Abstract

O cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Exploração dos mecanismos subjacentes à metástase do câncer de células estaminais-like (CSLCs) vai abrir novos caminhos no diagnóstico e tratamento do câncer de pulmão. Aqui, demonstramos que CSLCs-derivados de células de adenocarcinoma do pulmão (LAC) exibido capacidades altamente invasivas e migratórias através de expressar níveis elevados de POU5F1 e MMP-2. Descobrimos que POU5F1 regulada directamente da MMP-2 através de interacção com a transcrição do promotor de MMP-2. POU5F1 knockdown no LACSLCs reduzida MMP-2 abundância de proteínas, levando à inibição da invasão celular, migração e Tumorigênese potenciais de células da ALC. Clinicamente, aberrante altas expressões de POU5F1 e MMP-2 foram inversamente correlacionados com a sobrevida dos pacientes ALC, ea POU5F1 double-positivo e MMP-2 apresentou o pior prognóstico para a sobrevivência pobre do paciente. Estes resultados indicam que POU5F1 pode ligar-se ao promotor de MMP-2 durante a degradação da matriz extracelular circundante, e, portanto, promover capacidades invasivas e migratórias de LACSLCs. Além disso, nossos dados implicam que a detecção patológica das expressões de duplo positivos para POU5F1 e MMP-2 será útil como biomarcadores de diagnóstico e prognóstico da ALC para avançar a terapia anti-metástase

Citation:. Xin Yh, Bian Bsj, Yang Xj, Cui W, Cui Hj, Cui Yh, et al. (2013) POU5F1 Melhora a invasão das células estaminais-como câncer no pulmão Adenocarcinoma pela regulação positiva de MMP-2 Expressão. PLoS ONE 8 (12): e83373. doi: 10.1371 /journal.pone.0083373

editor: Persio Dello Sbarba, Università degli Studi di Firenze, Itália |

Recebido: 15 de julho de 2013; Aceito: 01 de novembro de 2013; Publicação: 30 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Xin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa, Grant No.2010CB529403), Fundações Nacional de Ciência Natural da China (Grant No.81272598) e China Pós-Doutorado Science Foundation (Grant No.2012T50852). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes humanas em todo o mundo [1]. Apesar dos grandes avanços na terapêutica do cancro do pulmão, o fracasso metástase e tratamento muitas vezes resultam em recorrência e mortalidade elevada. Uma razão possível falha terapêutica subjacente e mortes de seres humanos é a presença de células malignas residuais que, finalmente, dar origem a tumores e metástases secundárias [2].

Até à data, tem vindo a surgir evidências de que uma pequena população de células possuem atividade de iniciação tumor no cancro do pulmão e são denominados como ” células cancerosas tronco-like (CSLCs) ” [3], [4]. A presença de uma pequena subpopulação de CSLCs pode explicar por que tantos cancros do pulmão reincidência após o tratamento com a cirurgia, quimioterapia e radioterapia, mesmo quando a maioria das células malignas parecem ser mortos depois do tratamento [5], [6]. Portanto, é crítico para descobrir as características e mecanismos biológicos moleculares para a iniciação e progressão de CSLCs para o desenvolvimento de novas terapias. Anteriormente, nós estabelecemos com sucesso um

in vitro

sistema de cultura esfera para isolar e enriquecer “câncer adenocarcinoma do pulmão de células estaminais-like” (LACSLCs) e revelou que a família de genes homeobox POU5F1 fator de transcrição POU (também conhecido como Oct4) age como um regulador chave para a retenção de auto-renovação e tumorigenicidade de LACSLCs [7].

POU5F1 é necessário para manter a auto-renovação das células-tronco embrionárias (ES), e contribui para a stemness, tumorigênese e metástases de CSLCs [8] – [10]. Foi recentemente relatado que POU5F1 promove a invasão e metástases de alguns tumores sólidos através de uma melhor degradação do circundante matriz extracelular, sugerindo que este factor de transcrição pode ser útil como um alvo terapêutico potencial contra o cancro e um tumor romance biológica e marcador de prognóstico [11], [12]. No entanto, os mecanismos de expressão aberrante POU5F1 no câncer de pulmão subjacentes invasão e metástase são ainda imperceptíveis.

No presente estudo, demonstramos que a expressão POU5F1 foi associado com a invasão e migração de LACSLCs e explorou os mecanismos moleculares subjacentes. O significado clínico POU5F1 e metaloproteinase 2 (MMP-2) expressões nos pacientes com adenocarcinoma de pulmão (LAC) também foi investigado.

Materiais e Métodos

declaração Ética

Este estudo foi estritamente realizado de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Terceira Universidade médica Militar. espécimes ALC primárias humanas foram colhidas com o consentimento do paciente. Cada participante neste estudo foi informado com consentimento por escrito. espécimes ALC primárias humanas foram colhidas e o protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética Médica do Southwest Hospital da Terceira Universidade Médica Militar. Animais protocolos experimentais foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Ciências da Saúde e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Medical Terceiro Militar.

cultura celular

não-pequenas células humanas cancro do pulmão (NSCLC) linha celular A549 foi adquirido da American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) e cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /ml de penicilina e 100 U /ml estreptomicina (Gibco, EUA) numa atmosfera humidificada de 37 ° C incubadora com 5% de CO

2 atmosfera. cultura esfera do tumor foi realizado tal como descrito anteriormente [4], [13] – [15]

Lentivirus shRNA, construção siRNA e transfecção

construções lentivirais e os iniciadores de sequências de direccionamento curto hairpin Pou5f1 humanos. foram concebidas e preparadas por Sunbio Biotecnologia médica (Xangai, China). Os vectores de expressão de lentivírus shRNA foram preparadas por transfecção transiente das construções de lentivírus em células 293T para produzir vírus. A resultante lentiviral POU5F1-shRNA e controle-shRNA foram usadas para infectar as células A549. Um controlo-shRNA foi concebida através de mutação dos nucleótidos anti-sentido na sequência POU5F1 shRNA. As construções de plasmídeos que transportam uma sequência siRNA alvo MMP-2 foram projetados e construídos como descrito anteriormente [16]. As transfecções foram realizadas com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

In vitro

cicatrização de feridas ensaio

células confluentes foram feridos usando um 200- uL ponta da pipeta em placas de cultura de seis poços e incubadas em DMEM com 5% ou 10% de soro fetal de bovino na presença ou ausência de mitomicina C (10 ug /mL). A largura da ferida foi fotografado em 0h, 16h e 24h de pós-scratch sob um microscópio de contraste de fase. As distâncias de migração foram medidos e quantificados como descrito anteriormente [12]. O software de imagem assistida por computador foi usado para quantificar a migração celular em relação ao limite de linha de grade.

In vitro

invasão ensaio

A capacidade invasiva de células foi determinada em 24 formato -bem TRANSWELL® utilizando inserções com tamanho de poro de 8 um, revestidas com Matrigel® (BD Biosciences, EUA) como descrito anteriormente [17]. esferas tumorais foram tripsinizadas, ressuspensas em meio DMEM isento de soro, e colocados nas câmaras superiores dos insertos TRANSWELL® (5 × 10

4 /poço), e meio DMEM contendo 10% de FBS foi adicionado às câmaras inferiores. As células foram deixadas a invadir através da membrana durante 24 h e, subsequentemente, fixadas com 4% de paraformaldeído em PBS. As células não-invasivos nas câmaras superiores foram varridos por um cotonete e células invasoras foram coradas com solução de violeta cristal. Os números de células que tinham invadido à superfície inferior das inserções foram contadas sob um microscópio de luz.

análise tumorigenicidade

in vivo

Para xenotransplantes ratos, A549 aderente monocamada células e esferas de tumor foram dissociadas para obter uma única célula suspensões. Um número igual de células (5 × 10

5) foram diluídas em meio DMEM isento de soro e injetado subcutaneamente a ratinhos nu masculina de quatro semanas de idade (

n

= 5 cada, Centro de Animais Experimentais , Third Military Medical University, China). Os ratinhos foram monitorizados semanalmente para o aparecimento de tumores subcutâneos. No final de 7 semanas, todos os ratinhos foram sacrificados e engrafts tumorais foram removidos e medidos. O volume do tumor (TV) foi calculado usando a seguinte fórmula: TV (mm

3) =

d

2 ×

D

/2, onde d e D representam o mais curto e os diâmetros mais longos, respectivamente. Além disso, os tecidos de tumor foram fixados em formalina tamponada e subsequentemente realizada a histologia do tumor e análise imuno-histoquímica.

quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR)

O ARN total foi extraído a partir de células cancerosas usando Trizol Reagent (Invitrogen, EUA). qRT-PCR foi realizado usando o kit de SYBR PrimeScript RT-PCR (Takara, Japão) em um rotor de 6000 Gene em tempo real Genetic Analyzer (Corbett Life Science, EUA). Os iniciadores utilizados para a amplificação por PCR de fragmentos internos de MMP-2 são listados como se segue: 5′-CCACTGCCTTCGATACAC-3 ‘(com sentido); 5’-GAGCCACTCTCTGGAATCTTAAA-3 ‘(anti-sentido). desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foi amplificada como um controlo interno. Cada amostra foi testada pelo menos em triplicado.

análise Western blot

Os lisados ​​celulares de células em monocamada A549 e esferas de tumor foram preparados usando tampão RIPA com inibidores de protease e quantificada utilizando o ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). As amostras de proteína (20 ug) foram carregados em um 10% de SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF (Millipore, EUA). Os complexos imunitários foram formados por incubação de anticorpo monoclonal de ratinho de MMP (1:400; Abcam, EUA), anticorpo policlonal de coelho POU5F1 (1:500; BD Biosciences, EUA) e anticorpo policlonal de coelho Actina (1:5000; Abcam, EUA) a 4 ° C durante a noite, seguido por incubação com anticorpos conjugados com peroxidase de rábano secundárias ao rato ou IgG de coelho (1:5000; Invitrogen, EUA). proteínas imunorreactivas foi visualizada usando SuperSignal Oeste Femto Teste Kit (Pierce, Rockford, IL) por um sistema de detecção de quimioluminescência reforçada.

cromatina imunoprecipitação (CHIP)

ensaio ChIP foi realizada com um chip-IT kit de acordo com o protocolo do fabricante. condições de corte ultra-som resultou em fragmento de DNA relativamente uniforme no tamanho dos -300 pb. Os procedimentos restantes foram completadas como previamente descrito [7]. O ADN genómico foi extraído de os precipitados e amplificado por qRT-PCR. Os pares de iniciadores utilizados para a PCR para amplificar a região do promotor de MMP-2 contendo o elemento de ligação POU5F1 foram:. CATGACAACAGGCTTTGGATTAG 5′-3 ‘(sentido) e 5′-AACAAACTCTTAGGCAACGAACC -3’ (anti-sentido)

A imuno-histoquímica (IHC)

coloração imuno-histoquímica de tecidos e xenoenxertos de tumores foi realizada em amostras utilizando o método da estreptavidina-biotina peroxidase (SABC). Resumidamente, as amostras de xenoenxerto foram fixadas em paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante 72 h e embebidas em parafina. As secções de parafina foram incubadas com anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite. As lâminas foram então feito reagir com de cabra biotinilado anti-IgG de murganho /coelho e complexo avidina-biotina (ABC) (Beyotime, China). Para visualização dos complexos anticorpo-antigénio, reacção cromogénio foi realizada com diaminobenzidina (DAB) e as lâminas foram examinadas sob um microscópio de luz. Para a quantificação, o software PIP (imagem-Pro Plus 6.0) foi usado para analisar a densidade óptica das imagens dentro de 5 campos aleatórios a 400 x de ampliação. A densidade óptica média (AOD), ou seja, IOD /área, foi calculada.

A transfecção e ensaio de repórter de luciferase

Construção e transfecção transiente de pirilampo plasmídeo repórter de luciferase foram realizados como previamente descrito [18] . A sequência de pGL3-MMP-2 construção do promotor foi confirmada (Sunbio Biotecnologia médica, China). O LACSLCs A549 shRNA-Pou5f1-infectadas shRNA-Control e foram semeadas em placas de 24 poços (1 × 10

5) em cada poço. Após 24 horas, as células foram co-transfectadas com pGL3-MMP-2 do promotor e do vector de Renilla (pRL-TK: Promega, EUA). Os lisados ​​celulares foram recolhidos a 48 horas pós-transfecção e a actividade da enzima repórter de luciferase relativa foi medida utilizando o Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, EUA). atividade luciferase Firefly foi normalizada para a actividade da luciferase Renilla para cada amostra.

microarray de tecido (TMA) a análise

Um total de 55 pacientes com LAC primária que receberam ressecção cirúrgica foram incluídos. tipos de tumor foram definidos de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde. O estado do tumor-nódulo-metástase (pTNM) de todos os PMA foi avaliada de acordo com os critérios da sexta edição da classificação TNM da União Internacional Contra o Cancro [19]. As características clínico-patológicos de pacientes foram resumidos na Tabela 1. A TMA foi construído como descrito anteriormente [20].

A análise estatística

Todas as experiências foram realizadas pelo menos três vezes em triplicado. Os dados foram apresentados como a média ± SEM. A análise estatística foi realizada utilizando software SPSS13.0. Diferença estatisticamente significativa foi avaliada através da análise de uma via de variância (ANOVA), seguido de comparações múltiplas de médias pelo teste de Student-Newman-Keul. diferença estatística foi considerado significativo se

P

-valor foi inferior a 0,05.

Resultados

LACSLCs exibir habilidades altamente migratórias e invasivos

Em nosso estudo, nós estabelecemos um sistema de cultura esfera estável para isolar e enriquecer LACSLCs para elucidar seus comportamentos biológicos. Como mostrado na Figura 1, as células A549 que foram cultivadas na SFM com EGF e bFGF gerado não-aderente, esfera multicelular LACSLCs (Figura 1A), e estes esfera LACSLCs exibida altamente invasiva e capacidades migratórias

In vitro

(Figura 1B e C) e

in vivo

(Figura 1D). Os resultados do

in vitro

ensaio de cicatrização demonstrou que esfera LACSLCs migraram para a área riscada mais rapidamente do que células A549 monocamada. Além disso, resulta de um

in vitro

ensaio de invasão Matrigel mostraram que LACSLCs A549 exibida maior capacidade invasiva do que as células A549 monocamada (137,5 ± 17,7 contra 49,7 ± 9,2 invadir células /campo). Além disso, LACSLCs A549 apresentaram maior tumorigenicidade

in vivo

que levou à xenoenxertos de tumores maiores, com atividade de invasão reforçada (Figura 1D). No geral, estes resultados indicam que LACSLCs são altamente migratória e invasivo

in vitro

e

in vivo

.

(A) Morfologia da esfera-LACSLCs derivadas de células A549 câncer de pulmão linha. Imagens representativas de microscopia de luz (células monocamada 10 ×, LACSLCs 20 ×) são mostrados. (B) a cicatrização de feridas ensaio para a migração de células de LACSLCs A549 e células A549 monocamada. Imagens representativas de migração celular para a área de feridos em 0 e 16 horas pós-lesão (

painel esquerdo) são mostrados. A análise quantitativa mostra ferida capacidade de reparação de células que migram aos 16 h pós-lesão (

painel direito

). (C) Comparação da capacidade invasiva em LACSLCs A549 e células monocamada detectados pelo transpoço ensaio. Imagens representativas de células visualizadas por coloração violeta cristal (20 ×) invadindo (

painel esquerdo

). A análise quantitativa da capacidade de invadir células às 24 h após a semeadura (

painel direito

). (D) as imagens histológicas por H E coloração em microscopia de luz. Os tumores formados por LACSLCs A549 foram altamente invasivo e as células do tumor invadiu a vizinha camada muscular (setas vermelhas; 20 ×). Todas as experiências foram realizadas pelo menos em triplicado e os dados são apresentados como a média ± SEM. Estudante

t

teste foi realizado para avaliar a diferença.

POU5F1 e MMP-2 são anormalmente alta expressos em LACSLCs

A fim de elucidar o mecanismo subjacente para as elevadas capacidades invasivas e migratórias de LACSLCs, examinou-se o factor de transcrição de células POU5F1 haste e a protease de zinco para a degradação da matriz extracelular de MMP-2. A imunocoloração (Figura 2A) e Western blot (Figura 2B) as análises mostraram que a MMP-2 e foram POU5F1 aberrantemente elevada expresso em LACSLCs A549. Além disso, a análise imuno-histoquímica demonstrou que o nível de expressão de MMP-2 em tecidos tumorais formados por LACSLCs A549 foi maior do que o de tumores formados por células A549 em monocamada (Figura 2C). Colectivamente, estes resultados sugerem que os aberrantemente elevados de expressões POU5F1 e MMP-2 podem desempenhar papéis importantes na regulação da capacidade de células migratórias e invasivos de LACSLCs.

(A) Imunocoloração de POU5F1 e MMP-2 observado por A microscopia confocal. (B) Expressão do factor de transcrição de células estaminais POU5F1 foi detectado por Western blot. (C) A análise imuno-histoquímica da proteína MMP-2 em tecidos tumorais formados por LACSLCs A549 e células de monocamada. Imagens representativas de MMP-2 expressão por coloração IHC (20 ×) (

painel esquerdo

). A análise quantitativa dos níveis de proteína de MMP-2 em tecidos tumorais formados por LACSLCs A549 e células de monocamada. Todas as experiências foram realizadas pelo menos em triplicado e os dados são apresentados como a média ± SEM. Estudante

t

teste foi realizado para avaliar a diferença.

POU5F1 knockdown perturba a invasão celular, migração e Tumorigênese potenciais de LACSLCs

Para confirmar o efeito inibitório do POU5F1 downregulation na invasão celular e migração, examinamos se knockdown de POU5F1 poderia reduzir os potenciais migratórios e invasivos de LACSLCs. Como mostrado na Figura 3, que contêm LACSLCs shRNA-Pou5f1 migrado muito mais lento do que as células de controlo (Figura 3A e B). LACSLCs A549 com POU5F1 knockdown resultou em significativa diminuição do número de células invasoras através do Matrigel para a câmara inferior em comparação com LACSLCs A549 shRNA-Control-infectadas (Figura 3C e D). Além disso, os tumores formados por LACSLCs A549 com POU5F1 knockdown foram muito menores do que as células de controlo (Figura 3E), e exibida invasão diminuída em camadas musculares. Estes resultados sugerem que maiores capacidades invasivas e migratórias de LACSLCs resultar da expressão aberrante de alta POU5F1. Além disso, verificou-se que as capacidades de invasão celular e migração foram significativamente inibido após a MMP-2 knockdown no LACSLCs (Figura 3F e G).

(A) Imagens representativas de ferida ensaio para a migração de células de shRNA controle de cura ou shRNA-Pou5f1-introduzida LACSLCs A549. (B) Análise quantitativa da capacidade de reparação de feridas de LACSLCs A549 contendo shRNA-control ou shRNA-Pou5f1 às 24 h após a semeadura. (C) Imagens representativas de células invasoras contendo shRNA-control ou shRNA-Pou5f1 visualizado por coloração violeta cristal (20 ×). (D) Análise quantitativa da capacidade invasiva de LACSLCs A549 contendo shRNA-control ou shRNA-Pou5f1. (E) A análise quantitativa do volume do tumor xenoenxerto formado por LACSLCs A549 contendo shRNA-Control ou shRNA-Pou5f1. (F) A análise quantitativa da capacidade de reparação de feridas de LACSLCs A549 contendo siRNA de controlo ou ARNsi-MMP-2 a 24 horas após a sementeira. (G) A análise quantitativa da capacidade invasiva de LACSLCs A549 contendo siRNA de controlo ou ARNsi-MMP-2. Todas as experiências foram realizadas pelo menos em triplicado e os dados são apresentados como a média ± SEM. Estudante

t

teste foi realizado para avaliar a diferença.

POU5F1 knockdown reprime a expressão e atividade de MMP-2

Desde POU5F1 e MMP-2 são significativamente regulada em LACSLCs, seria de interesse para investigar a relação entre estas duas moléculas envolvidas na capacidade de invasão e migração celular. Como mostrado na Figura 4A e B, de qRT-PCR e análise de Western blot revelaram que os níveis de mRNA e proteína de MMP-2 foram marcadamente reduzidos em LACSLCs A549 contendo shRNA-Pou5f1. A análise revelou que ChIP POU5F1 ligado ao promotor de MMP-2, sugerindo que POU5F1 pode ser responsável pela activação da transcrição de MMP-2 (Figura 4C). Além disso, knockdown de POU5F1 reduziu significativamente a actividade de luciferase de uma construção repórter contendo a MMP-2 do promotor (Figura 4D). Os nossos resultados demonstram que POU5F1 em LACSLCs regula a expressão de MMP-2 por direccionamento directamente MMP-2 a transcrição.

(A) análise de qRT-PCR da expressão de MMP-2 de ARNm em LACSLCs A549 após POU5F1 knockdown. (B) POU5F1 knockdown diminui a expressão da proteína de MMP-2 em LACSLCs A549 detectadas por análise Western Blot. (C) análise ChIP do fator de transcrição ligação a MMP-2 promotor POU5F1. (D) Ensaio de repórter de luciferase demonstra inactivação do promotor de MMP-2 após POU5F1 knockdown no LACSLCs A549. As células foram transitoriamente transfectadas com uma construção repórter de luciferase utilizando Lipofectamina 2000 reagente. Após incubação durante 24 h, as células foram colhidas em tampão de lise passiva, e as actividades de luciferase foram medidos por um luminómetro utilizando o sistema de ensaio de luciferase. Todas as experiências foram realizadas pelo menos em triplicado e os dados são apresentados como a média ± SEM. Estudante

t

teste foi realizado para avaliar a diferença.

POU5F1 e MMP-2 estão correlacionados com a sobrevida dos pacientes ALC

As correlações clínico-patológicas com as expressões de ambos POU5F1 e MMP2 foram examinados em uma TMA contendo 55 espécimes de adenocarcinoma de pulmão para elucidar as suas associações com a sobrevida dos pacientes ALC (Tabela 1). Usando os critérios descritos antes, altas expressões de POU5F1 (Figura 5A) e MMP-2 (Figura 5B) foram observadas em 26 (47,3%) e 39 (70,9%) de amostras de adenocarcinoma de pulmão 55, respectivamente. Descobrimos que a alta expressão de POU5F1 correlacionado com um ascendente nó patológica (PN) palco de adenocarcinoma de pulmão (

P

= 0,042).

(A) e (B) Análise de Kaplan-Meier das correlações de POU5F1 e MMP-2 com sobrevida específica pobres doença (DSS) em 55 pacientes da ALC. (C) A expressão combinada de POU5F1 e MMP-2 indica pobres DSS para pacientes da ALC. expressão positiva Duplo para POU5F1 e MMP-2 mostra a pior previsão para as taxas de sobrevivência pobres do paciente (

P Art 0,001). GP0: POU5F1 (baixa expressão) e MMP-2 (baixa expressão); GP1: POU5F1 (expressão elevada) ou MMP-2 (alta expressão); GP2: POU5F1 (expressão de altura) e MMP-2 (high expressão)

Pela análise univariada, altas expressões de POU5F1 e MMP-2 foram correlacionados com sobrevida específica pobres doença (DSS) de pacientes (.

P

= 0,001,

P

= 0,073), respectivamente. Além disso, estratificada pacientes em três subgrupos de acordo com dois fatores desfavoráveis ​​acima referidos,

i.,

GP0, GP1 e Gp2. Como mostrado na Figura 5C, a sobrevivência média foi a mais longa no GP0 versus o mais curto uma na GP2 (isto é, 80,09 para GP0 meses, 66,8 meses para GP1, e 38,1 meses para Gp2, respectivamente, (

P

.. 0.001) (Figura 5C) análise de Kaplan-Meier demonstrou um impacto significativo do estágio do tumor parâmetro de prognóstico (

P

= 0,013) em DSS

Discussão

CSLCs tenham sido previamente relatada em vários tipos de câncer e provou desempenham papéis críticos na iniciação do câncer, desenvolvimento e recorrência, bem como falhas terapêuticas de câncer [21] – [24] até à data, pouco se sabe sobre os fenótipos invasivas e migratórias e sua regulamentação. mecanismo de CSLCs. neste estudo, descobrimos que POU5F1 fator de transcrição foi necessário para LACSLCs invasão e migração, e que poderia aumentar a MMP-2 expressão diretamente pela segmentação promotor MMP-2 para iniciar a transcrição. Além disso, aberrante altas expressões de ambos POU5F1 e MMP-2 são correlacionados com a sobrevivência de pacientes com ALC.

é bem conhecido que o factor de transcrição POU5F1 domínio POU desempenha um papel central na regulação das características de pluripotência em ambas as células-tronco somáticas e CSLCs [8] , [25]. Recentemente, foi relatado que POU5F1 induz propriedades CSLCs e contribui para a tumorigénese e metástase em ALC [9]. No entanto, os mecanismos subjacentes os potenciais invasivas e migratórias de CSLCs continuam a ser elucidado. Aqui, confirmou-se que LACSLCs derivados a partir de células A549 possuem capacidades altamente invasivas e migratórias, e estas células expressaram niveis elevados de POU5F1 e MMP-2. MMP-2 e outros membros da família de metaloproteinases de matriz são conhecidos para mediar a invasão e durante o desenvolvimento de metástases, e também são considerados como marcadores tumorais putativos para aplicações clínicas. [26] – [28]. MMP-2 degrada matriz extracelular e liberta armazenados factores pró-migratórias para permitir o movimento das células dentro dos tecidos [29]. No entanto, os inibidores de MMP demonstraram ser insatisfatórios em ensaios clínicos, quer devido a falta de selectividade para as MMPs ou aparecimento de efeitos adversos graves [16], [30]. O silenciamento do gene específico para o alvo de estudos de expressão de MMP-2 apresenta a eficácia de siRNA-MMP-2 na inibição da migração e invasão LACSLCs, sugerindo que a MMP-2 pode actuar como um potente adjuvante para a terapia de gene alvo-em ALC.

foram observados os níveis de expressão elevados de MMPs em células de câncer de bexiga com superexpressão POU5F1, sugerindo que a superexpressão de POU5F1 regula positivamente genes de MMPs [11]. Os nossos dados indicam que tanto POU5F1 e MMP-2 podem contribuir para a iniciação do tumor e invasão fenótipo de metástases de cancro do pulmão. Nós revelou que a expressão da proteína de MMP-2 foi significativamente diminuído em LACSLCs após POU5F1 knockdown pela estratégia shRNA. Além disso, os ensaios de chip e luciferase mostraram pela primeira vez que a depleção de POU5F1 com shRNA causada regulação negativa da transcrição do gene endógeno que a MMP-2 e um promotor-repórter de MMP-2, sugerindo que a MMP-2 é um alvo da transcrição directa de POU5F1 em LACSLCs . Nossos resultados suportam o conceito de que a ação necessária e suficiente de POU5F1 em ativar diretamente a expressão de genes-alvo específicos para promover LACSLCs invasão e migração. Há também a possibilidade de que POU5F1 pode reprimir certos genes, particularmente nos casos em que pode ligar-se de forma cooperativa com outros fatores de transcrição com a atividade de repressão para melhorar a invasão e migração celular, e isso pode explicar a sua associação com complexos corepressor.

Desde a patogênese e biológicos comportamentos dos diferentes subtipos de câncer de pulmão são bastante distintos, é urgente para explorar os métodos de diagnóstico avançados e novos marcadores de prognóstico para diferentes subtipos de câncer de pulmão para melhorar a eficácia da terapia do câncer. Nossas descobertas que POU5F1 pode regular positivamente MMP-2 expressão para promover a invasão de células tumorais e migração de LACSLCs ter implicações clínicas importantes. Embora não observamos uma ligação expressão positiva entre POU5F1 e MMP-2, a expressão mais elevada de cada molécula foi significativamente associada com o mau prognóstico, o que é consistente com estudos anteriores que POU5F1 e MMP-2 foram relatados para se tornar fatores de risco independentes para mau prognóstico no câncer de pulmão [14], [31] – [33]. Mais importante ainda, que aqui determinada para a primeira vez que combinada sobre-expressão destas duas moléculas apresentaram o pior prognóstico pobre dos pacientes ALC, sugerindo que a expressão de POU5F1 e MMP-2 apresenta uma vantagem para as células cancerosas para manter a invasão e propriedades de migração em ALC . Assim, o exame patológico combinado de POU5F1 e MMP-2 por IHQ pode ser usado como uma ferramenta adicional na identificação dos PMA com altos níveis de CSLCs para fornecer um forte biomarcador preditivo no manejo clínico de pacientes da ALC.

em conclusão, este estudo demonstra que POU5F1 e MMP-2 contribui para a invasão tumoral e fenótipo de migração LACSLCs, e aberrantemente elevada expressão de POU5F1 pode melhorar a expressão de MMP-2 por direccionamento directamente o promotor de MMP-2. Além disso, revelamos que a superexpressão combinado de POU5F1 e MMP-2 está correlacionado com os pobres sobrevida dos pacientes com LAC. Nossas descobertas indicam que POU5F1 é necessário para controlar a invasão e migração celular através da regulação direta de MMP-2 no cancro do pulmão, e apoiar a ideia de que POU5F1 e MMP-2 será útil como potenciais biomarcadores de prognóstico e novos alvos para a terapia de Caner do pulmão.

Reconhecimentos

Agradecemos a Srta Wen-juan Fu e Miss Qing Liu (Instituto de Patologia e Southwest Cancer Center, Hospital Southwest, Third Military Medical University, Chongqing, China) por sua assistência técnica.