Abstract

Fundo

O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é sobre-expresso em 80% de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) e está associada a menor sobrevida. Em anos recentes, inibidores da EGFR-alvo foram testados na clínica para NSCLC. Apesar do surgimento de novas terapias e sua aplicação na terapia do cancro, a taxa de sobrevida global de pacientes com câncer de pulmão permanece 15%. Para desenvolver terapias mais eficazes para o cancro do pulmão há uma combinação entre o anticorpo anti-EGFR (Clone 225) como uma terapêutica molecular com nanopartículas híbridas plasmonic magnéticos (NP) e testados em câncer de pulmão de células não-pequenas células (NSCLC).

Metodologia /Principais achados

A viabilidade celular foi determinada por ensaio tripan-azul. a expressão da proteína celular foi determinado por Western blotting. C225-NPs foram detectados por microscopia eletrônica e microscopia confocal, e expressão EGFR utilizando imunocitoquímica. C225-NP exibiu um efeito antitumoral forte e selectiva em células NSCLC-expressando EGFR por inibição da transdução de sinal mediada pelo EGFR e autofagia induzida e a apoptose em células tumorais. imagens ópticas mostrou especificidade das interacções entre células NSCLC expressando EGFR C225-NP e. Não foi observada ligação de C225-NP para células NSCLC EGFR-nulo. C225-NP exibiu maior eficácia na indução de morte celular em comparação com a mesma quantidade de anticorpo C225 livre em células tumorais, com diferentes níveis de expressão do EGFR. Além disso, em contraste com C225-NP, anticorpo C225 livre não induziu autofagia em células. No entanto, a eficácia terapêutica de C225-NP aproximou-se gradualmente o nível de anticorpos livres tal como a quantidade de anticorpo C225 conjugadas por nanopartículas foi diminuída. Finalmente, anexando C225 a NP foi importante para produzir a morte de células tumorais reforçada, além da mistura de C225 gratuito e NP não demonstrou o mesmo grau de actividade de morte celular.

Conclusões /Significado

Nós demonstramos pela primeira vez que o mecanismo molecular de C225-NP induziu efeitos citotóxicos em células de cancro do pulmão que não são característicos de molecular therapeutics gratuitos aumentando assim a eficácia da terapia contra NSCLC

citação:. Yokoyama t, J Tam, Kuroda S, Scott AW, Aaron J, Larson T, et al. (2011) Híbridos nanopartículas magnéticas plasmonic alvo EGFR sinergicamente Induzir autofagia e apoptose em células não pequenas do cancro do pulmão de células. PLoS ONE 6 (11): e25507. doi: 10.1371 /journal.pone.0025507

editor: Sujit Basu, Universidade do Estado de Ohio, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de agosto de 2011; Aceito: 05 de setembro de 2011; Publicação: 07 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Yokoyama et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo Instituto Nacional do Câncer concede R01CA103830, RO3EB009182, P50CA070907 (SPORE no câncer pulmonar), CA16672, e o Legado Joans: United contra o câncer pulmonar. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), é sobre-expresso em 80% de NSCLC e está associada com a sobrevivência pobre [1]. Em anos recentes, inibidores da EGFR-alvo foram testados na clínica para NSCLC [2] – [6]. No entanto, a terapêutica moleculares emergentes tem produzido aumentos modestos na sobrevida do paciente sobre a sobrevivência dos pacientes que receberam tratamentos não-alvo padrão. Como resultado, a taxa de sobrevida global de pacientes com cancro do pulmão continua a ser inferior a 16% [7]. Assim, não é continuada estímulo para desenvolver e testar novas terapias. Nossa abordagem para superar a limitação de terapias atuais foi a de combinar terapias moleculares com o campo emergente da nanotecnologia e teste contra o câncer de pulmão.

Tem sido demonstrado convincentemente que a nanotecnologia pode fornecer soluções únicas para revolucionar o diagnóstico e tratamento de muitas doenças devastadoras, tais como cancro [1], [8] – [11]. Uma área específica de grande interesse é o desenvolvimento de nanopartículas de imagiologia molecular específica, a terapia combinada e de imagem /terapia [12] – [13]. Multiplexação diferentes tipos de nanopartículas (NPs) e moléculas de segmentação fornece uma plataforma comum para múltiplas aplicações de imagem com um alto grau de flexibilidade [14] – [15]. Embora a terapia de imagem e fototérmica com NPs plasmonic plasmonic e híbridos têm sido extensivamente estudada, os mecanismos moleculares de interações NP com células vivas não é totalmente compreendido. Recentemente, demonstrou-se que o NPS interagir com as células de um modo dependente do tamanho, com 40-50 NPs nm mostrando a maior absorção celular [16]. No entanto, neste estudo os efeitos de sinalização molecular seguinte NPs captação não foi investigada.

No presente estudo nós combinamos o anticorpo anti-EGFR (Clone 225) como uma terapêutica molecular com NPs magnéticas plasmonic híbridos e estudou a molecular interações entre NP alvo EGFR (225-NP) na faixa de tamanho de 40-50 células do cancro do pulmão de células não pequenas humano (NSCLC) nm e. O 225-NP é composto por um núcleo de ferro paramagnético que está rodeado por uma camada de ouro e é funcionalizado com anticorpos monoclonais anti-EGFR (Clone 225). Nós usamos células de câncer de pulmão humanos com diferentes níveis de expressão de EGFR e mudou a composição da superfície da NP para elucidar os mecanismos de estas interações. Nosso objetivo inicial era usar C225-NP como um agente de imagem orientada para EGFR superexpressão células de câncer de pulmão. Inesperadamente, descobrimos que o C225-NP foi citotóxica selectiva para células de câncer de pulmão EGFR-superexpressão além do que seria esperado a partir do anticorpo não conjugado. Nossos resultados fornecem uma nova direção para o aumento de potência da terapêutica específica moleculares através de seu arranjo tridimensional em nanoescala usando o NPS como modelos.

Resultados e Discussão

225-NP-tratamento regula EFGR- via de sinalização e de matar as células do tumor do pulmão de forma mais eficaz do que as células normais

em primeiro lugar, examinamos o EGFR (fosforilada e total) na expressão de várias linhas de células NSCLC humanas que são do tipo selvagem (H1229), mutado e sobre-expresso (HCC827, H1975 , H3255), amplificado (H1819), ou nula (H520) para EGFR e em comparação com a expressão de EGFR em fibroblastos pulmonares normais (MRC-9 e WI38) e as células normais epiteliais brônquicas humanas (NHBE) por transferência de Western. Ambos EGFR total e fosforilado (pEGFR) expressão foi detectada em todas as linhas celulares testadas, excepto para as células que são H520 nulo para o EGFR. No entanto, os níveis de expressão pEGFR variou entre as linhas de células com expressão elevada detectada em HCC827, H1819 e H3255 células (Figura 1A). células H1299 tinha um nível de expressão intermediário de pEGFR. Em contraste, as células de células normais (NHBE, células MRC-9, e WI38) e H1975 expressa níveis baixos de pEGFR. O tratamento com NP-C225 significativamente (P = 0,05) reduziu a viabilidade das células cancerosas positivas HCC827 EGFR, H1299, H1819 e comparado com o tratamento com o controlo de IgG-NP (Fig 1b.). Os efeitos inibitórios C225-NP-mediadas por mais variadas entre as linhas celulares tumorais testadas e foi independente do estado mutacional EGFR. Sem efeitos inibidores foram observados em células H520 tratadas com NP-C225 quando comparadas com as células tratadas-NP-IgG. Entre as células normais, células MRC-9, mas não as células NHBE mostraram alguns efeitos inibitórios quando tratados com C225-NP e comparado com o tratamento de IgG-NP (Figura 1b). No entanto, os efeitos inibidores observados no-tratados C225-NP MRC-9 (9%), as células foram menores do que os efeitos inibitórios observados nas células tumorais tratadas com NP-C225 (14-18%).

(um ) Expressão do EGFR fosforilado e total nas células normais e NSCLC. (B) morte celular em resposta ao alvo EGFR C225-NP em NSCLC e células normais. Os resultados apresentados são as médias ± S.D. de três experiências independentes. * P-valor. 0,05 vs IgG-NP em H1299, HCC827 e H1819 células

Em seguida, avaliamos a expressão da proteína EGFR fosforilada e moléculas no tumor e células normais de sinalização após associado ao EGFR tratamento com o IgG ou C225-NP. redução da expressão de EGFR fosforilado-, -Akt, -p38MAPK, e p44 /42MAPK após o tratamento C225-NP foi observada em células H1299 e HCC827 quando comparada com células tratadas com o controlo de IgG-NP (Figura 2). Em células H520 a expressão de todas estas proteínas permaneceram inalteradas quando tratados com 225-NP e comparado com células tratadas com IgG-NP (Figura 2). A análise imuno-histoquímica mostrou expressão pEGFR foi marcadamente reduzida (35%;

P

0,05) em células HCC827 aos 30 e 60 minutos após o tratamento com NP-C225 comparação com a expressão pEGFR em células tratadas com IgG-NP (8 -12%; Figura S1). Em células normais (células MRC-9 e NHBE), não houve uma redução marcante na pEGFR ou as proteínas associadas analisados ​​a partir de IgG-NP e NP-C225-tratamento (Figura 2).

Os efeitos inibidores de C225- NP em EGFR fosforilada e as moléculas de sinalização a jusante no câncer de pulmão humano e células normais. tratamento C225-NP reduzida a expressão de formas fosforilada (p) de EGFR, Akt, MAPK p38, e p42 /44 MAPK em células tumorais EGFR-positivo, mas não em células normais. Não houve efeito sobre as células tumorais H520 EGFR-nulo.

225-NP-tratamento produz maior atividade antitumoral do C225 e NP tratamento sozinho

Em seguida, determinou-se a contribuição do componentes individuais que constituem o C225-NP sobre os efeitos inibidores do crescimento observados em células tumorais. células tumorais tratadas com HCC827 AuFe sozinho, e-anticorpo C225 livre sozinha reduziu a viabilidade celular em 12-14% em relação às células de controlo não tratadas, enquanto o tratamento com a combinação de anticorpo C225-AuFe livre mais reduzido o número de células em 22% (Figura 3a). Curiosamente, C225-NP reduziu muito o número de células (48%; P 0,05) que foi marcadamente superior do que o efeito inibidor produzido pelo constituintes individuais (225 de anticorpo, AuFe) indicando a conjugação de anticorpos C225 a NP aumenta a actividade anti-cancro de C225- NPS. Para validar os nossos resultados ainda que compararam os efeitos inibitórios do anticorpo C225 com anticorpo clone 29.1. Ambos os anticorpos do clone 225 e o clone 29.1 se ligam a EGFR. No entanto, ao contrário do clone 29.1 do clone 225 liga-se a um resíduo de hidrato de carbono na porção externa do EGFR e não inibe mediada por EGF-EGFR sinalização [17]. Tratamento de HCC827 células com C225-NP produziu o maior efeito inibitório (~42%; P 0,05; Figura 3b), que foi significativamente maior quando comparado com o efeito inibidor produzido pelo clone 29.1-NP (~14%) e outros tratamentos de controle (~ 7% -15%). Estes resultados demonstram conjugação de Clone 225 anticorpos para AuFe NP confere uma propriedade única que aumenta a atividade antitumoral contra EGFR-células cancerosas positivas. Similar aos nossos achados, a conjugação do anticorpo anti-ErbB2 ao ouro esférico NP demonstraram aumento morte de células de cancro da mama, em comparação com o anticorpo anti-ErbB2 e NP sozinho [18]. Neste estudo, a citotoxicidade foi investigado como uma função do tamanho da NP. No entanto, o estudo não aborda o mecanismo molecular para matar células tumorais reforçada. A importância da densidade superficial de anticorpos ligados a nanopartículas, também não foi analisada.

(a) HCC827 células tratadas com NP-C225 demonstrou efeito significativo matando tumor comparado com o tratamento com AuFe, 225 e anticorpo AuFe mais C225. * Valor de P é 0,05. (B) Comparação dos efeitos inibitórios produzidos por 29,1 NP-NP-C225 com HCC827 em células. C225-NP tratamento produziu um efeito maior do que matando tratamento 29.1-NP em comparação com outros grupos de tratamento. * P valor é . 0,05

225-NP-tratamento induz a autofagia e apoptose em células tumorais EGFR-positivo, mas não em células tumorais EGFR-negativos

Aqui para determinar a mecanismo molecular da inibição do crescimento do tumor C225-NP-mediada Foram realizadas análises de citometria de fluxo em-NP-C225 HCC827 tratada e -H520 células. Tal como mostrado na Figura 4a, a população sub-G1, que indica a percentagem de células apoptóticas, aumentou de uma forma dependente da dose, após tratamento com NP-C225 (9% -20%) em HCC827 células comparado com o controlo de IgG-NP- células tratadas (4% -8%). tratamento C225-NP marcadamente aumentou o número de células na população sub-G1 do que o tratamento com o clone 225 de anticorpo sozinho na concentração equimolar (Figura S2). Como esperado, não houve um aumento no número de células na população sub-G1 em células H520-NP-C225 tratados em comparação com outros tratamentos (Figura 4A). Assim, C225-NP eficazmente induzida apoptose em-EGFR que expressa HCC827 células mas não em células H520 nula EGFR.

(a) Percentagem de células NSCLC tratados com doses diferentes (0,6, 1,2 e 2,4 × 10

10) partículas de IgG-NP ou NP-C225 durante 72 horas que estava na sub-L

uma fase do ciclo celular. Esta percentagem foi determinada por análise de DNA de fluxo de citometria. células não tratadas e células tratadas com o anticorpo C225 sozinho serviu como controle. Um aumento dependente da dose no número de células em fase HCC827 subG1 foi observado em ambos os tratamentos de IgG-NP e NP-C225. No entanto, o aumento no número de células em subG1 foi significativamente maior no tratamento C225-NP do que em IgG-NP (

* P 0,05). Não houve aumento significativo na fase subG1 em células H520 entre IgG-NP e NP-C225-tratamentos. (B) detecção de pontos de GFP-LC3 indicativos de autofagia em células NSCLC que não foram tratados ou tratados com o anticorpo C225, IgG-NP ou NP-C225 (3 x 10

9 partículas) durante 72 horas sobre lâminas de câmara.

Barra de escala = 50 um

(c) Quantificação do número de células com pontos de GFP-LC3 em células NSCLC não tratados e tratados. O número de células com pontos de GFP-LC3 foi mais elevada em células tratadas HCC827-C225-NP em comparação com todos os outros grupos de tratamento. Em células H520 não houve um aumento do número de pontos de GFP-LC3 quando tratados com C225-NP e comparado a todos os outros grupos de tratamento. Os resultados apresentados são as médias ± S.D. de três experiências independentes. * Valor de P . 0,05 vs controlo não tratado, o anticorpo C225, e IgG-NP em HCC827 células

Recentemente, tem sido demonstrado que os pontos quânticos induzir autofagia dependente do tamanho das células estaminais mesenquimais humanas [19]. Nós, portanto, examinar se a autofagia ocorreu em células NSCLC após o tratamento com C225-NP. A proteína fluorescente (GFP) vector de expressão tagged verde de LC3 é uma ferramenta útil para a detecção de autofagia [20]. Na microscopia de fluorescência, as células HCC827 GFP-LC3-transfectadas mostraram distribuição difusa de GFP-LC3 para as células não tratadas e células tratadas com o clone 225 de anticorpo por si só e com IgG-NP, enquanto que as células tratadas com C225-NP mostrou pontos puntiformes GFP-LC3 indicativa de vacúolos autofágicos (Figura 4B). A percentagem de células com pontos puntiformes GFP-LC3 aumentado após o tratamento com NP-C225 para HCC827 células (Figura 4C; P 0,05). A indução de autofagia determinado por LC-GFP-3 pontos, também foi aumentado significativamente nos C225-NP-H1299 tratadas células em comparação com outros grupos de tratamento (Figura S3). Em contraste, a quantidade de pontos puntiformes GFP-LC3 não era diferente nos C225 NP-H520 tratadas células e grupos de controlo (Figura 4B, C).

examina então as células tratadas com NP-C225 para a presença e temporização de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e expressão de clivagem LC3, que são marcadores moleculares indicativas das células que sofrem apoptose e autofagia respectivamente. clivagem de PARP era evidente em 24 horas após o tratamento com IgG-NP e NP-C225 de HCC827, mas não células H520; No entanto, a clivagem de PARP era mais elevada com C225-NP do que com o controlo-NP em HCC827 células (Figura 5a). A proteína LC3 existe em duas formas celulares, LC3-I e II-LC3. LC3-I é convertido LC3-II por conjugação a fosfatidiletanolamina, e a quantidade de LC3-II está intimamente correlacionada com o número de autofagossomas [21]. Em HCC827 células, o tratamento com NP-C225 aumentou significativamente a quantidade de LC3-II de um modo dependente do tempo (Figura 5a). Além disso, evidências recentes sugerem que a acumulação de LC3-II é representado de forma mais precisa em fluxo autophagic na presença de inibidores lisossomais [22]. Na presença dos inibidores da protease E-64-D e pepstatina A, endógena LC3-II aumentou após o tratamento com IgG-NP e NP-C225 HCC827 em células (Figura 5b). No entanto, o aumento no LC3-II foi maior em células tratadas com NP-C225 do que a IgG-NP. Aumento de LC3-II na presença de inibidores de protease foi também observada em células H1299 tratadas com C225-NP (dados não mostrados). Em contraste, a quantidade de LC3-II não foi aumentada em células H520 durante 72 horas de tratamento com NP-C225 comparação com o tratamento com IgG-NP (Figura 5a). Estes resultados indicaram que C225-NP causada tanto apoptose e autofagia ao mesmo tempo em células NSCLC expressa-EGFR. Surpreendentemente, foi também observada em células autofagia-NP-tratados IgG embora menos do que a observada em células tratadas-NP-C225 e tinham menos efeito sobre a morte das células do tumor. Nós supomos que o limiar autofagia em células tratadas com NP-C225 é mais forte devido à presença de anticorpos anti-EGFR e actua como um activador de morte conduzindo à activação da cascata de caspase e a morte celular por apoptose. Em contraste, a autofagia em células-NP-tratados IgG provavelmente serve como um sinal de sobrevivência e protege contra a morte celular. Outras diferenças podem existir e estamos actualmente a investigar o mecanismo em laboratório.

(a) As proteínas celulares foram lisadas no momento indicado após o tratamento com partículas IgG-NP ou C225-NP (0,6 × 10

10 partículas) e submetidas a transferência de Western. Em HCC827 mas não em células H520, aumentou a clivagem de PARP e LC3-II foi observada às 48 h e 72 h após o tratamento com NP-C225 e quando comparado com o tratamento de IgG-NP e de controlo não tratado. As intensidades de a quantidade de bandas LC3-II foram semi-quantificados por um software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) (b) células HCC827 foram tratados com IgG-NP ou C225-NP, durante 68 horas, as células foram ainda cultivadas com ou sem inibidores de protease [10 ug /ml de e-64-d e 10 ug /ml de pepstatina a (International LP BIOMOL, Plymouth Meeting, PA)] durante 4 horas. As proteínas celulares foram lisadas e imunotransferidas com anticorpo anti-LC3. Os níveis de proteína LC3-II, foi aumentada na presença de inibidores de protease em todos os grupos indicadores de ocorrência de autofagia. As intensidades da quantidade de bandas de LC3-II foram semi-quantificada por software ImageJ (National Institutes of Health).

Para analisar a associação entre C225-NP e autofagia, determinou-se a localização da C225 -np e vacúolos autofágicos, usando microscopia eletrônica de transmissão (MET). HCC827 células tratadas com o clone 225 de anticorpo IgG ou NP-exibiram muito poucas características autofágicos, ao passo que muitos vacúolos autofágicos foram observadas após o tratamento com NP-C225 (Figura 6;

P

0,05). Curiosamente, enquanto a maior parte do C225-NPs foram observados dentro autofágica e vacúolos vazios, alguns NPs também foram observados no interior dos núcleos. Semelhante a análise TEM, microscopia confocal revelou também alguns NPs dentro núcleos em células-NP-C225 tratadas (Figura 7). Embora pudemos demonstrar presença de NPs no núcleo das células que não se quantificar o número de NPs presentes no interior do núcleo da célula. Isto é por causa de algumas das limitações que existem com técnicas de microscopia confocal e MET. Por exemplo, a quantificação da percentagem de localização nuclear exigiria análises de várias células através do volume total celular que é impraticável usar tal técnica de alta resolução como MET. Três localização tridimensional de NPs com microscopia confocal é complicado pelo facto de, após a absorção celular NPs acumular-se no espaço perinuclear. Portanto, a resolução óptica não é suficiente para o NPS separados que estão localizados na proximidade imediata da membrana nuclear e citoplasmática no nos lados nucleares. Além disso, a microscopia confocal de objectos muito brilhantes, tais como o NPS pode resultar em uma forte fora de sinal de focagem, que pode conduzir a erros de interpretação da distribuição tridimensional das nanopartículas. As limitações da localização tridimensional de PN utilizando microscopia confocal óptica têm sido recentemente demonstrado em [23] onde a microscopia confocal grosseiramente sobrestimada a absorção citosólica de pontos de quantum.

Fotomicrografias

electrónica que mostra a ultra-estrutura de uma célula, incluindo o núcleo (N), de HCC827 células tratadas com o anticorpo C225 (0,065 ug /ml), IgG-NP, ou C225-NP (0,6 × 10

10 partículas) durante 72 horas. (I) As células não tratadas (ii) C225 células tratadas com anticorpos (iii) células tratadas com IgG-NP (iv) células tratadas com NP-C225 (v) Uma vista ampliada da área em caixas em (IV). A seta indica NP, e a ponta da seta indica autofagossomas que inclui material residual e NP no citoplasma (vi) C225-NP detectado dentro do núcleo. A seta indica NP no núcleo.

Escala da barra = 1 uM.

(Vii) autofagossomas foram quantificados, tal como descrito em Materiais e Métodos. * Valor de P . 0,05 vs controle, anticorpo C225 e IgG-NP por 48 e 72 horas

(linha superior) imagens confocal mostram DAPI manchado núcleos (azul) e C225-NP (vermelho ). Setas no ponto de coluna “média” para C225-NP localizada em um núcleo. As setas nas colunas rotuladas “topo” e ponto “inferior” a mesma área no plano xy do núcleo, mas em locais acima e abaixo do meio do núcleo, respectivamente. Tanto no “top” e “bottom” imagens, as setas não são mais apontando para manchas vermelhas que indicam que as manchas vermelhas na imagem “média” são, na verdade dentro do núcleo. (Inferior fila) dos desenhos indica a posição Z de cada imagem no interior do núcleo, em que a linha horizontal vermelha representa a posição profundidade relativa dentro do núcleo que as imagens das secções transversais (linha de cima) foram tomadas no.

barra de escala = 10 mm

.

Em estudos futuros pretendemos quantificar a percentagem de NPs presentes no núcleo por tridimensional de raio-X de imagem tomográfica de células inteiras com suficiente tamanho da amostragem e resolução [24] e determinar a contribuição de NPs nucleares em eventos de sinalização celular.

C225-NP é específico para células tumorais que expressam EGFR e pré-tratamento com o anticorpo C225 anula matar células tumorais C225-NP-mediada

Nós usamos a microscopia de campo escuro reflectância para caracterizar a especificidade das interações C225-NP e a viabilidade da detecção óptica de células de câncer de pulmão. imagens de reflectância-campo escuro mostrou alta concentração e interiorização do C225-NP em HCC827 células após o tratamento 24 horas (Figura 8). Em contraste, pouco ou nenhuma absorção foi observada em HCC827 células tratadas com IgG-NP. Em células H520, nenhuma diferença na ligação e absorção de NP foi observada entre as células tratadas com C225-NP e NP-IgG (Figura 8).

HCC827 e células H520 semeadas em lâminas de câmaras foram tratados com IgG-NP ou C225- NP (0,2 × 10

10 partículas). células não tratadas serviram como controle. Ao fim de 24 horas após as células de tratamento foram lavadas, fixadas e as imagens foram tiradas sob microscopia de campo escuro. barra de escala é de 50 micron. Ligação selectiva e absorção de C225-NP, mas não IgG-NP foi observada em HCC827 células. Em H520 células não houve captação de ligação e de C225-NP, quando comparado com IgG-NP.

Para determinar a especificidade do C225-NP ligação e absorção, foram realizados experimentos de bloqueio. HCC827 células foram pré-tratadas com um excesso de anticorpo livre do clone 225 antes do tratamento com IgG-NP ou NP-C225. reflectância-campo escuro demonstrou que a ligação e internalização do C225-NP foi especificamente bloqueada na presença do anticorpo do clone livre 225, em comparação com células que não foram pré-tratados com o anticorpo (Figura 9a). Nós ainda determinado se o bloqueio do receptor EGF afeta citotoxicidade induzida C225-NP. A atenuação da citotoxicidade mediada por C225-NP foi observada na presença de anticorpo livre do clone 225 que foi acompanhada pela diminuição acentuada na C225-NP mediada por apoptose e autofagia (Figura 9b, 9c). Resultados semelhantes também foram obtidos quando as células H1299 foram tratadas com NP-C225 na presença do clone 225 de anticorpo (Figura S4 A-C). Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram que a NP-C225 interage selectivamente com células NSCLC que expressam EGFR, e produzir molecular específica aumentada efeito terapêutico em células NSCLC que expressam EGFR.

(a) A coluna da direita mostra as imagens de células HCC827 pré-tratada com o anticorpo C225 (2 ug /ml) durante 15 minutos antes da incubação com IgG quer-NP (linha do meio) ou C225-NP (linha inferior). Células mostrados na coluna da esquerda não foram tratados com os anticorpos C225 livres. As lâminas foram lavadas, fixadas e fotografada usando microscopia de campo escuro. A ligação e absorção de C225-NP foi completamente inibida na presença do anticorpo C225. Em células tratadas com IgG-NP anticorpo C225 não teve nenhum efeito. barra de escala é de 50 micron. (B) efeito de inibição sobre a citotoxicidade de C225-NP por pré-tratamento com o anticorpo C225 livre. Após o tratamento com /sem anticorpo C225 (0,065 ug /ml) durante 6 horas, as células foram tratadas com quer não conjugado NP (ouro-ferro: AuFe), IgG-NP ou NP-C225 durante mais 66 horas. O número de células viáveis ​​foi contado como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados apresentados são as médias ± S.D. de três experiências independentes. * Valor de P 0,05 vs AuFe sozinho, anticorpo C225 sozinho, IgG-NP ou anticorpo C225 C225 acrescido-NP. (C) efeitos de inibição da apoptose induzida por C225-NP e autofagia por pré-tratamento com o anticorpo C225. As proteínas celulares foram lisadas após o tratamento com NP-C225 (0,6 × 10

10 partículas) durante 66 horas na presença ou ausência de anticorpo C225 livre (0,065 ug /mL). As proteínas foram separadas por 7,5% ou 15% SDS-PAGE e imunotransferidas com anticorpos anti-PARP e anti-LC3. O anticorpo anti-β actina foi utilizado como um controlo para a carga de proteína e de transferência. As intensidades das bandas de a quantidade de LC3-II foram quantificados por um software ImageJ (National Institutes of Health). activação da apoptose e autofagia C225-NP-mediada, como indicado por clivagem de Capase-3, PARP e LC3-II, respectivamente, foi marcadamente abolida na presença do anticorpo C225 livre. Todas as imagens de campo escuro foram adquiridos usando Leica, microscópio DM6000 equipado com 20 × de campo escuro objetiva e Xe-lâmpada de iluminação de luz branca.

Densidade de 225 anticorpo ligado a NP é importante para o 225-NP matar células de tumor mediado por

Para investigar a dependência da eficácia terapêutica de NPs na densidade de anticorpos Clone 225 sobre a superfície do NP nos co-conjugado do clone 225 e o anticorpo IgG não específica em proporções de 01:00, 1:01, 1:03, 1:10, 1:40 e 0:01. A quantidade média total de anticorpos por NP foi mantido o mesmo, por conseguinte, a densidade de anticorpos Clone 225 decresce gradualmente à medida da quantidade relativa da IgG não específica aumentada. Por exemplo, o rácio de 01:00 correspondeu aos conjugados C225 originais-NP que tinha a mais elevada densidade de anticorpos do clone 225, enquanto a proporção 00:01 correspondeu a NPs com anticorpos IgG não específicas apenas. A densidade relativa de anticorpos sobre a superfície de NPs foi confirmada utilizando um ensaio fluorescente (ver Materiais e Métodos).

O tratamento com C225-PN (01:00 proporção) significativamente (

P 0,05) redução da viabilidade das células e HCC827 H1299 expressa-EGFR. Contudo, alterando a proporção do anticorpo C225 para controlar anticorpo 01:00 – 01:40 resultou na atenuação da citotoxicidade em ambas as linhas celulares (Figura 10a). Capacidade para inibir a expressão pEGFR e induzir autofagia também foi reduzida em células HCC827 e H1299 com decréscimo na quantidade relativa de anticorpos Clone 225 sobre a superfície de NP (Figura 10b, c). A redução observada na eficácia terapêutica do complexo NP-anticorpo com a diminuição da densidade do anticorpo terapêutico na superfície de NP pode ser atribuída a alterações na multivalência do complexo anticorpo /NP. relatos na literatura anteriores demonstraram que o aumento da valência de uma macromolécula pode resultar num aumento da afinidade de ligação a moléculas alvo [25], [26]. Este efeito de aumento multivalente foi explorada para aumentar a eficácia da inibição da toxina através da síntese de inibidores polivalentes [27], [28]. Mostrou-se também que uma densidade óptima de segmentação ligantes na superfície dos polímeros pode aumentar a internalização de ligandos em células [29]. As células H520 apresentaram pouca ou nenhuma citotoxicidade quando tratados com NPs com razões variáveis ​​de anticorpos (dados não mostrados)

(a) a inibição do crescimento celular em resposta ao tratamento com NP que tinha variando proporção (01:00;. 1 :1; 01:03; 01:10; 01:40; 00:01) do C225 e IgG co-conjugada à superfície do NP. As células (HCC827, H1299 e H520) foram tratados com PN (0,6 × 10

10 partículas) durante 72 horas. O número de células viáveis ​​foi contado como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados apresentados são as médias ± S.D. de três experiências independentes. * Valor de P 0,05 para C225-NP (01:00) vs NP Com 01:01 – 01:40 e 00:01 NP em células HCC827 e H1299. As células H520 não mostrou qualquer efeito inibidor quando tratados com NP de de diferentes proporções. (B) O número de pontos GFP-LC3 induzidas por C225-NP (01:00) -Tratamento em HCC827 e as células H1299 diminuiu com a variação do índice de anticorpos C225:IgG. Os resultados apresentados são as médias ± S.D. de três experiências independentes. * Valor de P 0,05 para C225-NP (01:00) vs 1:01 – 01:40 e 00:01 NP em células HCC827 e H1299. (C) C225-NP (01:00) a redução mediada no EGFR fosforilada e p44 /expressão 42MAPK foi revogada em células HCC827 e H1299 quando tratados com NP do de 01:01 e 01:40 ratio.

Estes resultados demonstram que os PN produziu o maior efeito terapêutico quando eles foram revestidas apenas com o anticorpo C225. Substituindo o número de anticorpo C225 com anticorpo de controlo não específico na superfície de NP resultou em reduzida actividade anti-cancro. Além disso, este estudo também demonstra a especificidade da morte de células tumorais 225-NP-mediada.

Em conclusão, foi demonstrado que alvo EGFR-C225 NPs são tomados selectivamente pelas células NSCLC que expressam EGFR e produzido antitumoral melhorada actividade induzindo tanto a apoptose e autofagia. A actividade de morte de células de tumor melhorada produzida por C225-NP é atribuído às propriedades únicas conferidas pela conjugação do anticorpo do clone 225 com AuFe NP. Para nosso conhecimento demonstramos pela primeira vez que a conjugação dos nanomateriais plasmonic com produtos biológicos, tais como Clone 225 resulta em propriedades antitumorais sinérgicos acompanhados por indução de apoptose e autofagia. Esta pesquisa abre um novo paradigma no desenvolvimento de agentes terapêuticos que é direcionado para a capacidade de controlar o arranjo nanoescala de múltiplos Abs na superfície da partícula para a segmentação melhorada e terapia.

estudos pré-clínicos recentes mostraram que a combinação de EGFR-alvo de três experiências independentes. de três experiências independentes.