Sumário

Não-pequenas células-Lung Cancer (NSCLC) representa aproximadamente 85% de todos os cânceres de pulmão e permanece mal compreendido. Enquanto vias de sinalização operativas durante o desenvolvimento de órgãos, incluindo o Sonic Hedgehog (Shh) e os fatores de transcrição Gli associados (Gli1-3), foram recentemente encontrados para ser reativado em NSCLC, seu papel funcional permanece obscuro. Aqui, a hipótese de que Shh /Gli1-3 poderia mediar NSCLC proliferação autônoma e sinalização do epitélio /estroma no tecido tumoral. Neste contexto, têm investigado a actividade de sinalização de Shh /Gli1-3 em NSCLC em ambos, o cancro e as células do estroma. Relatamos aqui que a inibição da sinalização de Shh induz uma diminuição significativa na proliferação de células NSCLC. Este efeito é mediado por Gli1 e Gli2, mas não Gli3, através da regulação da ciclina D1 e expressão da ciclina D2. Enquanto exógena de Shh foi incapaz de induzir a sinalização em ambos os adenocarcinoma do pulmão A549 ou células de carcinoma escamoso do pulmão H520, ambas as células foram encontrados para secretar ligando Shh, que induziu a proliferação de fibroblastos, sobrevivência, migração, invasão, e a síntese de colagénio. Além disso, a Shh segregada por NSCLC medeia a produção de factores pró-angiogénico e metastáticos em fibroblastos de pulmão. Nossos resultados fornecem evidências de que, assim, Shh desempenha um papel importante na mediação epitelial /mesenquimais crosstalk em NSCLC. Embora a actividade Gli autónoma controla a proliferação de NSCLC, o aumento da expressão de Shh por NSCLC está associada com a activação de fibroblastos no estroma associado ao tumor. Nosso estudo destaca a importância de se estudar células-associado do estroma no contexto das NSCLC sobre novo prognóstico e opções terapêuticas

Citation:. Bermudez O, Hennen E, Koch I, Lindner M, Eickelberg O (2013) Gli1 medeia Câncer de pulmão proliferação celular e ativação de células mesenquimais do sonic Hedgehog-dependente. PLoS ONE 8 (5): e63226. doi: 10.1371 /journal.pone.0063226

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 09 de outubro de 2012; Aceito: 01 de abril de 2013; Publicado em: 07 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Bermudez et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Associação Helmholtz. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é o câncer mais mortal no mundo inteiro. Atualmente, não existem opções de tratamento eficaz para o câncer de pulmão e a taxa de sobrevida em 5 anos é de apenas 14% para os pacientes com tratamento [1] .A falta de terapia eficaz a longo prazo está relacionada com a complexidade do câncer de pulmão e, consequentemente, com a necessidade para uma melhor compreensão da biologia da carcinogénese do pulmão. Pouca atenção tem sido até agora dirigida para o microambiente circundante-tumor, que constitui o estroma associado a um tumor e actua como participante activo na tumorigénese. Nos últimos anos, a crescente evidência salientou a importância do estroma na iniciação do tumor, progressão e metabolismo de muitos tipos de câncer [2] – [7]. Do mesmo modo, a sinalização nas células do estroma foi demonstrado ser essencial para a transformação maligna de células epiteliais [2], [5], [6].

vias envolvidas na organogénese e pulmonar, incluindo a morfogénese ramificação Hedgehog ( hh) de sinalização, foram recentemente identificados como jogadores-chave em cancros humanos [8]. Existem três genes de Hedgehog (Hh) em mamíferos, com o Sonic hedgehog (Shh) como o gene mais amplamente expressos. Segregada Shh liga-se aos receptores de Patched (Ptch) presentes na membrana citoplasmática da célula receptora. A ligação de Shh para Ptch liberta a repressão que Ptch exerce sobre Smoothened, um receptor sete transmembranar do vão como proteína essencial para a transdução da sinalização de Hedgehog. Smoothened facilita a interacção de diferentes efectores a jusante do ouriço do cílios, resultando na activação de factores de transcrição Gli [9]. Nos seres humanos, os três Gli proteínas de dedos de zinco (Gli1, Gli2 e Gli3) orquestrar resposta específica de hedgehog na célula por modulação da expressão do gene. Os genes da via de Hedgehog si e incluindo Gli1 Ptch1 são alvos de Gli, representando um circuito de realimentação que servem como leitura da actividade de hedgehog [10]. A activação da via de Hh canónica humano depende da expressão dos receptores de Ptch (Ptch1, Ptch2) e o receptor de engodo Hhip (ouriço-interagindo proteína) [11]. proteínas intracelulares que regulam a estabilidade Gli, como Sufu (Supressor de fundida) e SPOP (de tipo proteína salpico POZ) desempenham também um papel importante na determinação da actividade de Gli e, assim, a activação da via de Hedgehog canónica [12]. Nos últimos anos, estudos puseram em evidência a existência de uma via de Hedgehog não canónicas que não requer o eixo completa Shh-Ptch-SMO-Gli. Um Hedgehog não canónicas sinalização dependente de SMO mas independente de Gli, que regulam a apoptose e tubulogenesis, foi descrita em células endoteliais [13] .Com tempo, factores de transcrição Gli aparecer como uma plataforma integrativa de numerosas entradas de sinalização, que estabelece um segundo tipo de sinalização de Hedgehog não-canônico, dependentes de Gli mas independente do SMO. Este é o caso de adenocarcinoma ductal do pâncreas, onde Gli transcrição é regulada por TGF-ß e K-ras [14].

A via de sinalização Hedgehog desempenha um papel crítico durante o desenvolvimento dos vertebrados controlo do crescimento celular, sobrevivência, o destino e padrão do plano do corpo. Alterações na Shh percurso durante o desenvolvimento pulmonar afetam as interações /mesenquimais epiteliais e resultar em ramificação defeitos morfogênese, prejudicando a função pulmonar. Enquanto a sinalização Shh é essencial para o desenvolvimento dos pulmões, o papel que esta via de sinalização pode jogar nos pulmões adultos permaneceu incerto e só agora está começando a ser investigado. Estudos recentes têm destacado a importância da sinalização de Hedgehog na fibrose pulmonar idiopática, uma doença letal de etiologia desconhecida. Bolaños et ai relataram que os diferentes componentes da via hedgehog são sobre-expressos em pulmões FPI e fibroblastos FPI. Além disso, fibroblastos de pulmão IPF foram encontrados para responder a Shh e esta resposta correlacionada com a ativação de fibroblastos

em

vitro

[15]. Um estudo independente realizada por Cigna et al [16] mostraram que os fibroblastos humanos primários de pulmão normal e FPI expressar os principais componentes da via de sinalização Hedgehog, associadas com a proliferação celular e a expressão de marcadores miofibroblásticas em fibroblastos. Considerando que esses estudos trazem para a importância da sinalização de Hedgehog na fibrose pulmonar, o papel desta via em diferentes formas de câncer de pulmão permanece incerta. Os cancros do pulmão são classificados de acordo com o tipo histológico: Os dois tipos mais prevalecentes de cancro do pulmão são de células de carcinoma de pulmão não pequenas (NSCLC) e de pequena célula-carcinoma (SCLC). NSCLC e SCLC não só apresentam diferenças em tamanho e aparência das células cancerosas, mas também diferente prognóstico e manejo clínico. Devido à heterogeneidade de cada subtipo do cancro do pulmão, caracterização histológica e molecular adicional é necessário para seleccionar o tratamento mais específicos. Tradicionalmente, NSCLC foram examinadas e tratadas para EGFR e K-

ras

mutações. No entanto, o aparecimento de resistência a estes tratamentos e a descrição de novas assinaturas moleculares puseram em evidência a necessidade de uma terapia tumoral melhor molecular dirigida perfil. Alguns estudos têm descrito a associação entre a novos padrões de expressão gênica em subconjuntos específicos de NSCLC [17], [18], e outros sugerem a aplicação de perfis moleculares novo tumor em terapias futuras. Por exemplo, tem sido proposta a avaliação de MMP2 e de b-catenina expressão para ter um potencial no diagnóstico de NSCLC com características clinicopatológicas diferentes [19]. Em SCLC, um tumor neuroendócrino com características primitivas, a Shh foi encontrado para ser activado em células progenitoras em células neuroendócrinas e tumorais em ratinhos [20], [21]. Enquanto estes estudos suportam um juxtacrine activação /autócrina de Hh em CPPC, não é claro o modo como esta via é activado em NSCLC, o subtipo mais prevalente de cancro do pulmão. Dadas as diferenças entre clínicos e biológicos NSCLC e SCLC, a hipótese de que o mecanismo de activação de Shh em NSCLC é diferente de SCLC. Nós teve como objetivo investigar a actividade de Shh sinalização em NSCLC em ambas as células cancerosas e estromais. De modo a avaliar a importância de Shh de sinalização em células NSCLC, realizamos knockdown dos três factores de transcrição Gli (Gli1-3), que medeiam a sinalização intracelular Shh, e estudado o seu impacto na proliferação de NSCLC. Além disso, nós avaliamos como as células e fibroblastos de pulmão NSCLC respondeu a Shh exógena em termos de proliferação, migração celular, invasão e remodelação da matriz extracelular.

Resultados

ciclopamina, um ouriço Inhibitor, Reduz NSCLC proliferação e Viabilidade

Uma das características mais adversas de cânceres é a desregulamentação na proliferação celular. Temos, portanto, estudou o papel que Shh poderia ter na proliferação NSCLC, utilizando células de adenocarcinoma e células de carcinoma escamoso, o primeiro eo segundo tipo mais freqüente de câncer de pulmão, respectivamente. Inicialmente, utilizou-se ciclopamina, um alcalóide de esteróides de origem vegetal que inibe a Smoothened (SMO), um receptor acoplado a proteína G que transduz o sinal de Shh na célula, para bloquear o Shh via em células NSCLC. Quando tratados com ciclopamina, células A549 do adenocarcinoma e carcinoma de células escamosas de pulmão H520 mostraram uma diminuição significativa no número de células, especialmente em pontos de tempo mais longos (Figuras 1A e B). Ciclopamina também reduziu a sobrevivência celular (actividade metabólica avaliada por ensaio MTT) (Figuras 1A e B), e este efeito foi mais importante com o aumento das doses do inibidor (Figura S1A e Figura S3E). Para descartar que cyclopamine não provocou um efeito não específico citotóxico sobre células NSCLC, a apoptose foi determinada após tratamento cyclopamine. Embora ciclopamina induziu um ligeiro aumento na extensão de células apoptóticas, a percentagem de células apoptóticas não foi estatisticamente diferente entre as células tratadas e as células não tratadas (Figura S1B e Figura S3F). A fim de confirmar o efeito específico sobre a proliferação de ciclopamina NSCLC e viabilidade, foi realizada SMO silenciamento. SMO knockdown induziu uma diminuição tanto a proliferação de células A549 e H520 e viabilidade (dados não mostrados). No seu conjunto, estes resultados mostram que o bloqueio da via hedgehog através da inibição SMO, reduz a proliferação e viabilidade NSCLC.

Lung células de adenocarcinoma A549 (A) e células de carcinoma escamoso do pulmão H520 (B) foram cultivadas na presença ou ausência de 10 ciclopamina uM durante 5 dias. A proliferação foi avaliada por contagem de células e a sobrevivência celular por ensaio MTT. * P 0,1; ** P 0,05. (C) A transcrição do ouriço-responsive fatores Gli1, Gli2 ou Gli3 foram derrubadas com siRNA em células A549. RT-qPCR foi realizada para confirmar o silenciamento específico de cada Gli e para avaliar a expressão do receptor Ptch1 Hedgehog. Os resultados são apresentados como diferenças de níveis de ARNm de dobragem (2

∧∧Ct) em comparação com células transfectadas com um ARNsi de controlo negativo (CN siARN) que tem nenhuma homologia em transcriptoma vertebrado. ** P 0,05, *** p 0,01. O impacto de silenciamento Gli1, Gli2 Gli3 ou na proliferação de células A549 foi avaliada por contagem de células (D) e na sobrevivência de células pelo ensaio MTT (E). Os resultados são apresentados em percentagem de proliferação relativa e sobrevivência relativa em comparação com células transfectadas com o ARNsi de controlo negativo (CN). * P 0,1. (F) Um representante microscópicos de contraste de fase imagens após 72 horas de siRNA são apresentados. (L) RT-qPCR foi realizado para avaliar o efeito do siARN da Gli1, Gli2 e Gli3 na expressão do G1 /fase S ciclinas D (Cyc D1, Cyc D2, Cyc D3) e ciclina E (Cyc E1). Os resultados estão apresentados como os níveis de mRNA de dobra (2

∧∧Ct) em comparação com células transfectadas com um ARNsi de controlo negativo (CN siARN) que tem nenhuma homologia em transcriptoma vertebrado. * P 0,1; ** P 0,05. (H) Western Blot de ciclina D2 em células A549 transfectadas com ARNsi Gli ou com um siRNA controlo negativo (CN). Blotting de ß-actina foi utilizada como controle de carga.

O silenciamento de Gli1 Diminui NSCLC Proliferação pela modulação da ciclina D Expressão

Embora ciclopamina foi encontrada para afetar a proliferação de células em outros tipos de células cancerígenas, o mecanismo específico pelo qual a sinalização Shh regula a proliferação câncer de células NSCLC permanece indefinida. Por exemplo, não é conhecido o modo como cada um dos 3 humano Shh-factores de transcrição Gli contribui para a proliferação NSCLC. A fim de resolver esta questão, usamos pequenos RNAs de interferência (siRNA) para silenciar Gli1, Gli2 e Gli3. Após uma redução específica e importante nos níveis de ARNm de Gli1 que não afectou os níveis de mRNA Gli3 (Figura 1C) ou Gli2, a proliferação celular e a viabilidade celular foi diminuída em células A549 do adenocarcinoma (Figura 1D-F). De pré-aviso, o silenciamento de Gli1 provocou uma redução nos níveis de mRNA Ptch1 (Figura 1C). Uma vez que a transcrição de Ptch1 depende Gli1, a redução dos níveis de mRNA Ptch1 serve como um controlo adicional, indicando que o silenciamento de Gli1 era biologicamente eficaz. O silenciamento de Gli2 específica, que reduziu os níveis de mRNA Gli2 e não diminuir, quer os níveis de mRNA Gli3 (Figura 1C) ou Gli1, diminuiu o número de células A549 e ligeiramente a viabilidade das células, embora não de forma estatisticamente significativa (Figura 1D e E). Finalmente, o siARN da Gli3 que provocaram uma diminuição importante dos níveis de ARNm Gli3 mas não uma diminuição nos níveis de ARNm Gli2 (Figura 1C) Gli1 ou, não reduzir a proliferação de células de adenocarcinoma A549 ou a viabilidade das células (Figura 1D e E) e, em vez causado um ligeiro aumento no número de células de adenocarcinoma de células A549 (Figura 1D), juntamente com um aumento nos níveis de ARNm Gli1 (Figura 1C). Em H520 escamosas do pulmão de células de carcinoma (Figura S3) e em células de carcinoma de grandes células (dados não apresentados), o silenciamento específico de Gli1, Gli2 ou Gli3 teve um efeito semelhante na proliferação celular e a expressão da ciclina. Importante, a expressão de genes relacionados com a Shh e ciclinas sobre Gli1, Gli2 e Gli3 silenciamento não foi devido a Hprt1 expressão porque um padrão de expressão semelhante foi encontrado quando 3 genes de referência independentes foram utilizados em A549 (Figura S2) e em células H520 ( Figura S4).

a fim de explorar o modo como o silenciamento de Shh proliferação adenocarcinoma impactos da via pulmonar, nós avaliamos as mudanças na expressão das ciclinas D e e envolvidas no G1 /transição do ciclo celular S, mediante Gli infra-regulação. De interesse, o siRNA de Gli1 e Gli2 provocou uma diminuição importante na ciclina D2 e ​​uma ligeira redução nos níveis de ciclina D1 mRNA (Figura 1G). O decréscimo na expressão da ciclina D2 sobre Gli1 e Gli2 knockdown foi observada no ARNm, mas também ao nível da proteína (Figura 1H). Considerando que Gli2 poderia afectar a expressão de ciclina D, a hipótese de que, em combinação com Gli1, este factor de transcrição pode regular a proliferação celular de um modo significativo. Para confirmar esta hipótese, nós percebemos o duplo silenciamento de fatores de transcrição Gli. Enquanto o single silenciamento de Gli2 não diminuiu significativamente a viabilidade celular, o duplo silenciamento de Gli1 e Gli2 fez (Figura S1C). Em células de carcinoma escamoso do pulmão H520, o knockdown específica de Gli1 Gli2 e por siARN foi encontrada para diminuir em uma expressão de ciclina D1 forma e ciclina D2 semelhante (Figura S3A). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o bloqueio da via de sinalização Shh, seja com cyclopamine ou interferir com o fator de transcrição Gli1 diminui a proliferação das NSCLC.

Células NSCLC não ativar Shh Caminho Ao exógena Shh Tratamento

uma vez que o bloqueio da via de Shh diminui a proliferação NSCLC, nós investigamos se exógena de Shh produz um acréscimo na proliferação celular nestas células. Células de adenocarcinoma do pulmão A549 e células de carcinoma epidermóide H520 tratadas com Shh humana recombinante não mostraram uma alteração quer no número de células (Figuras 2A e D) ou na sobrevivência das células (Figuras 2B e E). Além disso, as células não apresentaram qualquer alteração morfológica após tratamento (Figuras 2C e F). Estes resultados sugerem que as células NSCLC não respondem a Shh. A fim de validar o tratamento de Shh, utilizou-se células primárias de embrião de ratinho a partir dos brotos dos membros, o tecido que tem sido mostrado para ser responsivo a Shh. No momento do tratamento de Shh, estas células apresentaram um aumento considerável nos níveis de ARNm e GLI1 Ptch1 (aumento de 60 vezes e 9 vezes, respectivamente, em comparação com células não-tratadas; Figura S5). Quando as células A549 foram tratadas com Shh, um aumento muito modesto (1,65 vezes) nos níveis de ARNm Gli1 em 8 horas e os níveis de proteína de GLI1 às 24 horas foi detectado. No entanto, em pontos de tempo mais longos foram ali houve mudanças significativas em qualquer Gli1 ou expressão Ptch1 (Figuras 3A e B). Para H520 células, qualquer mudança significativa em qualquer Gli1 ou Ptch1 no mRNA e nível de proteína foi observada (Figuras 3C e D). Estes resultados indicam que,

in vitro

, ambos os tipos de células NSCLC, em comparação com células Shh-responsive conhecidos, não nomeadamente responder a Shh exógena.

Lung células adenocarcinoma A549 (A-C ) e pulmão H520 de carcinoma escamoso de células (D-F) foram tratados ou não com Shh recombinante (500 ng /ml). A proliferação celular foi avaliada por contagem de células (A, D) e a sobrevivência de células pelo ensaio MTT (B, E) nos tempos indicados. Representante de contraste de fase imagens microscópicas de células A549 (C) e de células H520 (F) são mostrados.

células NSCLC foram tratadas ou não com Shh recombinante (500 ng /ml) nos tempos indicados . RT-qPCR foi realizado para avaliar os níveis de ARNm e GLI1 Ptch1 após tratamento em células A549 (A) e células H520 (C). Os resultados são apresentados como diferenças de níveis de ARNm de dobragem (2

∧∧Ct) em comparação com células não tratadas para cada ponto de tempo. Western blot foi realizada para avaliar os níveis de proteína GLI1 e Ptch1 em células A549 (B) e em H520 células (D) tratados ou não com Shh. ß-actina foi utilizado como um controlo de carga. A secreção de Shh humano foi avaliada nos sobrenadantes de células A549 e H520 por ELISA (E) e confirmada por Western Blot utilizando um anticorpo que reconhece a forma activa secretada de Shh (inset E). O Western blot foi realizado com H520 sobrenadante (sup H520.) E com Shh recombinante (Rec. Shh) usado como um controlo positivo. (F) o knockdown do gene Shh por siARN foi realizada em células H520. Shh secreção foi avaliada por ELISA e expressa em percentagem, como a secreção relativa em comparação com células transfectadas com um ARNsi de controlo negativo (CN) sem ter homologia em transcriptoma vertebrado. ** P 0,05 (G) Depois de silenciamento de Shh, as células NSCLC foram tratadas ou não com Shh recombinante (500 ng /ml). RT-qPCR foi realizado para avaliar os níveis de Gli e mRNA Ptch1. Os resultados são apresentados como vezes de diferenças de mRNA (2

∧∧Ct) em células tratadas em comparação com células não tratadas.

Células NSCLC Secrete Shh Ligand

Usando um específico teste de ELISA para Shh humana, descobrimos que as células A549 adenocarcinoma e mais fortemente H520 carcinoma espinocelular produtos Shh (170 e 2800 pg /ml, respectivamente, Figura 3E). Esta secreção pode ser associada com a produção endógena de Shh por estas células NSCLC, porque a concentração de Shh no meio de cada tipo de célula foi muito baixo, comparável ao do fundo (água).

De modo a confirmar estes resultados e para investigar se estas células NSCLC também produzem as outras formas de ligante Hedgehog, nós avaliamos a expressão do sonic, Desert (Dhh) e de Indian Hedgehog (Ihh) em células A549 e H520. Embora não foi possível detectar por meio de RT-qPCR Dhh e Ihh, descobrimos que Sonic Hedgehog foi expressa em células A549 e H520, sendo mais expressa nestes últimos (dados não mostrados). Com base nestes resultados, temos, portanto, concentrou-se em Shh em todo o nosso estudo. Além disso, porque as células H520 produzir e secretar uma quantidade considerável de ligante Shh, decidimos focar essas células NSCLC para estudos relacionados com a secreção Shh. Para avaliar de forma mais precisa a presença da forma activa de Shh em H520 sobrenadante, por Western blot foi realizada com um anticorpo que reconhece a forma activa processado de Shh (N-Shh). A presença do N-terminal peptídeo secretado Shh no sobrenadante de células H520 foi, assim, confirmadas (inserção Figura 3E).

Como as células H520 secretar uma quantidade considerável de Shh, mas não respondem a Shh exógena, objetivamos para investigar se esta ausência de resposta esteve associada à saturação da actividade de hedgehog endógeno nestas células. Para isso, temos realizado o silenciamento do gene Shh no H520 células. Após o knockdown de Shh, que reduziu em 70% a secreção de Shh em células H520 (Figura 3F), Shh exógeno aumentou os níveis de mRNA Gli1 nestas células (Figura 3G). Este aumento, assim como um ligeiro aumento nos níveis de ARNm Ptch1 (Figura 3G) indicam que as células H520 pode responder a Shh quando os níveis endógenos de Shh estão diminuídos.

Lung Fibroblastos firmemente respondem a Shh exógena

Uma vez que as células NSCLC pode secretar ligando Shh, mas eles não respondem fortemente para Shh exógena, investigamos se Shh poderia sim ativar as células do estroma adjacentes. De facto, fibroblastos de pulmão de rato tratadas com Shh exibiu uma forte activação da via hedgehog mediante tratamento: os níveis de mRNA Gli1 aumentada até 800 vezes e os níveis de ARNm Ptch1 teve um aumento para o dobro até 250, especialmente às 48 e 72 horas (Figura 4A). Resultados semelhantes foram obtidos com Shh humano (Figura 4A). tratamento de Shh também aumentou Gli1 Ptch1 e ao nível da proteína (Figura 4B). A fim de saber se pulmonares fibroblastos humanos a partir do ambiente NSCLC também poderia responder a Shh exógenos, fibroblastos de pulmão humanos primários foram isolados a partir de um carcinoma escamoso do pulmão ressecado. Curiosamente, níveis de ARNm e GLI1 Ptch1 foram também aumentadas por tratamento Shh nestas células (Figura 4C). Estes resultados indicam que,

in vitro

, fibroblastos de pulmão são células altamente Shh-responsivos, em contraste com as células epiteliais NSCLC.

fibroblastos de pulmão do rato CCL206 foram tratados ou não com 500 ng /ml de recombinante de ratinho Shh ou 500 ng /mL de Shh humano durante 24, 48 e 72 horas. os níveis de (A) de ARNm de Gli1, Gli2, e Gli3 Ptch1 após tratamento foram avaliados por meio de RT-qPCR. Os resultados são apresentados como vezes de diferenças em níveis de mRNA (2

∧∧Ct) de células tratadas em comparação com as células não tratadas para cada ponto de tempo. * P 0,1; *** P 0,01. (B) Western blot foi realizada para avaliar as mudanças nos níveis de proteína GLI1 e Ptch1 em fibroblastos CCL206 tratados ou não com o mouse Shh (500 ng /ml). ß-actina foi utilizado como um controlo de carga. (C) fibroblastos humanos primários foram tratados ou não com Shh humana recombinante (500 ng /ml) durante 24, 48 e 72 horas. RT-qPCR foi realizado para avaliar os níveis de mRNA de Gli1, Gli2, e Gli3 Ptch1. Os resultados são apresentados como vezes de diferenças de mRNA (2

∧∧Ct) em células tratadas, em comparação com células não tratadas para cada ponto de tempo. * P 0,1; ** P 0,05; *** P . 0,01

A fim de investigar se a falta de resposta a Shh exógena em células NSCLC foi devido a uma recepção deficiente de ligando Shh nestas células, nós avaliamos a expressão dos receptores Ptch1, Ptch2 e de Hhip, considerados como um receptor chamariz, em A549, H520 células e CLL206 fibroblastos. Ptch1 expressão foi encontrada para ser mais elevada do que Hhip em ambos os tipos de células NSCLC (Figura S6). Além disso, a expressão relativa da Ptch1 foi maior em A549 e em células H520 do que nos fibroblastos CCL206 enquanto a expressão relativa do receptor chamariz Hhip era mais importante do que os fibroblastos de pulmão nas células NSCLC (Figura S6). Assim, o equilíbrio entre Ptch e expressão Hhip não parecem estar relacionados (ao nível do ARNm) com a incapacidade de resposta a Shh do NSCLC exógeno. Como proteínas intracelulares, tais como Sufu e POCA regular de forma positiva e em uma estabilidade de forma Gli negativo, respectivamente, temos então avaliado se um desequilíbrio entre estes reguladores Gli poderia explicar a não-responsivos do NSCLC para Shh exógena. Nós não encontrou diferenças na expressão relativa de Sufu em comparação com a expressão de POCA para um mesmo tipo de célula (Figura S6). Finalmente, nós avaliamos se a expressão relativa de receptores hh e reguladores Gli foram diferentes entre NSCLC e pulmão fibroblastos após tratamento Shh. Não foram encontradas diferenças na expressão de Ptch1, Ptch2, Hhip, Sufu SPOP e depois do tratamento de Shh, a curto (1, 3, 8 H) ou pontos de tempo mais longo (24, 48 h) (dados não mostrados).

pulmão fibroblastos Responder a Shh secretada por células NSCLC H520

para testar se Shh secretada por células escamosas H520 foi bioativo, fibroblastos de pulmão foram tratadas com H520 sobrenadante. Isto resultou no aumento dos níveis de ARNm Ptch1 GLI1 e em recém-nascido do rato (Figura 5A) e em fibroblastos de pulmão humano adulto (Figura 5B). A fim de avaliar se esta resposta foi mediada por Shh secretada por células H520 e presente no sobrenadante, ARNsi de Shh foi realizada em células H520. Esta importante diminuição da quantidade de ARNm de Shh e na presença de N-Shh no sobrenadante (Figura 5C) e, além disso, reduzida em 90% os níveis de Gli1 e por 50% dos níveis de Ptch1 nos fibroblastos tratados com H520 sobrenadante (Figura 5D) .

. fibroblastos de pulmão foram durante 24 horas e, em seguida, tratados ou não com o sobrenadante de células H520 durante 24, 48 ou 72 horas privadas de soro. (A) RT-qPCR foi realizado para analisar Gli1, Gli2, Gli3 e níveis de ARNm em Ptch1 CCL206 tratado com H520 sobrenadante. Os resultados são apresentados como vezes de níveis de ARN em células tratadas em comparação com as células não tratadas para cada ponto de tempo. ** P 0,05; *** P 0,01. (B) fibroblastos humanos primários de pulmão foram carcinoma escamoso durante 24 horas e tratou-se ou não com H520 sobrenadante para os tempos indicados privadas de soro. RT-qPCR foi realizado para avaliar os níveis de Gli1, Gli2, Gli3 e mRNA Ptch1. Os resultados estão apresentados como os níveis de mRNA de vezes em células tratadas em comparação com as células não tratadas para cada ponto de tempo. * P 0,1, ** p 0,05. (C) o knockdown de Shh foi realizada em células H520 com siARN. A eficiência de Shh knockdown em células H520 foi confirmada por Western blot realizada com o sobrenadante de células H520 transfectadas com ARNsi de controlo negativo (CN) ou com o siRNA de Shh. (D) CCL206 fibroblastos foram tratados durante 24, 48 e 72 horas com o sobrenadante de células quer H520 transfectadas com um ARNsi de controlo negativo ou com o sobrenadante de células H520 transfectadas com o ARNsi de Shh. RT-qPCR foi realizada para avaliar mudanças nos níveis de Gli1, Gli2, Gli3 e mRNA Ptch1. Os resultados estão apresentados como os níveis de mRNA de dobra (2

∧∧Ct) em células CCL206 tratadas com o sobrenadante de H520 transfectadas com o ARNsi de Shh em comparação com os fibroblastos tratados com o sobrenadante de H520 transfectadas com o ARNsi de controlo negativo. * P 0,1; ** P 0,05; *** P . 0,01

Shh Pathway Melhora Lung proliferação de fibroblastos, invasão e deposição de colágeno

Nós mostramos aqui que as células NSCLC não marcadamente responder a Shh exógena, mas podem secretar Shh bioactivo que induz a activação da sinalização de Hedgehog em fibroblastos de pulmão. Estes resultados revelam que Shh tem um papel importante na mediação de cancro epitelial-estromal diafonia em NSCLC. Nesta configuração, nós investigamos os possíveis efeitos biológicas da activação do Shh em fibroblastos de pulmão. Nós nos concentramos sobre os diferentes aspectos de relevância no contexto do câncer, como a proliferação, migração, invasão e remodelação da matriz extracelular. Enquanto Shh recombinante aumentou a sobrevivência de células e proliferação de células de fibroblastos de pulmão (Figuras 6A-C), a diminuição foi ciclopamina (Figuras 6D-F). Este efeito parece ser devido especificamente à inibição da via hedgehog como tratamento ciclopamina correlacionada com uma diminuição na expressão e Gli1 Ptch1 CCL206 em fibroblastos (Figura S7A). proliferação de células de fibroblastos de pulmão Curiosamente, H520 sobrenadante também aumentada (Figura S7B-D). Tal como os fibroblastos têm mostrado ser importante para facilitar a migração e invasão do cancro, nós fomos em investigar o impacto de Shh nestes processos. Os fibroblastos foram tratados com Shh ou com ciclopamina, e a sua migração foi gravada até 72 horas após o tratamento. Considerando que Shh aumento da distância de migração de fibroblastos, ciclopamina o diminuiu (Figura 7A) significativamente. A fim de explorar se Shh poderia influenciar a migração de fibroblastos após um estímulo lesão que pode representar melhor as mudanças que ocorrem no tecido tumoral, foram realizados ensaios de cura de feridas. Em células não-tratadas, fibroblastos migraram para dentro da área da ferida numa forma progressiva, resultando num encerramento da ferida ao fim de 30 horas. Em células tratadas com Shh, este processo mais rápido e foi levado para o fechamento da ferida após 26 horas (Figuras 7B e C). Pelo contrário, a migração dos fibroblastos ciclopamina diminuiu para a área da ferida e não resultou no fecho de feridas (Figuras 7B e C). Em seguida, procurou investigar se Shh poderia afetar a invasão de fibroblastos. Para isso, foi utilizado transwells revestidos com colagénio que imita melhor a matriz extracelular e, portanto, o contexto do tecido. As células foram carregados no topo da transwell e meio com Shh ou ciclopamina foi colocado na parte inferior, permitindo a formação de um gradiente. O número de células transmigrando aumentada na presença de Shh enquanto ciclopamina diminuiu invasão de fibroblastos através da membrana revestida de colagénio (Figura 7D). Enquanto sinalização Shh regula a migração de fibroblastos de pulmão e invasão, qualquer efeito foi encontrado tanto para Shh ciclopamina ou em ensaios de adesão de fibroblastos (dados não mostrados). Porque a desorganização e mudanças na arquitetura do microambiente do tumor são características importantes de câncer, nós investigamos se a ativação de Shh percurso em fibroblastos pulmonares poderia ser associado a remodelação da matriz extracelular. Shh exógeno aumentou a expressão da MMP9 metalopeptidase matriz (Figura 7E), uma enzima proteolitica que desempenha um papel fundamental na progressão do cancro. Curiosamente, o tratamento de Shh também aumentou a síntese de colagénio na matriz extracelular formada por fibroblastos (Figura 7F). No seu conjunto, estes resultados indicam que Shh eliciar uma resposta em fibroblastos de pulmão que podem ser correlacionados com a migração, invasão e remodelação da matriz extracelular.

proliferação de fibroblastos pulmonares CCL206 foi avaliada por contagem de células (A, D) e sobrevivência celular