Abstract

Apesar dos avanços recentes em terapias-alvo, os pacientes com adenocarcinoma do pâncreas continuam a ter uma pior sobrevida destacando a urgência de identificar novos alvos terapêuticos. As nossas investigações anteriores têm implicado receptor de quimiocinas CXCR4 e seu CXCL12 ligando selectivo na patogênese e progressão da neoplasia intra-epitelial de pâncreas e câncer pancreático invasivo; Assim, o CXCR4 é um alvo promissor para a supressão do crescimento do cancro do pâncreas. Aqui, nós combinamos

in silico

modelagem estrutural de CXCR4 para triagem de candidatos compostos anti-CXCR4 com

in vitro

ensaios de linhas celulares e identificou NSC56612 a partir de (NCI) Abrir Chemical Repositório do Instituto Nacional do Câncer Colecção como um inibidor de CXCR4 activado. Em seguida, identificou-se que NSC56612 é estruturalmente semelhante ao estabelecido cloroquina medicamentos contra a malária e hidroxicloroquina. Nós avaliamos os compostos em células de câncer de pâncreas

in vitro Comprar e observado antagonismo específico de sinalização mediada pelo CXCR4 e proliferação celular. Recentes

in vivo

aplicações terapêuticas de cloroquina em modelos pancreáticas de rato câncer demonstraram diminuição do crescimento do tumor e sobrevivência melhorada. Nossos resultados, assim, proporcionar um alvo molecular e base para uma avaliação mais aprofundada da cloroquina e hidroxicloroquina em câncer pancreático. Historicamente segura em humanos, cloroquina e hidroxicloroquina parecem ser agentes promissores para com segurança e eficácia alvo CXCR4 em pacientes com câncer pancreático

Citation:. Kim J, Yip MLR, Shen X, Li H, Hsin L-YC, Labarge S, et al. (2012) Identificação de antimaláricos compostos como novos antagonistas de quimiocina receptor CXCR4 em células de cancro do pâncreas. PLoS ONE 7 (2): e31004. doi: 10.1371 /journal.pone.0031004

editor: Jingwu Xie, da Escola de Medicina da Universidade de Indiana, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de junho de 2011; Aceito: 30 de dezembro de 2011; Publicação: 03 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Instituto Nacional do Câncer [P30 CA33572 para JK, MLRY, e NV]; os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) [NIH CA134637 a JK]; e da Sociedade Americana de Câncer (ACS) [RSG-11-070-01-TBE para JK]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do conteúdo manuscript.The são da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam as opiniões oficiais do Instituto Nacional do Câncer, NIH ou ACS.

Conflito de interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pâncreas do duto é uma doença uniformemente fatal que é frequentemente diagnosticado com metástases à distância no momento. do quadro clínico inicial. precoce da doença não reconhecida e um fenótipo altamente invasivo são fatores principais para o mau prognóstico associado com câncer de pâncreas e destacar a urgência de identificar alvos moleculares para a progressão da doença. Recentemente, as interações entre quimiocinas e seus receptores correspondentes foram examinados na patogênese, progressão e metástase de câncer de pâncreas [1], [2], [3]. Estes estudos sugerem que os antagonistas de quimiocina CXCR4 receptor pode anular o fenótipo invasivo do cancro pancreático [4], [5], [6]. Apesar da crescente evidência para a importância de CXCR4 em câncer de pâncreas e outros tumores malignos, antagonistas de CXCR4 que são seguros e eficazes para uso clínico permanecem falta.

Quimiocinas CXCL12 (também conhecido como fator-1α derivado do estroma, SDF- 1α) ativa várias vias efetoras a jusante após a ligação do seu receptor CXCR4 [7]. A interacção CXCL12-CXCR4 regula a quimiotaxia, adesão e secreção de factores de crescimento entre muitas das suas funções conhecidas [8]. Pouco depois de CXCR4 foi identificado como um co-receptor de HIV-1 e HIV-2 [9], [10], a molécula pequena bicyclam AMD3100 foi identificado como um antagonista do CXCR4 específica [5]. AMD3100 tem sido amplamente utilizada para investigar e interrogar interações CXCL12-CXCR4 [7]. Embora AMD3100 permanece em utilização clínica para a mobilização de células estaminais, a sua administração crónica tem sido associada com a cardiotoxicidade significativa [11]. Interessantemente, os estudos recentes têm demonstrado que, em adição ao seu papel como um antagonista para a sinalização CXCR4, AMD3100, paradoxalmente, se liga e activa o receptor de quimiocina CXCR7 [12], [13].

Uma vez que os dados actuais sugerem que pode não ser AMD3100 segura ou eficaz como antagonista anti-CXCR4 para aplicações terapêuticas em cancro do pâncreas, antagonistas específicos que devem ser identificados para este fim. Nesta investigação interdisciplinar, combinamos

in silico

modelagem da estrutura CXCR4 com a triagem de alto rendimento e

in vitro

ensaios em linhas celulares de cancro pancreático para identificar novos antagonistas para a proliferação celular mediada por CXCR4 em células de câncer pancreático. Nosso estudo mostra que o seguro e eficaz anti-malárico drogas cloroquina e hidroxicloroquina são antagonistas CXCR4 eficazes que suprimem a proliferação de células do cancro do pâncreas.

Resultados

Modelagem Computacional de CXCR4

A conjunto estrutural do receptor CXCR4 do tipo selvagem foi previsto usando o

ab initio

método de estrutura de previsão (MembStruk4.3) [14], [15]. Comparou-se a ligação de compostos mono e bicyclam aos nossos estruturas previstas com os dados de mutagénese para validar os nossos previsões computacionais [16]. Nossas previsões foram submetidos a avaliação da estrutura da proteína competição (GPCRDOCK2010) antes da caracterização da estrutura cristalina de CXCR4 [17]. Uma comparação detalhada da estrutura prevista com a estrutura cristalina foi verificada a precisão da nossa modelagem e tem sido publicado anteriormente (Figura 1) [18].

A pequena molécula designada “1t” é colocado em ligação previsto local. O desvio quadrático médio das estruturas previstos e cristal é de 2,5 Å, o que demonstra estreito alinhamento do nosso modelo previsto com a estrutura cristalina estabelecida. Por conseguinte, o local previsto de o sítio de ligação do pequeno “1t” molécula combinada com a estrutura de cristal. A molécula pequena “1t” é descrito como pequenas esferas.

Foi realizada triagem ligando virtual (VLS) de (NCI) Repositório Colecção Abrir Química do Instituto Nacional do Câncer para 3 conformações previstos diferentes de CXCR4. Em seguida, as moléculas pequenas candidatas foram filtrados com base na sua proximidade com resíduos que desempenham um papel importante na antagonista de ligação, ou seja: D92 (TM2), H121 (TM3), D171 (TM4), E262 (TM6) e E288 (TM7) [ ,,,0],19], [20]. Cerca de 90% das pequenas moléculas foram excluídos nesta etapa.

energias de ligação de pequenas moléculas foram então calculados e os 10% das pequenas moléculas com as mais baixas energias de ligação foram retidos. As estruturas químicas no top 10% dos acessos variou de estruturas de anel multi-aromáticos para estruturas com cadeias alquilo mais longos. O principal critério para selecção adicional foi a interacção das moléculas candidatas com os resíduos que se sabe serem importantes para a ligação antagonista [16]. Estas moléculas foram então examinados para contatos de proteína-ligante e 50 pequenas moléculas candidatos foram selecionados de aproximadamente 350.000 moléculas para o teste experimental.

NSC56612 and Related compostos inibem CXCR4-Mediated Sinalização

Dos 50 candidatos compostos de VLS, fomos capazes de obter 32 do NCI para o teste experimental. O rastreio dos compostos 32 foi realizada utilizando o ensaio de Tango que testa a inibição do recrutamento mediada por CXCL12 de β-arrestina para o terminal carboxi de CXCR4. Este ensaio identificado um composto hit que suprimiu recrutamento β-arrestina e as estruturas químicas deste composto NSC56612 é mostrada na Figura 2. Foi realizada mais uma gama de ligação ao ligando directa, o fluxo de cálcio mensageiro secundário, e ensaios de quimiotaxia a jusante mediadas pelo CXCR4 /eixo CXCL12 para verificar que estes compostos são dirigidas diretamente CXCR4. NSC56612 foi usado como um modelo para identificar compostos com estruturas químicas semelhantes. Isto conduziu à identificação de três outros compostos que são agentes anti-maláricos:. Cloroquina, hidroxicloroquina, e quinacrina (Figura 2)

(A) NCI NSC56612 composto, (B) cloroquina, (C) hidroxicloroquina, e (D) quinacrine.

Figura 3A mostra a curva de dependência da concentração da inibição direta da fluorescente etiquetado CXCL12 ligação por NSC56612, cloroquina, hidroxicloroquina, e quinacrina. experiências de ligação competitiva demonstraram que estes compostos inibem a ligação directa de CXCL12 a CXCR4 com baixa afinidade de micro-molar. O ensaio em que β-arrestina-2 mediada por recrutamento CXCL12 é avaliada também mostrou inibição por estes três compostos com baixa eficácia de micro-molar (Figura 3B). A Figura 3B mostra também inibição por AMD3100, um antagonista de CXCR4.

(A) Concentração inibição dependente da CXCL12 fluorescente etiquetado (60 Nm) de ligação ao receptor CXCR4 para encaixá-marcado em células HEK293 por NSC56612, cloroquina e hidroxicloroquina. As meias máximas concentrações eficazes (CE

50), os valores na qual a máxima CXCL12-CXCR4 ligação é inibida em 50%, para AMD3100, NSC56612, cloroquina e hidroxicloroquina são 60,0 nM, 5,5 uM, 6,1 uM e 9,8 uM , respectivamente. Estas curvas são dados representativos de 3 experiências realizadas em duplicado. (B) inibição dependente da dose da actividade de beta-lactamase induzida por CXCL12 β-arrestina-2-mediadas, em ensaio de Tango engenharia por pré-tratamento com a AMD 3100, NSC56612, cloroquina, hidroxicloroquina e. dados de emissão em 460/530 foi definida como a razão de resposta. Estas curvas são dados representativos de 3 experiências realizadas em duplicado. (C) Dose-dependente inibição do fluxo de cálcio intracelular induzida por CXCL12 pela AMD 3100, NSC56612, cloroquina, hidroxicloroquina. O influxo de cálcio mediada por receptor CXCR4 foi medido a 1 uM de AMD3100 e duas concentrações diferentes (100 pM e 200 pM) de três compostos nas células Molt-4. AMD 3100, NSC56612, cloroquina e hidroxicloroquina mostrou 50% de inibição a 60 do influxo de cálcio induzida por CXCL12. Estas curvas são dados representativos de 3 experiências realizadas em duplicado. (D) Inibição da migração das células de Jurkat, induzida por CXCL12 em por AMD3100 (100 nM), NSC56612 (100 uM), a cloroquina (100 uM), e a hidroxicloroquina (100 uM). Todos os quatro compostos apresentaram 40% a 50% de redução na migração de células induzida por CXCL12. A figura mostra os dados de 4 experiências realizadas em duplicado. As barras de erro representam ± um SD. Teste t de Student:. * 0,05 e ** 0,01

o fluxo de cálcio, um mensageiro secundário para a activação mediada pela CXCL12 de CXCR4, mede a activação dos receptores CXCR4. O fluxo de cálcio mediada por CXCL12 foi medido em duas concentrações diferentes dos quatro compostos, designadamente 100 uM e 200 uM. Como se pode ver na Figura 3C, NSC56612, cloroquina, hidroxicloroquina e mostrou 50% de inibição de 60% do fluxo de cálcio induzida por CXCL12, enquanto quinacrina mostraram% de inibição inferior a 10 (dados não mostrados). Mediu-se o grau de inibição por estes compostos para a quimiotaxia, um efeito a jusante em células que expressam o CXCR4. A figura 3D mostra o efeito dos compostos no ensaios de quimiotaxia, em que a inibição da migração celular induzida por CXCL12 é medido. Para avaliar a concentração de compostos necessária para a inibição de quimiotaxia, foi realizada uma inibição dependente da dose da quimiotaxia do composto de chumbo NSC56612, como mostrado na Figura 4. Todos os quatro compostos apresentaram 40% a 50% de redução na migração de células induzida por CXCL12. Quinacrina mostrou eficácia substancial para inibir a quimiotaxia (dados não mostrados), ao mesmo tempo que tinham pouco ou nenhum efeito sobre o ensaio de fluxo de cálcio. Desde quinacrina não suprimiu o fluxo de cálcio mediada por CXCL12, omitiu-se a partir de uma análise mais aprofundada nas linhas celulares de cancro pancreático. Os resultados destes ensaios mostram que a cloroquina e hidroxicloroquina inibir directamente a sinalização de CXCR4.

As células foram plaqueadas em placas de cultura providas de membranas de poro de 8 uM para criar câmaras de cultura de células superior e inferior. As células foram plaqueadas na câmara superior e CXCL12 (30 nM) sozinho ou com a adição de NSC56612, cloroquina, hidroxicloroquina ou foi colocada na câmara inferior. O número de células que migraram através da membrana em 5 horas foi contado. Os dados mostrados são de 4 experiências realizadas em duplicado. Alterações relativas na migração de células são representadas com a condição de controlo que serve como 100% de migração. As barras de erro representam ± um SD.

A cloroquina e hidroxicloroquina Inibição CXCL12-Mediated ERK fosforilação

Em um inquérito anterior, descobrimos que CXCL12 induziu um aumento da ERK fosforilação [21]. Embora a exposição a CXCL12 também activada a via PI-3K /AKT, o grau em que a fosforilação de AKT foi alterada era muito menor do que a fosforilação de ERK. Portanto, nós nos concentramos nossa investigação neste estudo sobre a ativação de ERK. Em primeiro lugar, verificou-se que CXCL12 induz um aumento em fosfo-ERK em linhas celulares do cancro do pâncreas (Figura 5A). Em seguida, nós demonstramos que a cloroquina e hidroxicloroquina exercer efeitos inibidores dependentes da dose sobre a fosforilação de ERK mediada por CXCL12 em PANC-1 e AsPC-1, células (Figura 5B). Finalmente, mostra a análise quantitativa da inibição na fosfo-ERK na Figura 5C.

(A) Imunocoloração para fosfo-ERK foi realizada para PANC-1, HS-766T, AsPC-1, e MIAPaCa- 2 lisados ​​celulares. As células foram pré-tratadas com cloroquina ou hidroxicloroquina (0,1 uM) durante 30 minutos, após o que as células foram expostas a CXCL12 (200 ng /ml) durante 20 minutos. Um anticorpo para total de ERK1 /2 foi utilizado como um controlo de carga. Os aumentos mediados por CXCL12 em fosfo-ERK foram eficazmente revogada com qualquer cloroquina ou hidroxicloroquina. (B) pré-tratamento da PANC-1 e células AsPC-1 com cloroquina e hidroxicloroquina (0,1-10? M) durante 5 minutos, seguido por exposição a CXCL12 (200 ng /ml) demonstrar os efeitos dependentes da dose do tratamento com medicamentos na ERK mediada por CXCL12 fosforilação. (C) As transferências de Western foram digitalizados e quantificados usando o AlphaImager Tm3400 (Alpha Innotech). Dobre mudanças para fosfo-ERK em comparação com foram calculados como expressão relativa controles não tratados, que foi normalizado para intensidades de banda de proteína de ERK total. Os dados mostram a média de experiências em triplicado, com

p

-Valores. 0,05 considerado estatisticamente significativo

A cloroquina e hidroxicloroquina desencadear a apoptose e inibir CXCL12-Mediated Proliferação e Anti-apoptose

, cloroquina e hidroxicloroquina citotoxicidade em linhas celulares de cancro pancreático foi avaliada e os valores de IC50 foram determinados (Figura 6). Usando estes valores, avaliou-se a sinalização de CXCR4 em um ensaio de proliferação celular. Nós anteriormente observados aumentos CXCR4 mediada por proliferação celular em células de cancro pancreático [21]. Portanto, cloroquina e hidroxicloroquina foram avaliadas para o antagonismo da proliferação celular mediada pelo CXCR4; e observou-se que ambos os agentes efectivamente antagonizou a proliferação celular mediada pelo CXCR4 em PANC-1, HS-766T, e células MiaPaCa-2 (Figura 7). Uma vez que o aumento da proliferação não foi observada em células AsPC-1 após exposição a CXCL12, estas células não foram avaliados com cloroquina e hidroxicloroquina neste ensaio. Os nossos resultados são consistentes com relatórios publicados que mostram que nem todas as linhas de células de cancro pancreático responder a CXCL12 com o aumento da proliferação [2]; o mecanismo responsável por este ainda não foi elucidado. Tanto a cloroquina e hidroxicloroquina mostrou redução na fosfo-ERK, na presença de CXCL12, com a concentração total de ERK ser afectada. Estes resultados mostram que a cloroquina e hidroxicloroquina inibir especificamente a sinalização mediada pelo CXCR4 para suprimir a proliferação celular em células de cancro do pâncreas.

AsPC-1, HS-766T, MiaPaCa-2, e as células PANC-1 foram tratados com uma dose gama de cloroquina ou hidroxicloroquina (0,01-10? M) em 72 horas para determinar a concentração máxima inibitória de metade (valores de IC50) destes compostos. células ASPC-1 e HS-766T tinham valores IC50 semelhantes para cloroquina e hidroxicloroquina, enquanto MiaPaCa-2 e PANC-1 células tinham valores de IC50 mais elevados para hydroxychloroquine que a cloroquina.

(A) PANC-1 , (B) HS-766T, e células (C) MiaPaCa-2 foram pré-tratadas com cloroquina ou hidroxicloroquina (0,1 uM) durante 30 minutos, após o que as células foram expostas a CXCL12 (200 ng /ml) durante 72 horas. (D) O pré-tratamento com cloroquina e hidroxicloroquina também desencadeou a apoptose e diminuição da apoptose mediada por CXCL12 em células PANC-1. Os dados mostram a média de experiências em triplicado.

P

-Valores. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Uma vez que o mecanismo de mudanças na proliferação celular não estava claro, nós também avaliou a apoptose após a exposição à cloroquina e hidroxicloroquina. Em primeiro lugar, os nossos resultados sugerem que promove a CXCL12 anti-apoptose em células de cancro pancreático. Estes resultados são consistentes com relatórios publicados anteriormente para o eixo CXCL12 /CXCR4 [22], [23]. Em segundo lugar, nossos resultados indicam que a cloroquina e hidroxicloroquina revogar mediada por CXCL12 anti-apoptose (Figura 7D), em que o pré-tratamento com cloroquina ou hidroxicloroquina aumento da apoptose em células PANC-1.

Discussão

Usando um abordagem interdisciplinar começando com modelagem computacional da estrutura do receptor CXCR4 para

in vitro

análise da sinalização CXCR4, o nosso estudo determinou que, cloroquina e hidroxicloroquina agem como inibidores CXCR4 novos em células de câncer de pâncreas. Nós demonstramos que estes agentes clinicamente seguras e eficazes de anti-malária inibir especificamente a ligação de CXCL12 para inibir a CXCR4 e CXCL12-CXCR4 vias efectoras a jusante que medeiam o fluxo de cálcio, o recrutamento de SS-arrestina-2 e a migração celular. Em linhas celulares de cancro do pâncreas, determinámos que a cloroquina e hidroxicloroquina bloco de sinalização mediada por CXCL12 através da via de ERK com efeitos a jusante sobre tanto a apoptose e a proliferação celular. Desde CXCR4 parece ter um papel importante na patogénese e progressão do cancro pancreático [1], [2], [3], o nosso trabalho tem implicações clínicas importantes na identificação de uma nova utilização terapêutica para estes agentes anti-malária estabelecidos.

Nossos estudos iniciais necessários à caracterização precisa da estrutura da CXCR4. Usando métodos computacionais previamente desenvolvidos por nós, previmos a estrutura tridimensional de CXCR4 e os locais de ligação de antagonistas de moléculas pequenas, tais como os compostos conhecidos Cyclam [16], [24], [25]. Nossas previsões estruturais foram realizadas antes da publicação da estrutura cristalina de CXCR4 [17]. posterior comparação das estruturas previstas para o cristal mostrou uma excelente concordância do desvio quadrático médio em coordenadas do ligante de 2,2 Å. Estes resultados foram encorajadores para aprofundar nosso estudo à procura de pequenas moléculas antagonistas CXCR4 em células de câncer de pâncreas. Com as conformações previstos de CXCR4, usamos as bibliotecas de compostos para identificar acertos antagonista candidato estabelecida. Limitando os hits ao topo 32 candidatos, foram realizados testes de rastreio de alto rendimento, que estreitou ainda mais a nossa lista de candidatos para 3 compostos. Estes estudos iniciais nos levou a composto NCI NSC56612. Exploração da estrutura química de NSC56612 para compostos semelhantes através de bases de dados públicas e comerciais revelou que NSC56612 homologia estrutural compartilhada à cloroquina, hidroxicloroquina, e quinacrina; mas apenas cloroquina e hidroxicloroquina passou todos os nossos testes de rastreio. A eficácia díspar de quinacrine poderia ser secundária à heterogeneidade dos efectores a jusante (

por exemplo.

, Fosfolipase C ou G-proteínas) para diferentes funções celulares, o que pode resultar numa resposta variável entre as células. Outros estudos já demonstraram eficácia diferencial de ligandos de receptores acoplados a proteína G discretas para ensaios diferentes [26], [27]. Para identificar os sítios de ligação putativos destes compostos que ancorados cloroquina e hidroxicloroquina à estrutura de cristal de CXCR4 (Figura 8) e identificaram que os grupos amina terciários nestes compostos fazer ligações de hidrogénio com D97 em TM2 e E32 em que o terminal amino do receptor ; e aromático resíduos Y45, W94, Y255 e H113 mostra favorável van der Waals com o sistema de anel aromático nestes compostos.

hélices verdes, TM1, 2, 3, 5, 6 e 7 são mostrados. Após a ligação, tanto cloroquina e hidroxicloroquina interagir favoravelmente com os resíduos indicados (E32, N37, Y45, W94, D97, H113, I185, D187, Y255, E288) mostrada na varas. Estes resíduos estão dentro de 5 Å do composto ligado. No entanto, os resíduos de aminoácidos no local de ligação do CXCR4 são orientados ligeiramente diferente, dependendo se cloroquina ou hidroxicloroquina ligamento. As orientações relativas dos resíduos de aminoácidos que interagem com CXCR4, cloroquina e hidroxicloroquina são mostrados como varas verdes e ciano, respectivamente.

Uma vez que o fenótipo invasivo associado com o CXCR4 é uma manifestação de vias de sinalização-driven CXCL12 , testamos cloroquina e hidroxicloroquina

in vitro

. Nós escolhemos para avaliar a via de sinalização MAPK, porque nós já demonstraram o seu papel na mediação de crescimento e proliferação de neoplasia intra-epitelial do pâncreas e células de câncer pancreático [21]. Em nossos estudos atuais observou-se inibição eficaz da fosforilação ERK-driven CXCL12 e inibição da proliferação mediada por CXCL12

in vitro

.

Existe evidência clínica para os efeitos anti-câncer de cloroquina e hidroxicloroquina . Em um ensaio clínico para o glioblastoma multiforme, a cloroquina foi administrado juntamente com quimioterapia convencional como terapia adjuvante em pacientes submetidos a ressecção cirúrgica para o glioblastoma multiforme. Os pacientes que receberam a experiência cloroquina melhorou a sobrevida em comparação com pacientes que receberam apenas quimioterapia [28]. Apesar de não identificar CXCR4 como um alvo potencial, Rubin

et al.

, Já tinha demonstrado que CXCR4 antagonismo inibiu o crescimento do glioblastoma multiforme, sugerindo que CXCR4 foi um alvo apropriado para a terapia glioblastoma [29]. Além disso, um ensaio clínico para câncer colorretal metastático incorporou hydroxychloroquine juntamente com quimioterapia citotóxica padrão [30]. O nosso grupo e outros examinaram expressão CXCR4 em câncer colorretal e observaram um papel potencial para CXCR4 na progressão do cancro colorectal [4], [31], [32]. Nosso estudo demonstra que a cloroquina e hidroxicloroquina são antagonistas de CXCR4 e, portanto, proporciona uma base molecular para o uso de cloroquina em pacientes com câncer colorretal metastático. Uma vez que este ensaio clínico está em curso, os resultados têm ainda a amadurecer. Cloroquina também foi recentemente testado

in vivo

em um modelo de cancro pancreático murino demonstrando efeitos tumoricidas com melhora da sobrevida [33]. No entanto, estes investigadores usaram cloroquina sem uma compreensão de seus efeitos sobre o CXCR4.

Apesar de cloroquina e hidroxicloroquina foram recentemente usados ​​para aplicações anti-câncer, eles foram originalmente formuladas como agentes anti-malária. Estes fármacos foram formulados porque Atabrine, o primeiro composto anti-malárico sintético, tinha efeitos secundários indesejáveis ​​de manchar a pele e olhos [34]. Ambos cloroquina e hidroxicloroquina são bases fracas que têm como alvo as células sanguíneas que estão infectadas por malária [35]. Estas drogas trabalham preferencialmente difusão em vacúolo do parasita onde a hemoglobina é dividido [36]. No vacúolo ácida, tornam-se protonado e presa [36]. Dentro do vacúolo, que inibem a quebra do heme, o produto secundário de degradação parasitária de hemoglobina [36]. A acumulação de heme torna tóxico e leva à lise das células e morte do parasita [36]. Aparte destas indicações anti-maláricos, o mecanismo para os efeitos anti-neoplásicas de cloroquina e hidroxicloroquina foram examinados [37]. A cloroquina parece inibir autofagia e induzir a apoptose dependente de p53 [38]; e pode também aumentar os efeitos da quimioterapia ou radioterapia [39].

Em conclusão, utilizando uma abordagem interdisciplinar identificamos antagonistas CXCR4 novos e mostraram que a cloroquina e hidroxicloroquina inibir a sinalização CXCL12-CXCR4. Dado que os antagonistas eficazes para CXCR4 estão faltando e que novas terapias ainda têm de melhorar a sobrevivência para além de 1 ano para pacientes com câncer metastático do pâncreas [25], [40], [41], os nossos resultados têm implicações clínicas importantes. Nossos resultados do estudo fornecem uma base científica para o uso de cloroquina ou hidroxicloroquina em um julgamento câncer de pâncreas; e uma vez que os perfis de segurança estão bem estabelecidas para estes medicamentos, um ensaio clínico pode ser rapidamente aplicada para pacientes com câncer pancreático.

Materiais e Métodos

Previsão da Estrutura CXCR4

MembStruk4.3, o

ab initio

método de estrutura de previsão, foi usado para gerar um conjunto de tipo selvagem estruturas CXCR4 humanos [14], [15]. As regiões de trans-membrana (TM) do CXCR4 foram previstas usando o método Tm2ndS com alinhamento múltiplo de sequências de humano, rato, rato e CXC e CC família de receptores de quimiocinas (Tabela 1) [14]. Nós otimizamos a rotação relativa e tradução das sete hélices TM e as torções helicoidais com início a partir de um pacote montado de hélices canônicos construídas a partir das previsões TM. Canônicas hélices destros foram construídos para cada hélice e seus eixos helicoidais foram orientados no espaço de acordo com o mapa de densidade de elétrons 7.5 de baixa resolução da rodopsina sapo [42].

Esta 7,5 Å mapa de densidade de electrões desde as posições e orientações relativas dos eixos helicoidais que serviram para optimizar o feixe helicoidal. As orientações relativas dos traducionais 7 hélices foram optimizadas através do alinhamento do máximo hidrofóbico determinada para cada hélice de um avião. A orientação rotativa foi optimizada usando uma combinação de momentos hidrofóbicos e técnicas moleculares dinâmicas. Os dados da estrutura cristalina de CXCR4 [17], o qual foi caracterizado apenas recentemente, não foi utilizada para estas predições.

derivada de um conjunto de baixa energia conformações barril Tm para CXCR4 e seus mutantes constitutivamente activas [43] . As conformações dos receptores foram seleccionados para terem o número máximo de ligações de hidrogénio inter-helicoidais e o maior valor de energia total da conformação da proteína numa bicamada lipídica. Três conformações de baixa energia potencial foram selecionados para CXCR4 que teve diferentes orientações de TM3, TM5 e TM7. TM5 tinha 3 conformações diferentes: 2 tinham diferentes orientações do Y219 resíduo

5,58, o que corresponde aos 2 diferentes orientações de Y223

5,58 em estruturas cristalinas rodopsina e opsina [44], [45]. TM7 tinha 2 orientações helicoidais diferentes, onde a posição do E288

7,39 foi diferente.

Docking de AMD3100 e Ligand Virtual Screening

O local de ligação previsto dos derivados mono e bicyclam de AMD3100 em CXCR4 foi validado utilizando os dados de mutagénese dirigida estabelecidos [19], [20]. Este sítio de ligação prevista foi depois utilizado para efectuar o rastreio de ligando virtual (VLS) para identificar novos antagonistas de visitas de CXCR4. Do National Cancer Institute (NCI) Abrir Chemical Repositório Colecção [46], que é composto de cerca de 300.000 compostos, foi consultado usando o módulo Maestro LigPrep (Schrödinger; San Diego, CA). Conformações múltiplas de ligantes candidatos foram então ancorado no sítio de ligação previsto de CXCR4 usando Glide SP (Schrödinger) escalando o van der Waals raios para 0,5 e parcial taxa de corte para 0,15. Os pontos de corte de energia de Coulomb e van der Waals combinadas foram, em seguida, aumentada para 100 kcal /mol. As moléculas carregadas foram eliminados e as moléculas neutras que foram considerados melhores candidatos foram selecionados para uma investigação mais aprofundada. As conformações ligando entrado por moléculas neutras foram então filtradas com base na área de superfície oculta, em que os ligandos que foram 80% e enterrado com base nas suas distâncias ao ácido resíduos D171, D262, E288 e foram selecionados. Estes resíduos foram 3 mostraram ser importantes na ligação de antagonistas do CXCR4 [19], [20].

Usando o módulo no primeiro Maestro, as cadeias laterais dentro de raio 5 A do ligando foram atribuídos novamente. Após a mudança de cadeia lateral, as energias de ligação (BE) de cada conformação ancorada foi calculada usando BE = PE (ligando em proteína fixa) – PE (ligando de solvatação), onde PE (ligando em proteína fixa) representa a energia potencial de o ligando calculada com os átomos de proteína fixos e PE (ligando de solvatação) é a energia potencial do ligando de calculado com a superfície método contínuo solvatação nascido generalizadas [47]. As 200 maiores conformações de cada conjunto foram então inspeccionadas visualmente para maximizar as interacções receptor favoráveis. Nós, então, selecionou os 50 melhores compostos de cada conformação do receptor CXCR4 para testes posteriores.

fluorescência ligando marcado Competitiva Ensaio de Ligação

estudos de ligação competitiva para avaliar antagonistas CXCR4 candidatos foram realizadas utilizando o ligando do receptor CXCR4 quimiocinas vinculativo kit de ensaio de acordo com as instruções do fabricante (Tag-lite, Cisbio; Bedford, MA) [48], [49]. Resumidamente, as células HEK-293 foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas com ligando marcado com fluorescência CXCL12 com ou sem os antagonistas CXCR4. Após a incubação, as células foram excitadas a 620 nm e registada no modo de dois-emissão (620 nm e 665 nm) utilizando PHERAstar (BMG LABTECH Inc .; Cary, NC). Os rácios relativos de CXCL12-CXCR4 de ligação foram obtidos através da divisão do sinal de aceitador (665 nm) pelo sinal de dador (620 nm) e multiplicando este valor por 10.000.

CXCR4 Recrutamento de β-arrestina

ativação do eixo resultados CXCL12-CXCR4 no recrutamento de β-arrestina-2 ao terminal carboxi de CXCR4 [50]. Para verificar a inibição da β-arrestina-2 recrutamento por antagonistas CXCR4 candidatos, foi utilizado um ensaio de CXCR4 comercial (Tango; Invitrogen, Carlsbad, CA) [51], [52]. Resumidamente, as células manipuladas (3 × 10

4) foram semeadas em placas de 96 poços e incubadas durante a noite. DMSO ou antagonistas foram adicionados às células durante 30 minutos. Em seguida, CXCL12 (60 nM) foi adicionado e as células foram incubadas durante 5 horas.