Abstract

Nós já demonstrou que um derivado de células do estroma factor-1 (SDF-1; CXCL12) do sistema /CXCR4 está envolvido no estabelecimento de metástase no câncer oral. Recentemente, RNAs não codificam pequenas, microARNs (miARNs) demonstraram estar envolvidas no processo de metástase de vários tipos de cancros. No entanto, os miARNs que contribuem para metástases induzidas pelo sistema /CXCR4 SDF-1 em cancro oral são, em grande parte desconhecida. Neste estudo, analisámos os miARNs relacionadas com metástases induzida pelo sistema de SDF-1 /CXCR4 utilizando B88-SDF-1 células cancerosas orais, que exibem CXCR4 funcional e distante potencial metastático

In vivo

. Através de análise de microarray miARN, identificou-se a regulação positiva de miR-518C-5p em B88-SDF-1 das células, e confirmou a indução por análise de PCR em tempo real. Apesar de um inibidor de miR-518C-5p-LNA base não afectou o crescimento celular de células B88-SDF-1, que inibiu significativamente a migração das células. A seguir, um vector de expressão transfectadas miR-518c em células parentais B88 e células cancerosas por via oral e CAL27 transfectantes estáveis ​​de células isoladas, e B88-518c CAL27-518c, respectivamente. O crescimento de ancoragem dependente e independente de transfectantes de miR-518C foi significativamente aumentada em comparação com o crescimento das células simuladas. Além disso, foi detectada a migração aumentada dessas células. O inibidor de miR-518C-5p-LNA baseado prejudicada significativamente o crescimento celular aumentada e a migração de transfectantes de miR-518C, indicando que estes fenómenos foram principalmente dependente da expressão de miR-518C-5p. Em seguida, examinamos a função de miR-518c-5p

in vivo

. transfectantes miR-518C ou transfectantes simulados foram inoculados no músculo masséter ou os vasos sanguíneos de ratinhos nus. O volume do tumor, metástase gânglios linfáticos, e metástases de pulmão foram significativamente aumentada nos ratos inoculados com os transfectantes de miR-518C. Estes resultados indicaram que miR-518c-5p regula o crescimento e metástase de câncer oral como um alvo a jusante da SDF-1 /CXCR4 sistema

Citation:. Kinouchi M, Uchida D, Kuribayashi N, Tamatani T, Nagai H, Miyamoto Y (2014) Envolvimento de miR-518c-5p para o Crescimento e metástase no câncer oral. PLoS ONE 9 (12): e115936. doi: 10.1371 /journal.pone.0115936

editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 11 Agosto, 2014; Aceito: 02 de dezembro de 2014; Publicação: 23 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kinouchi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid para a Investigação Científica (B; 25.293.411 e C; 26463046; http: //www.. jsps.go.jp/english/e-grants/grants01.html). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

previamente demonstrado que as células B88, que são células de cancro oral que expressam o receptor de quimiocina CXCR4, especificamente metástases para nódulos linfáticos cervicais através de um factor derivado de células do estroma (SDF) -1 gradiente produzido pelo estroma linfático [ ,,,0],1] – [3]. A expressão forçada de SDF-1 em células B88 (chamado B88-SDF-1 células) conferiu reforçada motilidade celular e metástases de pulmão a seguir à inoculação intravenosa [4]. Recentemente, foi também demonstrado que a expressão de CXCR4 contribui para o potencial metastático de cancros das glândulas salivares [5]. Além disso, também demonstramos que o bloqueio CXCR4 com 1,1 ‘- [1,4-fenilenobis (metileno)] bis-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano octahydrochloride (AMD3100), um antagonista de CXCR4, pode ser um potente anti terapia -metastatic para câncer de cabeça e pescoço relacionados com o CXCR4 [5], [6].

Embora o sistema /CXCR4 SDF-1 funciona principalmente como um fator quimiotático em células cancerosas para semear sítios metastáticos, estudos recentes demonstraram que este sistema também regula o crescimento do tumor, célula tumoral cancro da interacção microambiente e angiogénese [7] – [10]. De facto, para estabelecer as metástases, vários processos importantes, tais como invasão, intravasamento, extravasamento e um potencial de crescimento ectópica, são indispensáveis. Assim, é crítico para investigar a função de objectivo (s) a jusante responsável pelo processo de metástases no sistema /CXCR4 SDF-1. microARNs (miARNs) são pequenos RNAs não-codificantes reguladoras que se ligam ao ARNm alvo específicas, que levam à repressão translacional [11]. miARNs estão envolvidos na regulação de processos biológicos, incluindo o crescimento celular, diferenciação e apoptose, tanto em condições fisiológicas e durante doenças, tais como cancro [11]. Evidência recente indicou que miARNs desempenham papéis cruciais no processo de metástase de vários tipos de cancros [11]. No entanto, os miARNs que contribuem para metástases induzidas pelo sistema /CXCR4 SDF-1 em cancro oral são, em grande parte desconhecida. Assim, neste estudo, examinamos miRNAs alvo regulados pelo sistema /CXCR4 SDF-1 em B88-SDF-1 células usando microarrays miRNA e investigou seu papel funcional na metástase do câncer bucal.

Materiais e Métodos

Ética declaração

os ratos foram tratados de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Tokushima (Permit Number: 11111). Em resumo, todos os ratos foram alojados em condições livre de patógenos, recebeu comida e água ad libitum, e mantidos em um 12 h ciclo de luz /escuro, numa sala com temperatura controlada adequada. Todos cirurgia e eutanásia foram realizadas sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. células B88 [1], [12] foram originalmente estabelecida a partir de um paciente com câncer de língua em 1988. A Comissão de Ética do Hospital Universitário Tokushima dispensou a necessidade de consentimento sobre a utilização desta linha celular (Permit Number: 453).

miRNA análise microarray

RNA pequeno para a análise microarray miRNA foi extraído de células B88-simulada privadas de soro e células B88-SDF-1. Uma micromatriz miARN foi realizada e analisada Toray (Tóquio, Japão), utilizando uma matriz de 3d gene humano (V16.1.0.0). Os dados brutos de microarray foram depositadas em Gene Expression Omnibus (GEO, http: //www.ncbi.nlm.nih.-gov/geo) de acordo com informações mínimas sobre o experimento de microarray diretrizes (Miame). O número de acesso é GSE59323.

Células e cultura de células

células cancerosas orais foram consideradas livres de micoplasma e contaminantes bacterianos. CAL27 células são células cancerosas orais que foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD). células B88 altamente metástases para nódulos linfáticos cervicais, quando as células são inoculadas no músculo masséter de ratinhos nus, mas raramente metastatizam para os pulmões através da inoculação intravenosa [1], [4]. Em contraste, as células CAL27 raramente metastatizam para nódulos linfáticos cervicais ou pulmões, quando as células são inoculadas no músculo masséter ou veia da cauda de ratinhos nus, respectivamente (observação não publicada). As células foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM; Sigma, St. Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 100 ug /mL de estreptomicina e 100 U /mL de penicilina, numa atmosfera humidificada de 95%

in vivo

estudo

Os ratinhos BALB /c nus de ar e 5% de CO2 a 37 ° C.

ratos e foram adquiridos a CLEA Japan (Osaka, Japão). Os ratinhos foram mantidos sob condições isentas de agentes patogénicos. Os ensaios foram iniciados quando os ratinhos tinham 8 semanas de idade e foram efectuados tal como descrito anteriormente [1], [4]. Resumidamente, as células foram inoculadas em ortotopicamente do músculo masséter de ratinhos nus (2 × 10

6) ou inoculados nos vasos sanguíneos de ratinhos nus (1 × 10

6); esses ratos foram sacrificados no dia 35. O volume do tumor foi estimado através da medição do tamanho do tumor e usando a seguinte fórmula: Volume do tumor = 1/2 x L x W

2, onde L e W representam o maior diâmetro e menor diâmetro, respectivamente. A presença ou ausência de linfonodos e metástases à distância foi confirmada por hematoxilina e eosina.

A transfecção

As células (5 × 10

5 células /prato) foram semeadas em cultura 100 milímetros pratos (Falcon; Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) em meio DMEM suplementado com FCS a 10%. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram transfectadas com 5 ng do vector de expressão de HSA-miR-518C ou o vector de controlo (Origene, Rockville, MD), utilizando Lipofectamina LTX (Life Technologies, Carlsbad, CA) na concentração final de 50 pM. As células foram incubadas durante 24 h em DMEM contendo FCS a 10% (V /V) e, subsequentemente, foram tratadas com tripsina e semeadas (01:05 proporção) em placas de cultura de 100 mm em meio DMEM contendo FCS a 10% (V /V). Quarenta e oito horas mais tarde, as células foram colocadas num meio selectivo contendo Geneticina (700 ug /ml de G418; Life Technologies). Após a seleção com G418 para 2 semanas, todas as colônias foram recolhidos e as seguintes transfectantes estáveis ​​foram isolados: B88-518c, B88-mock2, CAL27-518c, e as células CAL27-simulados

RT-PCR quantitativo.

Após 24 h, o RNA foi isolado a partir de células em crescimento logarítmico com reagente TRIzol (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. A transcrição reversa foi realizada utilizando o kit TaqMan MicroRNA RT (Life Technologies) ou miScript II RT (Qiagen, Hilden, Alemanha). Na PCR quantitativa, o miR-518C-5p e miARNs RNU6B foram detectadas utilizando o ensaio TaqMan Gene Expression (Life Technologies) ou o Ensaio miScript Primer (Qiagen). produtos específicos do gene foram medidos continuamente por um Real-Time PCR System ABI StepOnePlus durante 40 ciclos de PCR. Em algumas experiências, as células foram transfectadas com ou sem 50 nM de inibidor miRCURY LNA microARN (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) utilizando Lipofectamina RNAiMax (Life Technologies).

Ensaio MTT

As células foram semeadas numa placa de 96 poços (Falcon, Becton Dickinson Labware) a 5 × 10

3 células por poço em meio DMEM contendo 10% de FCS. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram transfectadas com ou sem 50 nM miRCURY LNA microARN inibidor utilizando Lipofectamina RNAiMax. Após 24 ou 48 horas, o número de células foi quantificada por um ensaio usando MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio; Sigma].

In vitro

migração celular ensaio

O

in vitro

migração das células foi avaliada utilizando transwells (Corning Corning, Nova Iorque) como descrito anteriormente [1]. As células conectados nos poros ou as células que aderem à superfície inferior da membrana foram contados em 10 campos a alta potência vista (x 400) por uma terceira pessoa cega para condições de tratamento. Em algumas experiências, 50 nM miRCURY LNA microARN inibidor foi transfectado antes de as células foram semeadas na câmara superior.

ensaio da ferida

24 h após a sementeira das células, uma ferida linear foi gerado sobre as monocamadas confluentes por raspagem com uma ponta de pipeta. células não ligadas foram lavados com agitação. As células foram fotografadas no mesmo ponto de uma grelha 48 h mais tarde. Cada linha celular foi banhado e feridos em triplicado

Spheroid ensaio de formação de

As células foram semeadas numa placa de 96 poços (placa NanoCulture; SCIVAX Ciências da Vida, Woburn, MA). A 1 × 10

3 células por poço em DMEM contendo inactivado pelo calor 10% de FCS. Vinte e quatro horas mais tarde, o fenótipo das células foi observada por microscopia de contraste de fase (x 300).

A análise estatística

diferenças significativas entre as médias para os diferentes grupos foram avaliadas com StatView 4,5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA), utilizando-se ANOVA com significância de p . 0,05

resultados

Isolamento de miR-518c-5p, que é induzida pela SDF- 1 /sistema de CXCR4

Nós investigamos miRNA jusante do sistema /CXCR4 SDF-1 utilizando a linha de células de câncer oral, B88-SDF-1, que tem um sistema /CXCR4 autócrina SDF-1 e exibem potencial metastático distante

in vivo

[4]. Microarray Analysis revelou que vários miARNs foram regulados positivamente ou regulados negativamente em B88 SDF-1 em comparação com células de células simuladas (dados não mostrados). Para confirmar a especificidade da análise de microarranjo, a expressão de miARN foi confirmada por RT-PCR quantitativo. Semelhante aos resultados de microarray, miR-518C-5p (anteriormente chamado miR-518c *) expressão foi regulada positivamente em B88 SDF-1 em comparação com células de células simuladas (Fig. 1a). Além disso, esta regulação positiva foi completamente abolida pela transfecção de um inibidor de miR-518c 5p-LNA (fig. 1A). Nós também obtiveram resultados semelhantes nas células B88 parentais estimulados com SDF-1 (Fig. 1B).

(A) A expressão de miR-518c-5p foi confirmado em B88-simulada e B88-SDF-1 células por PCR em tempo real. A infra-regulação de miR-518C-5p em células B88-SDF-1 após tratamento com um inibidor de LNA miR-518C-5p também foi confirmada. N.D .: não detectável. (B) A expressão de miR-518c-5p foi confirmada em células B88 dos pais após o tratamento com ou sem SDF-1 por PCR em tempo real.

Efeito da inibição de miR-518c-5p no celular crescimento e SDF-1 /CXCR4-dependente migração celular

Anteriormente, verificou-se que nem o parácrina ou autócrina do sistema /CXCR4 SDF-1 afectou o crescimento dependente da ancoragem de células B88 [1], [4] . Foi examinado o efeito de miR-518C-5p no crescimento celular utilizando um inibidor específico LNA miR-518C-5p. O inibidor não afectou o crescimento de qualquer B88-simulada ou células B88-SDF-1 (Fig. 2A). A seguir, investigou o efeito de miR-518C-5p na migração SDF-1 /CXCR4-dependente das células. Os ensaios de migração câmara revelou que a motilidade aumentada de B88-SDF-1 foi significativamente prejudicada células após o tratamento com um inibidor de miR-518c 5p-LNA (fig. 2B).

(A) O crescimento de B88-simulada células (lado esquerdo) e as células B88-SDF-1 (lado direito), na presença de quer um inibidor de controlo LNA ou um inibidor de LNA miR-518C-5p foi examinada utilizando um ensaio MTT. Não houve diferenças significativas entre os três grupos por ANOVA one-way. (B) A motilidade das células B88-SDF-1 na presença de um inibidor, quer de controlo de LNA ou um inibidor de LNA miR-518C-5p foi examinada utilizando um ensaio de migração Transwell. Um total de 2 x 10

4 células foram transfectadas antes de serem semeadas na câmara. **;

p

. 0,01 quando comparado com células tratadas com inibidor de controlo ou LNA controle não tratados pela ANOVA de uma via

Efeito da superexpressão de miR-518c-5p no crescimento celular

em seguida, foi realizado um ganho de ensaio função superexpressão de miR-518c-5p em células B88 parentais e também em células CAL27 parentais em que a expressão de CXCR4 e miR-518c-5p não era detectável. Após a transfecção do vector vazio ou vector de expressão de miR-518c, que recolhido todos os clones resistentes a G418, para evitar heterogeneidade clonal das células e estabeleceu os seguintes transfectantes, B88-mock2, B88-518c, CAL27-simulada e CAL27-518c. Poderíamos detectar a sobre-regulação de miR-518C-5p nos transfectantes de miR-518C em comparação com células falsamente, que foi completamente inibida pelo tratamento com o inibidor de miR-518c 5p-LNA (fig. 3A, B). O potencial de crescimento dependente de ancoragem de ambos os B88-518c células e CAL27-518c foi significativamente aumentada em comparação com a das células simuladas (Fig. 3C e D), que foram significativamente inibida pelo tratamento com o inibidor de LNA miR-518C-5p (Fig. 3E, F). Em seguida, examinou-se o efeito de sobre-expressão de miR-518c no crescimento independente de ancoragem das células. células B88-mock2 redondas formadas e apertados esferóides de adesão célula-célula (Fig. 3G), enquanto que as células B88-518c formados esferóides de videira semelhante (Fig. 3H). Em contraste, ambos os transfectantes CAL27 formado esferóides redondos (Fig. 3I, J), mas esferóides maiores foram observadas em células CAL27-518c (Fig. 3J).

B88 e células CAL27 foram estavelmente transfectadas com um controle células vetoriais ou um vector de expressão de miR-518c e B88-mock2 ou células B88-518c e CAL27-simulados ou CAL27-518c foram isolados, respectivamente. (A, B) A expressão de miR-518C-5p-B88 nos transfectantes (A) e CAL27-transfectantes (B) foram avaliadas por PCR em tempo real. A infra-regulação de miR-518C-5p em células ou células B88-518c CAL27-518c após o tratamento com um inibidor de LNA miR-518C-5p também foi confirmada. (C, D) de crescimento Anchorage-dependente dos B88-transfectantes (C) e CAL27-transfectantes (D) foram avaliadas utilizando um ensaio MTT. *;

p Art 0,05, **;

p Art 0,01 quando comparado com células falsamente pelo one-way ANOVA. (E, F) O crescimento dos transfectantes-B88 (E) e CAL27-transfectantes (F), na presença de quer um inibidor de controlo LNA ou um inibidor de LNA miR-518C-5p foi examinada utilizando um ensaio MTT. *;

p Art 0,05, **;

P

0,01 quando comparado com células tratadas com inibidor de controlo ou de LNA de controlo não tratado por ANOVA de uma via. crescimento (GJ) Anchorage-independente B88-mock2 (G), B88-518c (H), CAL27-simulada (I) ou CAL27-518c (J) foi avaliada utilizando uma placa de nano-cultura.

Efeito da superexpressão de miR-518c-5p sobre a migração celular

células B88-518c adquiridos uma resposta quimiocinética significativa (Fig. 4A) e reforçada motilidade celular (Fig. 4B). Nós também detectou uma migração reforçada nas células CAL27-518c (Fig. 4C). A motilidade celular aumentada das células B88-518c foi diminuída de modo significativo após tratamento com o inibidor de miR-518c 5p-LNA (Fig. 4D).

(A) células B88-mock2 ou B88-518c foram cultivadas a confluência. Um ensaio de cicatrização da ferida foi realizada. *;

p Art 0,05 quando comparado com células falsamente pelo one-way ANOVA. (B, C) A motilidade de células B88-518c (B) ou células CAL27-518c (C) foi avaliada utilizando um ensaio de migração Transwell. Cada transfectante foi semeada a uma densidade de 1 x 10

4. **;

p Art 0,01 quando comparado com células falsamente pelo one-way ANOVA. (D) A motilidade de B88-transfectantes na presença de um inibidor, quer de controlo de LNA ou um inibidor de LNA miR-518C-5p foi também examinada utilizando um ensaio de migração Transwell. **;

P

0,01 quando comparado com células tratadas com inibidor de controlo ou de LNA de controlo não tratado por ANOVA de uma via

O papel de miR-518C-5p sobre o crescimento e metástase.

in vivo

a seguir, avaliou o efeito de miR-518c-5p sobre o crescimento e metástase in vivo. B88 e CAL27 transfectantes foram ortotopicamente inoculado no músculo masseter de ratos pelados [1]. O tamanho do tumor primário a partir de células B88-518c (Fig. 5A) e células CAL27-518c (Fig. 5B) aumentou significativamente em comparação com os tumores de células simuladas. Embora ambos os transfectantes simulados e miR-518C histopatologicamente metastizado para os nódulos linfáticos cervicais, o peso dos nodos linfáticos contendo transfectantes de miR-518C era significativamente mais pesado do que a dos nódulos linfáticos contendo as células simuladas (Fig. 5C-E). A seguir realizada a inoculação intravenosa com estes transf ectantes. Numerosos e grandes nódulos metastáticos foram detectados nos pulmões em todos os ratinhos inoculados com células B88-518c (Fig. 6A). O número de nódulos de murganhos inoculados com células B88-518c foi significativamente aumentada em comparação com o número de células simuladas (Fig. 6B).

(A, B) B88-transfectantes (A) e CAL27-transfectantes ( B) foram inoculados ortotopicamente no músculo masséter de ratinhos nus, os quais foram sacrificados no dia 35. o tamanho dos tumores primários foi medido uma vez por semana. Os resultados apresentados são as médias ± DP. *; p 0,05 quando comparado com células falsamente por ANOVA de uma via. (C) Representante H E coloração dos gânglios linfáticos metastáticos dos ratos nus inoculados com células B88-mock2 (esquerda) e células B88-518c (direita). (D, E) O peso dos nodos linfáticos submandibulares foi medida nos ratinhos inoculados com B88-transfectantes (D) e CAL27-transfectantes (E). *; p 0,05 quando comparado com células falsamente por ANOVA de uma via

As células foram inoculados em vasos sanguíneos dos ratos nus, os quais foram sacrificados no dia 35. (A) representativas H . E de coloração os pulmões dos ratos nus inoculados com células B88-mock2 (esquerda) e células B88-518c (direita). (B) Os nódulos metastáticos foram contadas sob um microscópio. ** P . 0,01 quando comparado com células falsamente pelo one-way ANOVA

Discussão

miRNAs são pequenos, endógeno, evolutivamente conservadas RNAs não-codificantes que regulam a cerca de 60% de genes de mamífero, modulando os níveis de transcrição. miARNs estão envolvidas em muitas vias moleculares e em processos biológicos fundamentais, incluindo o crescimento celular, o desenvolvimento, diferenciação, proliferação e morte das células [11]. Estudos recentes demonstraram que o papel de miARNs na modulação do processo metastático no contexto de tumores sólidos, e estes foram denominados miARNs metastamir [13]. Numerosos metastamirs foram identificados e ter efeitos pró e anti-metastáticos [11]. No entanto, é provável que existam muitos miARNs que são metastamir com funções desconhecidas, pois 3% do genoma humano é estimada para codificar para sequências de miARN [14]. No presente estudo, demonstramos que miR-518c-5p pode ser um romance metastamir de promoção da metástase. miR-518C-5p foi originalmente identificada nas 250 bibliotecas de ARN pequenos de 26 diferentes sistemas de órgãos e tipos de células de humanos e roedores, enriquecida em neuronal, bem como células normais e malignas hematopoiéticas e tecidos [15]. Embora a função de miR-518c-5p não foi claramente definido em cancros, Dyrskjøt e seus colegas demonstraram que o miR-518c-5p foi significativamente associada com a progressão da doença quando corrigidos para o estágio da doença e grau usando uma análise de regressão multivariada de Cox [16]. Além disso, investigações recentes demonstraram que o miR-518C-5p exibiu uma regulação positiva significativa em retinoblastoma numa análise miARN microarray [17]. Tomados em conjunto com os nossos resultados atuais, miR-518c-5p pode funcionar como um oncomiR nas células tumorais.

No presente estudo, mostramos que miR-518c-5p é regulada pela-1 SDF /sistema de CXCR4 de um modo parácrino ou autocine. Rhodes e colegas investigaram miARN expressão induzida pelo sistema de SDF-1 /CXCR4 nas células cancerosas da mama estrogénio receptor-alfa-positivos [18]. No entanto, nem miR-518c-5p nem outra miRNA detectado em nossa análise miRNA estavam presentes em seus resultados. Além disso, embora analisamos também a análise de miRNA microarray nas células câncer da glândula salivar CXCR4-positivo, ACC-M [19], após estimulação com SDF-1, não havia nenhum miRNAs comuns entre os três miRNA análises microarray apesar do uso de o sistema de SDF-1 /CXCR4 nestas células cancerosas (dados não mostrados). Esta descoberta pode ser devido às diferentes condições experimentais das células; No entanto, isto pode ser devido ao local específico diferente padrão metastático destas células cancerosas. Por exemplo, favores de cancro da mama metástase para o osso, câncer da glândula salivar para o pulmão e câncer oral para o nó de linfa. Assim, miARNs que são necessárias para homing para o órgão alvo específico pode ser activado por CXCR4 na ligação do seu ligando, SDF-1 nestas células cancerígenas.

O mecanismo de regulação positiva miR-518C-5p pela SDF sistema de -1 /CXCR4 em células cancerosas orais não foi esclarecida no presente estudo. miR-518C-5p pertence à família de miR-515 em um cluster de miARN cromossoma 19, denominado C19MC [20]. C19MC é o maior cluster, conservada apenas em primatas, codificação de 59 miRNAs maduros e exibindo uma expressão muito baixa na maioria dos tecidos humanos devido ao controle epigenético [20]. Uma vez que o sistema de SDF-1 /CXCR4 pode regular positivamente DNMT1 /expressão DNMT3ß [21] ou ANP32A /LANP, um componente do inibidor da histona acetiltransferase [22], o miR-518C-5p regulação positiva pode ser dependente do resultado da desmetilação de C19MC. Alternativamente, investigações recentes demonstraram que alguns dos membros de miARN em C19MC foram regulados positivamente no carcinoma hepatocelular caracterizado por IGF aberrante, fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) -Akt-mTOR ou a activação da via do p53 [23], [24]. O sistema /CXCR4 SDF-1 também pode activar as vias de PI3K-Akt em células B88 [1], e estas vias podem estar envolvidos na regulação positiva de miR-518C-5p. Foi examinado adicionalmente expressão de miR-518C-5p utilizando uma linha celular de cancro oral, HNT, em que a expressão de CXCR4 foi 7,5 vezes menor do que em células B88 [1], [3]. HNT-SDF-1 células exibiram ligeiro, mas não significativo, alterações fenotípicas

in vitro

e

In vivo

, em que a activação da via PI3K-Akt por SDF-1 não era detectável [ ,,,0],4]. Além disso, a indução de miR-518C-5p em células hNT-SDF-1 era detectável apenas a um nível marginal, provavelmente devido à redução da expressão de CXCR4, em comparação com a de B88 células (dados não apresentados). Assim, o nível de expressão de CXCR4 e a sinalização a jusante forte, tais como PI3K, AKT, também pode ser crítico para a activação da expressão de miR-518C-5p, portanto, seriam necessários mais estudos para esclarecer este mecanismo.

no presente estudo, o miR-518C-5p induzida pelo sistema /CXCR4 SDF-1 não estimula o crescimento celular, mas fez aumentar a migração de células através de um inibidor de LNA. Em contraste, poderíamos detectar tanto a estimulação do crescimento e aumentou-migração após a transfecção de um vector de expressão de miR-518c,

in vitro

e

in vivo

. Embora a razão não é clara, o resultado pode ser devido ao efeito de miR-518C-3p produzido pelo vector de expressão de miR-518c. No entanto, não foi possível encontrar relatórios anteriores sobre miR-518c-3p em células cancerosas e crescimento celular, e um inibidor LNA contra miR-518c-5p poderia suprimir o crescimento reforçada, tanto em células B88-518c e CAL27-518c (Fig. 3E , F). Assim, acreditamos que o efeito de miR-518C-3p sobre o crescimento das células pode ser parcialmente negligenciada. A segunda possibilidade pode ser devido à regulação negativa dos mRNAs alvo não fisiológicas ou falsos que partilham uma sequência de sementes semelhante pela sobre-expressão de miR-518C-5p. No entanto, a sobre-expressão de miR-518C-5p pelo oligonucleótido contrariamente inibiu o crescimento e a migração das células B88 e células CAL27, muito provavelmente devido à regulação negativa do ARNm alvo falso (dados não mostrados). Este resultado indica que a expressão de miR-518C usando o método de vector induziu uma condição fisiológica e não-tóxicos nestas células de cancro oral. Assim, nós acreditamos que a indução moderada de miR-518C-5p pode ser suficiente para a migração de células, mas forte indução de miR-518C-5p pode ser necessária para a indução do crescimento celular. Porque o

in silico

alvos de mRNA de miR-518c-5p incluem vários tipos de genes que regulam o crescimento e metástase (S1 Table), teses genes alvo podem controlar o efeito diferente de miR-518c-5p.

C19MC, incluindo miR-518c-5p, mapeia para banda cromossômica 19q13.4 [20]. Kasamatsu e seus colegas demonstraram que o locus 19q13.4 é amplificado em carcinoma adenóide cístico de glândula salivar, um tipo altamente metastática do câncer de cabeça e pescoço [25]. Além disso, a amplificação deste locus é frequentemente detectada em ependymoblastoma e tumores embrionários com neurópilo abundante e verdadeiros rosetas, neoplasias embrionárias muito agressivas, a uma taxa de 93% [26]. O sistema /CXCR4 SDF-1 desempenha papéis importantes na manutenção da arquitectura de nichos para hematopoiéticas estaminais e outras células de tecido, tais como as células germinais e folicular, intestinais, e células estaminais neurais [27], [28]. Notavelmente, a maioria das células-tronco cancerosas (CSCs) expressam CXCR4 e responder a um gradiente quimiotático de SDF-1, sugerindo que CSCs provavelmente representam uma subpopulação capaz de iniciar a metástase [29]. Além disso, vários grupos têm recentemente ligados a expressão de membros da C19MC com o assinatura característica miARN para células estaminais embrionárias humanas [20]. Tomados em conjunto, C19MC, incluindo o miR-518C-5p, pode ser expressa em CSCs que estão envolvidas no crescimento e metástase.

Conclusões e Recomendações

Estes resultados indicaram que regula o miR-518C-5p o crescimento e metástase do cancro oral como um alvo a jusante do sistema /CXCR4 SDF-1. No futuro, seria crucial para examinar a associação entre CXCR4 e expressão de miR-518c-5p no material clínico. Se o mecanismo molecular de miR-518C-5p contra a metástase do cancro pode ser clarificada, a supressão do crescimento celular e da migração por um inibidor de miR-518C-5p pode servir como uma base para o desenvolvimento de terapias contra metástases.

Informações de Apoio

Tabela S1.

miRNA alvo de miR-518c-5p é analisado pelo uso de programa de microRNA.org (https://www.microrna.org/microrna/getMirnaForm.do), eo valor de corte é adaptada menos de -1.5 de pontuação miRSVR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115936.s001

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Koh-ichi Nakashiro (Department of Oral e Cirurgia maxilo-facial da Universidade Ehime Graduate School of Medicine) para a prestação de assistência técnica.