Abstract

epitelial mesenquimal (EMT) é considerado ser correlacionados com doença maligna das células cancerosas e responsável pela invasão e metástase do câncer. Nós relatado anteriormente que metástases à distância foi associada com hipóxia no câncer gástrico. Por conseguinte, investigado o efeito da condição hipóxica em EMT de células de cancro gástrico. células de cancro gástrico foram cultivados em normoxia (21% de O

2) ou hipoxia (1% de O

2) durante 24 h. EMT foi avaliada como a percentagem de células em forma de fuso em células totais. foi avaliada efeito transformar β1 factor de crescimento (TGF-p1) ou inibidores da tirosina-cinase no EMT. O nível de expressão

TGF-p1

e

TGFβR

foi avaliada pelo tempo real RT-PCR. A produção de TGF-p1 a partir de células de cancro foi medido por ELISA. Hipóxia estimulado EMT de OCUM-2MD3 e células OCUM-12, mas não o de células OCUM-2M. O nível de expressão de

TGF-p1

ARNm sob hipóxia foi significativamente maior do que sob normoxia em todas as três linhas de células. O nível de

expressão TGFβR

ARNm foi significativamente aumentada por hipoxia em células OCUM-2MD3, mas não em células OCUM-2M. inibidor TGFβR, SB431542 ou Ki26894, suprimiu significativamente EMT de OCUM-2MD3 e OCUM-12. produção de TGF-p1 a partir OCUM-2MD3 e células OCUM-12 estava significativamente aumentada em condições de hipoxia, em comparação com o que, sob condições de normóxia. Esses achados podem sugerir que a hipóxia estimula a EMT de células cancerosas gástricas via de sinalização TGF /TGFβR autócrina

Citation:. Matsuoka J, Yashiro M, Doi Y, Fuyuhiro Y, Kato Y, Xintoísmo O, et al. (2013) hipóxia Estimula a EMT de células de câncer gástrico através Autócrino TGF Sinalização. PLoS ONE 8 (5): e62310. doi: 10.1371 /journal.pone.0062310

editor: Claudio M. Costa-Neto, da Universidade de São Paulo, Brasil

Recebido: 19 Outubro, 2012; Aceito: 19 de março de 2013; Publicado em: 17 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Matsuoka et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado em parte pelo Fundo de Pesquisa e Desenvolvimento do Centro Nacional de Câncer (23-a-9), e por Grants-in Aid para a Investigação científica (KAKENHI, nos. 20591573, 22390262 e 23390329) do Ministério da Educação, Ciência, Desporto, Cultura e Tecnologia do Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações. KS, TS, e AM são funcionários da Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. Ki26894, que foi usado neste estudo, é um produto da Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados para declarar . Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

mesenquimais transição epitelial (EMT) é caracterizada por alterações na morfologia celular durante o qual as células epiteliais mesenquimais adquirir propriedades, enquanto a perda de interacções célula-célula e polaridade apicobasal [1], [2]. Nos cancros epiteliais, EMT é reconhecido como um dos mecanismos responsáveis ​​por iniciar os comportamentos invasivos e metastáticos [3] – [5]

Um ambiente hipóxico existe em algumas regiões de cânceres sólidos que mostram um crescimento rápido, porque a angiogênese. em carcinomas é heterogênea [6]. A hipoxia é considerado para ser associado com os fenótipos de tumor agressivo de carcinomas gástricos [7], [8], incluindo a capacidade metastática de células cancerosas [6], [9]. Dados clínicos e experimentais também fornecem evidência de uma associação entre o ambiente hipóxico e mau prognóstico [10], [11]. Assim, é importante para o futuro desenvolvimento de tratamentos contra o cancro para esclarecer o mecanismo de metástases induzida pela hipoxia.

Tem sido relatado que vários factores solúveis, incluindo factor de crescimento transformante-β1 (TGF-p1) [12], [ ,,,0],13], o factor de crescimento epidérmico (EGF) [14], insulin-like growth factor-1 (IGF1) [15], o factor de crescimento de fibroblastos (FGF) [16], o factor de crescimento de hepatócitos (HGF) [17] foram correlacionados com EMT . sinais de TGF-p têm um papel importante em vários aspectos da disseminação metastática de células cancerosas, tais como a migração, invasão e EMT [12], [13]. Os ligandos de TGF-p se ligam a TGF-p do receptor de tipo II (TGFβRII), o qual forma um complexo com qualquer TGFβR tipo I ou II. TGFβR tipo I (TGFβRI) transmite sinais dentro da célula através de segundo mensageiro proteínas Smad [13], [18]. sinais a jusante são propagadas através TGFβRI, que fosforila proteínas Smad regulados pelo receptor [19], [20]

Vários estudos têm relatado que uma condição hipóxica pode induzir a EMT de células de câncer [21] – [24]., mas o mecanismo molecular responsável pela EMT sob condição hipóxica permanece obscuro. Por isso, investigamos o efeito da hipóxia sobre as características morfológicas das células cancerosas gástricas para esclarecer os mecanismos responsáveis ​​pela EMT induzida por hipóxia.

Materiais e Métodos

linhas

Cultura e célula

foram utilizados sete linhas celulares de cancro gástrico. OCUM-2MD3 [25], OCUM-12 [26], OCUM-2 M [27], KATO-III [28], e MKN-45 [29] foram derivadas do carcinoma gástrico difuso-tipo. MKN-74 [29] e MKN-7 [29] foram obtidas a partir do intestino do tipo. OCUM-2M, OCUM-2MD3 e OCUM-12 foram establised em nosso laboratório, conforme relatado anteriormente [25] – [27]. Resumidamente, OCUM-12was derivadas a partir de ascites associadas com carcinoma do tipo difuso gástrica, e células OCUM-2MD3, uma linha de célula filha com elevado potencial de metástases peritoneal, foram estabelecidos a partir de células OCUM-2m usando o modelo de tumor ortotópico, uma ascite linha celular parental associada a carcinoma gástrico tipo difuso. As outras linhas celulares foram obtidas a partir do banco de células JCRB (Osaka, Japão) ou o American Type Culture Collection (Rockville, MD). As células foram cultivadas a 37 ° C em 21% de O

2 (normoxia) ou 1% de O

2 (hipóxia). condições hipóxicas foram mantidas usando uma câmara incubador modular (Hirasawa, Tóquio, Japão) com 5% de CO

2 e 1% de O

2 equilibrada com N

2 gás. O meio de cultura consistiu em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM;. Nikken Bio, Osaka, Japão) com soro de bovino fetal a 10% (. Nichirei Bio), 100 UI /ml de penicilina (ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA), 100 ug /ml de estreptomicina (ICN Biomedicals), e piruvato de sódio 0,5 mM (Cambrex, Walkersville, MD).

alterações morfológicas

As células cancerígenas foram cultivadas sob condições de normóxia ou hipóxicas durante 24 h, e a morfologia das células foi observada microscopicamente. EMT foi determinado quando a forma poligonal ou de fuso foi encontrado em células cancerosas, microscópio de contraste de fase. A frequência de EMT foi avaliada pela taxa de células poligonais ou em forma de fuso em todas as células cancerosas; taxa de EMT = o número de células forma poligonal ou de fuso /número total de células x 100 (%).

Efeitos de vários fatores solúveis em alterações morfológicas

Foram examinados os efeitos de vários fatores solúveis , incluindo EGF (Pepro Tec, Rocky Hill, NJ), IGF1 (Pepro Tec), factor de crescimento celular endotelial vascular (VEGF; R D systems, Minneapolis, MN), base-FGF (Sigma, Saint Louis, MO), de plaquetas factor de crescimento -derived homodímero BB (PDGF-BB; Pepro tech), o HGF (Pepro tech), TGF-p1 (rei Brewing, Kakogawa, Japão), sobre a morfologia das células cancerosas. As células foram cultivadas em DMEM contendo um dos factores acima mencionados para a concentração requerida a 37 ° C em condições de normóxia. A morfologia foi analisada após 24 horas. As experiências foram realizadas para cada fator em duplicado.

Efeitos de anticorpos em alterações morfológicas

neutralizantes

utilizados anticorpos neutralizantes, tais como o anticorpo anti-HGF (Genzyme technè, MPLS, MN, EUA), anticorpo anti-TGF-p (R D systems), anti-PDGF-BB (Genzyme), anti-FGF7 (R D systems), anti-VEGFR3 (R D systems). As células foram cultivadas em DMEM contendo um dos anticorpos acima em 100 ug /ml a 37 ° C em hipoxia. A morfologia foi analisada após 24 horas.

Efeito de vários inibidores phospholylation em alterações morfológicas

Após as células atingiram semi-confluência, as células foram adicionadas a cada TGFp ou inibidor e incubados sob condições de hipóxia ou de normóxia durante 24 h. Em seguida, os critérios morfológicos foram examinados em comparação com o controlo. Cinco inibidores phospholylation pequeno-sintéticos, Ki26894 (inibidor TGFβRI, 10 uM; Kirin Pharma, Mishima, Japão), SB431542 (inibidor TGFβRI, 10 uM; Sigma, St. Louis, MO), sunitinib (SU11248, 20 nM; um inibidor de tirosina cinase contra VEGFR, PDGFR, c-kit, FGFR2 e FLT3, LKT Laboratories, St. balde, MN), PD173074 (FGF /receptor de VEGF inibidor da tirosina quinase, 5 nM; Santa Cruz, CA), lapatinib (GW572016, 10 nM; um inibidor da tirosina-cinase EGFR e ErbB2 contra, Toronto Research Chemicals), e PHA665752 (inibidor de c-Met, 2? M;. Pfizer, San Diego, CA, EUA) foram utilizados

quantitativo em tempo real a transcriptase inversa-polimerase reação em cadeia (RT-PCR)

RT-PCR quantitativa foi realizada para examinar

TGF-p1

,

TGFβRI, TGFβRII, Comprar e

expressões Vimentin

mRNA. As células cancerígenas foram incubadas sob condições de normóxia e sob condições hipóxicas durante 24 h. Após a incubação, o RNA celular total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Após a remoção do DNA genómico por ADNase, o ADNc foi preparado a partir de 2 ug de ARN com Maloney vírus de leucemia de rato de transcriptase (Invitrogen) utilizando iniciadores aleatórios (Invitrogen) inverter. Para determinar as mudanças de dobragem em cada gene, em tempo real de RT-PCR foi realizada no ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), utilizando ensaios de expressão comercialmente disponíveis gene para a

TGF-p1 (Hs00998130,),

TGFβRI

(Hs00610319),

TGFβRII

(Hs00559661),

vimentina

(Hs00958116),

torção

(Hs01675818),

Zeb1

(Hs 00.232.783),

Snail1

(Hs00195591),

VEGFA

(Hs00900055). A PCR foi realizada a 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 60 s durante 40 ciclos. desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foi usado como um padrão interno para normalizar os níveis de ARNm para as diferenças de concentração da amostra e do carregamento. Fold alterações na expressão de cada ARNm alvo em relação ao GAPDH foi calculada com base no ciclo limiar (Ct) de 2

-Δ (ΔCt), onde ΔCt = Ct Ct-Alvo GAPDH e Δ (ΔCt) = ΔCt

hipóxia-ΔCt

normoxia. As reações de PCR quantitativas foram realizadas em triplicado.

Western blot análise

Para examinar o efeito da hipóxia na Smad2 fosforilação, as células cancerosas foram incubadas sob normóxica ou condições de hipóxia durante 24 h, respectivamente. As células foram lisadas num tampão de lise, e aliquotas contendo 50 ug de proteína total foram submetidos a electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida-; as bandas de proteína foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA). A membrana foi incubada em TBS-T (TBS 10 mM e 0,05% de Tween 20) suplementado com 5% de albumina não gorda de leite ou de bovino a 5% (Sigma) à temperatura ambiente durante 1 h. Em seguida, a membrana foi colocada numa solução de TBS-T contendo o anticorpo primário P-Smad2 (Ser

465/467; 1: 1000; Cell Signaling Technology) ou Smad2 /3 (1: 1000; Cell Signaling Technology), vimentina (1: 1000; Cell Signaling Technology), anti-βactin (1: 1000; Sigma) e deixa-se reagir a 4 ° C durante a noite. Em seguida, cada anticorpo foi lavada três vezes com TBS-T durante 10 min, e um anticorpo secundário marcado com peroxidase (GE Healthcare, Buckinghamsire, Reino Unido) reage com adicionou-se o anticorpo primário. As bandas foram detectadas usando um sistema de quimioluminescência aumentada (Wako, Osaka, Japão).

ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA)

A produção de TGF-p1 a partir de células de cancro foi medido por uma enzima de sanduíche quantitativo técnica de imunoensaio utilizando um kit Quantikine humana TGF-p1 de ELISA, de acordo com a instrução manufacturer`s (R D systems). As células cancerígenas foram incubadas em condições de hipoxia ou normoxia durante 24 h, em seguida, o meio foi substituído com 3 ml de DMEM livre de soro. As células foram incubadas em condições de hipoxia ou normoxia, durante mais 24 h. média condicional (CM) foi coletado de cada prato e centrifugado a 1000

g Compra de 5 min. nível de TGF-p1 de CM livre de soro foi medida utilizando o kit ELISA. ELISA detectada tanto o TGF ativo e latente.

A análise estatística

As comparações entre conjuntos de dados foram feitas com Student

t

-teste ou Kruskal-Wallis ANOVA one-way por fileiras seguido de teste de comparação múltipla de Dunn. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando o valor de P foi . 0,05

Resultados

Efeitos de hipóxia sobre a morfologia da célula cancerosa

Uma condição hipóxica aumentou significativamente o número de células poligonais ou fusiformes submetidos EMT entre OCUM-2MD3 ou células OCUM-12, mas não entre OCUM-2M, MKN-7, MKN-45, MKN-74, ou células KATO-III (Fig. 1A e Fig. S1). A morfologia celular de OCUM-2MD3 e OCUM-12 começou a mudar após 4 h na cultura hipóxica. Após 12 h de cultura, um aumento da taxa de EMT foi observada em ambas as linhas celulares. A taxa de EMT-OCUM 2MD3 e células OCUM-12 foi mais elevada a 24 h hipóxico cultura (Fig. 1B). Uma vez que as alterações morfológicas eram evidentes às 24 h de cultura em condições de hipoxia, os mecanismos moleculares da EMT foram analisados ​​às 24 h de cultura, sob condições hipóxicas utilizando células OCUM-2MD3, OCUM-12, e OCUM-2M.

(a) Um aumento de células poligonais ou o fuso-forma foi reconhecida em OCUM-2MD3 e células OCUM-12 sob hipóxia, mas não em células OCUM-2M. (B) A morfologia do OCUM-2MD3 e células OCUM-12 começou a mudar após 4 h na cultura hipóxica. EMT de OCUM-2MD3 e células OCUM-12 foi mais evidente aos 24 h de cultura sob hipóxia. EMT foi determinado quando a forma poligonal ou de fuso foi encontrado em células cancerosas, microscópio de contraste de fase.

Efeitos de vários fatores de crescimento sobre a morfologia da célula cancerosa

fatores solúveis foram usados ​​em concentrações de 10 ou 100 ng /ml. OCUM-2MD3 e células OCUM-12 tornou-se em forma de fuso, após a adição de TGF-p1 ou HGF, mas não após a adição de EGF, FGF2, FGF7, IGF1, o VEGF ou PDGF-BB após 24 h sob normoxia (Tabela 1). Em contraste, as células OCUM-2M não mostrou nenhuma mudança morfológica após a adição de quaisquer factores (Fig. 2).

alteração morfológica foi encontrada na presença de TGF-p e HGF às 24 h de cultura na OCUM-2MD3 e OCUM-12 células, mas não FGF2.

Efeitos de anticorpos neutralizantes na morfologia da célula cancerosa sob hipóxia

EMT induzida por hipóxia foi parcialmente inibida por anti-TGF-β1 anticorpo em 100 ug /ml, mas não por HGF anticorpo anti-(Tabela 2).

Efeitos de hipóxia no

TGF-p1

,

TGFβRI

, e

TGFβRII

expressão de mRNA de células cancerosas gástricas

O nível de expressão de

TGF

foi significativamente (p 0,001) aumentou sob uma condição hipóxica em todos OCUM-2MD3, OCUM- 12, e OCUM-2M células, em comparação com o nível sob normoxia (Fig. 3A). Os níveis de expressão

TGFβRI

e

TGFβRII

foram significativamente aumentados sob condição hipóxica em células OCUM-2MD3. Em contraste, os níveis de

TGFβR1

e

TGFβR2

expressão foram significativamente menores sob condição hipóxica em células OCUM-2M (Fig. 3B).

(A)

TGFp

expressão de ARNm foi significativamente (p 0,001) aumentou sob uma condição hipóxica em OCUM-2M, OCUM2MD3 e células OCUM-12. (B) Os níveis de expressão

TGFβRI

e

TGFβRII

foram significativamente (p 0,001) aumentou sob uma condição hipóxica em OCUM-2MD3, mas não em células OCUM-2M. (C) A produção de TGF-p1 em OCUM-2MD3 e células OCUM-12 foi significativamente (p = 0,001 e p 0,001) mais elevada em condições de hipoxia (232 pg /ml, 80 pg /m, respectivamente) do que sob condições de normóxia (109 pg /ml, 34 pg /mL, respectivamente). produção de TGF-p1 em células OCUM-2M não foi diferente entre normóxia e hipóxia.

Efeito da hipóxia sobre a produção de TGF-p1 lançado a partir de células de câncer gástrico

produção de TGF-p1 de OCUM-2MD3 e OCUM- 12 células foi significativamente (p 0,001) maior em condições de hipoxia em comparação com a normoxia, mas não a partir de células que OCUM-2M (Fig 3C).

Efeitos de hipoxia em Smad2 fosforilação de linhas celulares de cancro gástrico

.

Em OCUM-2MD3 e células OCUM-12, Smad2 fosforilação foi aumentada sob condição hipóxica, em comparação com que, sob uma condição normóxica. Em contraste, Smad2 fosforilação não foi aumentado sob condição hipóxica em células OCUM-2M (Fig. 4).

condição hipóxica durante 24 h aumentou Smad2 fosforilação de OCUM-2MD3 e OCUM-12 células (setas), mas não a das células OCUM-2M. Smad2 /3 foi usado como um controle internacional para p-Smad2.

Efeitos de inibidores da fosforilação de quinase sobre EMT e expressão de vimentina em hipóxia

De qualquer dos inibidores de fosforilação TGFβR, Ki26894 e SB431542, inibiu as alterações morfológicas de OCUM-2MD3 e OCUM-12 células sob uma condição hipóxica, mas três outros inibidores, lapatinib, sunitinib, e PHA665752, não (Figura 5A, 5B). Por outro lado, nenhum dos inibidores teve qualquer efeito sobre a morfologia do OCUM-2MD3 e células OCUM-12 sob normoxia (dados não mostrados). O nível de

vimentina, que foi utilizado como um marcador de EMT, a expressão foi significativamente aumentada por hipoxia, e foi diminuído por qualquer um dos inibidores TGFβR Ki26894 e SB431542 (Figura 5C). nível de proteína vimentina também foi aumentada em condições de hipoxia, e foi diminuído por qualquer um dos inibidores TGFβR Ki26894 e SB431542 (Figura 5D)

(A, B) EMT induzida por hipoxia foi significativamente (p 0,01). inibida pela inibidores TGFβR (Ki26894 e SB431542). Outros inibidores (Lapatinib, sunitinib, e PHA665752) não teve efeito sobre EMT sob hipóxia. (C)

vimentina

expressão de ARNm foi significativamente aumentada sob uma condição hipóxica em OCUM-2M e células OCUM-12, e diminuiu com inibidores TGFβR (Ki26894 e SB431542). (D) proteína Vimentin foi aumentada em hipóxia em OCUM-12 e OCUM-2MD3, e diminuiu com inibidores TGFβR (Ki26894 e SB431542).

Efeitos da condição hipóxica sobre os fatores associados a EMT.

hipóxica significativamente aumentada

VEGF-a

nível de mRNA em OCUM-2M, OCUM-2MD3, e as células OCUM-12. O nível de expressão

Torção

ou

Zeb1

foi significativamente aumentada por hipóxia em OCUM-2MD3 e células OCUM-12, mas foi reduzida em células OCUM-2M. A expressão aumentada de

torção

ou

Zeb1

foi diminuído por qualquer um dos inibidores TGFβR Ki26894 e SB431542 em células OCUM-12. condição hipóxica não afetou sobre o nível de

Snail1

(Figura 6) expressão.

(A) Uma molécula de hipóxia-alvo,

VEGF-A

nível de mRNA em OCUM -2m, OCUM-2MD3 e OCUM-12 foi aumentada em hipóxia. (B, C) condição hipóxica aumentou significativamente o nível de

Torção

e expressão

Zeb1

em OCUM-2MD3 e células OCUM-12, mas não em células OCUM-2M. (D) O nível de Snail1 expressão não foi afetada pela condição hipóxica.

Discussão

Recentemente, vários estudos têm relatado que um microambiente hipóxico que envolve as células de tumores sólidos podem contribuir para a progressão do câncer [30] – [34]. No entanto, os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela progressão do cancro em hipoxia permanecem obscuros. Tem sido relatado que a hipóxia é um dos gatilhos para EMT [35]. No presente estudo, uma condição hipóxica EMT induzido nas linhas de tipo difuso de células de cancro gástrico OCUM-2MD3 e OCUM-12, mas não em células do tipo intestinal. câncer gástrico tipo difuso é caracterizado por doença maligna mais elevado do que o câncer gástrico do tipo intestinal [36]. O potencial de EMT de células cancerosas sob hipóxia pode ser uma das razões para o alto potencial maligno de câncer gástrico tipo difuso.

Muitos estudos têm relatado que várias moléculas podem afetar EMT de células cancerosas, incluindo TGF [23 ], [37], EGF [38], e PDGF [39]. No presente estudo, TGF estimulado EMT de OCUM-2MD3 e células OCUM-12, mas EGF e PDGF não o fez. Além disso, a indução de EMT sob uma condição hipóxica foi significativamente diminuído por anticorpos anti-TGF-p por anticorpos neutralizantes ou inibidores da fosforilação TGFβR tanto OCUM-2MD3 e células OCUM-12. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o nível de produção de TGF-p em células de cancro foi significativamente aumentada em condições de hipoxia, e os níveis de fosforilação de Smad2 e TGFβR de expressão foi aumentado por hipoxia. Vimentina é um componente característico de células mesenquimais e não é normalmente expressa em células epiteliais. Porque a expressão de

vimentina em células epiteliais desempenha um papel essencial na EMT através da interacção com actina e outros filamentos intermédios [40], vimentina foi usada como um marcador de EMT neste estudo. O nível de

expressão de vimentina

foi significativamente aumentada por hipóxia, e foi diminuída pelos inibidores da fosforilação TGFβR Ki26894 e SB431542. Estas descobertas sugerem que EMT sob uma condição hipóxica está associada com o TGFp autócrino /TGFβR sinalização no cancro gástrico do tipo difuso. Vários estudos relataram as correlações entre EMT e TGF sinalização em hipóxia. [2], [21], [23], [32], [37] No cancro gástrico, foi relatado que EMT está correlacionada com a malignidade das células cancerosas e responsável pela invasão e metástases de cancro. No entanto, os mecanismos responsáveis ​​para EMT de células gástricas cancerosas permanecem obscuros. Este documento esclareceu que EMT de células cancerosas gástricas foi induzida através de TGF sinalização sob hipóxia. inibidores TGFβR pode, assim, ser agentes promissores para o tratamento de metástase de câncer gástrico.

A hipoxia estimulado EMT de células OCUM-2MD3, mas não a das células OCUM-2M. EMT tem sido implicada na promoção da invasão e metástases de cancro. Enquanto OCUM-2MD3 é uma linha de células “filha” de OCUM-2 M [25], [34], as células OCUM-2MD3 tem um potencial mais elevado para a metástase para o peritoneu em ratinhos nus de células OCUM-2m [25], [34] . As células cancerosas livres para migrar na cavidade peritoneal são expostos a hipoxia, devido à falta de um navio de alimentação proximal [41]. O nível de expressão de

TGF-p1

ARNm sob hipóxia foi significativamente maior do que sob normoxia em todas as três linhas de células. Em contraste, o nível de expressão

TGFβRI

e

TGFβRII

ARNm foi significativamente aumentada por hipoxia em células OCUM-2MD3, mas não em células OCUM-2M. As diferentes respostas de

expressão TGFβR

entre normóxia e hipóxia pode ser uma das principais razões para a EMT induzida por hipóxia. Nós relatado anteriormente que as células cancerosas gástricas sob hipóxia mostraram EMT e altas atividades migratórias e invasivos em comparação com as células cancerosas em normoxia [34]. O up-regulação da EMT de células de câncer de hipóxia pode ser uma das razões para o maior potencial para a metástase para o peritônio em células OCUM-2MD3 comparação com células OCUM-2M.

condição hipóxica aumentou significativamente o nível de expressão de

torção

e

Zeb1

em OCUM-2MD3 e células OCUM-12, mas não em células OCUM-2M. A atividade crescente hipóxia de

Torção

e

Zeb1

expressão foi diminuída com inibidores TGFβR (Ki26894 e SB431542) em células OCUM-12. EMT em hipóxia pode ser parcialmente regulados por fatores de transcrição,

Torção

e

Zeb1.

Embora HGF afectou a morfologia das células de câncer em OCUM-2MD3 e OCUM-12 células, EMT induzida por hipoxia não foi inibida pelo anticorpo anti-HGF neutralizantes de anticorpo ou inibidor de c-Met em qualquer OCUM-2MD3 ou células OCUM-12. produção de HGF não foi detectada em OCUM-2MD3 ou células OCUM-12 sob qualquer hipoxia e normoxia (dados não mostrados). A maioria do HGF é derivado a partir de células do estroma no cancro gástrico [42]. Embora não HGF pode desempenhar um papel importante para EMT induzida por hipoxia, o HGF pode estimular EMT de células cancerosas através da interacção câncer-estromal.

O EMT induzida por hipoxia de células OCUM-2MD3 foi parcialmente inibida por inibidores TGFβR , mas vários outros inibidores, incluindo inibidores de c-Met, inibidor de PDGF, inibidor de EGFR, e inibidor de VEGFR, não teve efeito sobre o EMT induzida por hipoxia no presente estudo. Estas descobertas sugerem que outro fator (s) pode estar associada a EMT induzida por hipoxia em algumas células cancerosas. Em estudos futuros, será necessário examinar outros novos fatores que podem alterar a morfologia câncer.

Em conclusão, o autócrina TGF /TGFβR sinalização sob hipóxia pode ser um dos fatores associados com o fenótipo agressivo de EMT em células de carcinoma gástrico. TGF /TGFβR inibidores de sinalização parecem ser terapeuticamente promissora no cancro gástrico.

Informações de Suporte

Figura S1. mudanças

morfológicas de células gástricas sob uma condição hipóxica. Em MKN-7, MKN-45, MKN-74 e KATO-III, alterações morfológicas não foram encontrados sob hipóxia

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062310.s001

(TIF)