R knockdown foi semelhante para miR-143/145 superexpressão. Além disso, construiu-se um plasmídeo resistente a sobre-expressão do IGF1R o miR-143/145 (por eliminação do seu 3′-UTR). Em comparação com células transfectadas com pré-miR-143/145, as células transfectadas com o pré-miR-143/145 e o plasmídeo do IGF1R superexpressão exibiram taxas de proliferação significativamente mais elevados (Figura 3D, 3H e 3L), sugerindo que o miR-143/145 IGF1R -resistente resgatado a supressão do IGF1R por miR-143/145 e atenuou o efeito anti-proliferativo de miR-143/145.
(a, e e I) em ensaios de CCK-8 de viabilidade foram realizados 12, 24, 48 e 72 h após a transfecção de Caco2 (a), HT29 (e) e as células SW480 (I) com um controlo scrambled, pré-miR-143, pré-miR-145 ou ambos pré-miR-143 e pré -miR-145. (B, F e J) células de ensaios de viabilidade foram realizados 12, 24, 48 e 72 h após a transfecção de Caco2 (B), HT29 (F) e SW480 (j) 8-CCK, quer com um controlo scrambled siRNA ou um IGF1R siRNA. (C, G e K) células ensaios de viabilidade foram realizados 12, 24, 48 e 72 h após a transfecção de Caco2 (C), HT29 (G) e SW480 (k) 8-CCK ou com um vector de controlo ou uma sobre-expressão do IGF1R vetor. (D, H e L) ensaios de viabilidade foram realizados 12, 24, 48 e 72 h após a transfecção de Caco2 (D), HT29 (H) e SW480 (G) as células quer com um controlo scrambled, pré-miR 8-CCK -143/145 ou ambos pré-miR-143/145 e o vector de sobre-expressão do IGF1R. * P 0,05; ** P . 0,01
Para testar adicionalmente o efeito biológico do alvo-IGF1R miR-143/145 sobre o crescimento de células de cancro colo-rectal, o efeito de miR-143/145 e em células do IGF1R a proliferação foi analisada com um ensaio edu, um método de detecção imunoquímico que mede a incorporação de nucleótidos no ADN análogo recém replicado. Consistente com os resultados do ensaio de CCK-8, a percentagem de células EDU-positivas foi significativamente menor em células transfectadas com pré-miR-143/145 (Figura 4A e 4B). Da mesma forma, um número significativamente maior de células EDU-positivas foram observadas em células com sobre-expressão do IGF1R, enquanto IGF1R-siRNA células transfectadas mostraram o efeito contrário sobre a proliferação celular (Figura 4C e 4D). Estes resultados demonstraram novamente que a diminuição dos níveis IGF1R produziu o mesmo fenótipo observado por miR-143/145 superexpressão. Para examinar ainda mais a relação funcional entre miR-143/145 e IGF1R, as células Caco2 foram simultaneamente transfectadas com pré-miR-143/145 e o plasmídeo IGF1R superexpressão. Como esperado, a sobre-expressão de IGF1R, salvado dramaticamente o efeito supressor de miR-143/145 na proliferação de células (Figura 4E e 4F). Tomados em conjunto, os resultados demonstram que
As células fluorescentes vermelhas miR-143/145 de proliferação celular suprimir silenciando IGF1R. Quais são, na fase S da mitose, e as células fluorescentes azuis representam todas as células. (A e B) O ensaio de proliferação EdU foi realizada 48 horas após a transfecção de células Caco2 com um controlo scrambled, pré-miR-143, pré-miR-145 ou ambos pré-miR-143 e miR-pré-145. A: imagem representativa; B: proporção de células Caco2 EDU-positivos. (C e D) O ensaio de proliferação EdU foi realizada 48 horas após a transfecção de células Caco2 com um controlo scrambled siRNA, IGF1R siRNA, vector de controlo ou o vector de sobre-expressão do IGF1R. C: Imagem representativa; D: proporção de células Caco2 EDU-positivos. (E e F) O ensaio de proliferação EdU foi realizada 48 horas após a transfecção de células Caco2 com um controlo acrescido controlo do vector mexidos, um controlo scrambled mais IFG1R superexpressão vector, pré-miR-143/145, mais controlo do vector, ou pré-miR -143 /145 mais IFG1R vector superexpressão. E: imagem representativa; F: proporção de células Caco2 EDU-positivos. * P 0,05; ** P . 0,01
Discussão
Nas últimas décadas, grandes avanços na nossa compreensão da biologia do câncer colorretal levaram a técnicas de diagnóstico e prognóstico melhorados e ao desenvolvimento de novos terapias direcionadas. No entanto, a eficácia de novos tratamentos permanece limitada por uma combinação de resistência ao fármaco e pelo nosso limitado entendimento de vias de sinalização de células de tumor. Recentemente, um papel importante para IGF1R na gênese e progressão do cancro colorectal surgiu [28] – [30]. Assim, o IGF1R oferece um alvo molecular particularmente promissora para a terapia do cancro colo-rectal. No entanto, muito pouco se sabe sobre a regulação da expressão do IGF1R no cancro colorectal. Assim, os mecanismos moleculares subjacentes vias reguladoras IGF1R precisa de ser completamente elucidados.
Neste estudo, nós previmos IGF1R para ser um alvo de miR-143 e miR-145, que são um conjunto de miARNs que tenham sido relatado em muitos estudos para ser regulada negativamente e para funcionar como supressores tumorais na maioria dos cancros [21], [22]. Após a medição dos níveis de miR-143/145 e IGF1R expressão em tecido de cancro colo-rectal humano e emparelhado tecido não canceroso, que detectada uma correlação inversa entre o miR-143/145 níveis e os níveis de proteína IGF1R. Além disso, pela superexpressão de miR-143/145 em células Caco2, nós validada experimentalmente que o miR-143/145 diretamente inibiu a tradução IGF1R. Finalmente, mostramos que miR-143/145 expressão IGF1R inibida e, consequentemente, suprimiu a proliferação de células de câncer colorretal
em
vitro
. Os resultados delinear uma rede reguladora romance empregando miR-143/145 e IGF1R para afinar a proliferação celular. Nós também forneceram evidências de que a restauração de expressão IGF1R pode reverter a proliferação celular miR-143/145 suprimida. Curiosamente, foi previamente mostrado que o miR-145 pode ter como alvo substrato-1 do receptor da insulina (IRS-1) e do IGF1R em células de cancro do cólon [31] – [33]. No entanto, enquanto um IRS-1 resistente a miR-145 pode salvar as células do cancro do cólon de inibição do crescimento induzida por miR-145, um IGF1R resistente a miR-145 não conseguiu recuperar células de cancro do cólon de inibição de crescimento [33]. Isto não está de acordo com os nossos achados. Parece que se o miR-145 pode ter como alvo o IGF1R para regular o crescimento das células é dependente dos tipos de células tumorais e. Em circunstâncias diferentes, miR-145 pode exercer funções diferentes. No entanto, os resultados da nossa e outros destacar que o miR-143/145 pode actuar como miARNs tumor-supressor, e que a segmentação de IGF1R pode ser um mecanismo pelo qual o miR-143/145 aglomerado exerce a sua função supressora de tumores. Por isso, a modulação do IGF1R por miR-143/145 pode explicar porque a regulação negativa de miR-143/145 durante a carcinogénese colorrectal pode promover a progressão do cancro.
miARNs que estão localizados nas proximidades do genoma (dentro de 10 kb) são considerados como pertencendo a um único cluster. aglomerados de miARN são transcritos coordenadamente como unidades policistrónicos que são processados para produzir os membros individuais de miARN, o que resulta em co-expressão dos miARNs.