Abstract

PBX1 é um fator TALE homeodomain de transcrição envolvidos na organogênese e tumorigênese. Embora tenha sido demonstrado que as células de cancro do ovário, da mama, melanoma e dependem PBX1 para o crescimento e sobrevivência celular, o mecanismo molecular de como PBX1 promove tumorigénese permanece obscura. Aqui, nós aplicamos uma abordagem integrada através da sobreposição alvos ChIP-chip PBX1 com o transcriptoma regulado pelo PBX1 em células de cancro do ovário para identificar genes cuja transcrição foi diretamente regulada por PBX1. Nós ainda determinado se os genes-alvo PBX1 identificados em células de câncer de ovário foram co-sobre-expresso com PBX1 em tecidos de carcinoma. Ao analisar genes TCGA conjuntos de dados de expressão de microarray de carcinomas serosos ovarianos, encontramos co-regulação positiva de PBX1 e um número significativo de seus genes-alvo directos. Entre os genes alvo PBX1, uma proteína de homeodomínio MEOX1 cujo DNA ligam ao motivo foi enriquecido em sequências de ADN immunoprecipicated-PBX1 foi seleccionado para análise funcional. Nós demonstramos que a proteína interage com a proteína MEOX1 PBX1 e inibição da MEOX1 produz um fenótipo inibidor do crescimento semelhante como a supressão PBX1. Além disso, MEOX1 ectopicamente expressa funcionalmente resgatou o efeito retirado-PBX1, sugerindo MEOX1 medeia o sinal de crescimento celular de PBX1. Estes resultados demonstram que MEOX1 é um gene alvo crítica e cofactor de PBX1 em cancros do ovário

citação:. Thiaville MM, Stoeck A, Chen L, Wu R-C, G Magnani, Oidtman J, et al. (2012) Identificação de genes PBX1 alvo em células cancerosas pela Global Mapping of PBX1 Sítios de Ligação. PLoS ONE 7 (5): e36054. doi: 10.1371 /journal.pone.0036054

editor: Jindan Yu, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 9 de dezembro de 2011; Aceito: 26 de março de 2012; Publicado em: 02 de maio de 2012

Direitos de autor: © 2012 Thiaville et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela subvenção American Cancer Society bolsas NIH /NCI RSG-08-174-01-GMC e: R01CA148826, R01CA103937, R01CA129080 e U24CA160036. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

leucemia de células pré B homeobox-1 | (

PBX1

) pertence à TALE (extensão ciclo de três amino-ácido) família de proteínas homeodomain atípicos, cujas membros são caracterizados por uma inserção de três resíduos na primeira hélice do homeodominio [1]. PBX1 proteína interage com outras proteínas nucleares contendo homeodomain tais como HOX e MEIS para formar complexos de transcrição heterodiméricos. Os estudos bioquímicos têm demonstrado que PBX1 HOX e interagir através de contactos entre o homeodom�io PBX1 e uma sequência hexapeptídica conservada na proteína [2] HOX. estudos de raios-X cristalográficos ter ainda demonstrado que a dimerização-PBX1 HOXB1 é mediada pela ligação do hexapéptido HOX a um bolso em PBX1 localizado entre a inserção de três resíduos e a terceira hélice do homeodominio PBX1 [3]. A heterodimerização de PBX1 e HOX cooperativamente regula afinidade e especificidade da sua ligação a sequências alvo de ADN [4], [5].

Dado o seu papel crítico na regulação da transcrição, ele vem como nenhuma surpresa que PBX1 está envolvido em uma variedade de processos biológicos de determinação do destino da célula durante a organogénese para o desenvolvimento de cancros humanos [6], [7], [8]. Expressão de PBX1 é temporal e espacialmente regulados para controlar o desenvolvimento dos órgãos de baço, pâncreas, rim, glândula adrenal, e esqueleto [9], [10], [11], [12], e está implicada no desenvolvimento da conduta Mülleriano que mais tarde se desenvolve no trato genital feminino [13].

resultados emergentes indicaram um papel de PBX1 no câncer humano. O complexo heterodímero PBX1-HOX foi encontrada para contribuir para a actividade oncogénica no cancro da mama e melanoma. Uma proteína PBX1 negativo dominante ou HOX motivo hexapéptido que interrompeu a interacção entre PBX1 HOX e foi encontrada para reduzir significativamente a proliferação destas células cancerosas [14], [15], [16], [17]. Além disso, PBX1 atua como um fator pioneiro no câncer de mama, a remodelação da cromatina para favorecer o recrutamento de estrogênio receptor alfa (EEI) [18]. PBX1 também foi demonstrado ser um efector a jusante da via de sinalização de Notch, que é frequentemente activado no ovário, colo uterino, e determinados tipos de carcinomas da mama [8], [19], [20]. À luz do papel potencial de PBX1 em vários tipos de cancro, identificar os genes alvo de transcrição PBX1 em células cancerosas é crítica para elucidar os mecanismos oncogénicos. Neste estudo, foi realizada uma análise integrada para identificar genes cujos promotores foram ocupadas por proteínas PBX1 e cujos níveis de expressão foram regulados pelo PBX1. Nós nos concentramos em um PBX1 gene alvo direto,

MEOX1

, e demonstrou a sua participação no crescimento de células tumorais mediada por PBX1 bem como a sua interacção directa com PBX1.

Resultados

mapeamento global de sites em células de cancro do ovário

Desde PBX1 é um fator de transcrição nuclear que se liga a promotores específicos, buscou-se identificar os locais de ligação PBX1 no genoma do câncer humano utilizando análise chIP-chip obrigatório PBX1. Uma linha celular de cancro do ovário, OVCAR3, foi seleccionada porque esta linha de células foi previamente relatado para sobre-expressar PBX1, e era dependente da expressão de PBX1 para a sobrevivência celular [8]. fragmentos de DNA ligado a PBX1 enriquecidos por Chip foram hibridizados para uma matriz promotor humano contendo 18,028 promotores de genes, o que representa um total de 24,659 transcrições. IgG foi usada como controlo negativo em paralelo uma imunoprecipitação. Quaisquer picos positivos sobrepostos os do controlo de IgG foram excluídos da lista PBX1 pico. Usando um ≤0.2 relação de descoberta de falsas (FDR), foram identificados 2.299 promotores únicos que mostraram sinais de ligação PBX1 significativas (Tabela S1). Os dados do chip-chip foram então usados ​​para calcular a distribuição de ligação de pico PBX1 ao longo de todas as regiões promotoras, e verificou-se que os sítios de ligação PBX1 ocorreu em todas as regiões do promotor (Fig. 1). Nós também realizada ChIP-chip para determinar a distribuição de ARN polimerase II, H3K4me3, e H3K27me3 nas regiões promotoras (Fig. 1), e testaram a sua co-promotor de ocorrência com alvos PBX1. Os resultados indicaram que a co-ocorreram com todos os três marcadores testados promotor PBX1 de ligação, com PBX1 ARN-polimerase II, sendo o mais significativo par de co-ocorrência (Tabela S2). Não houve co-ocorrência significativa entre H3K4me3 e H3K27me3, o que indica que estas duas linhas de histona ligada aos promotores de um conjunto distinto de genes.

Os histogramas mostram a distribuição da frequência de pico de ligação em relação à sua posição sobre promotores (eixo X). Binding frequência como mostrado no eixo y foi determinada pelo número de eventos de ligação de pico em locais promotor específico. TSS:. Transcrição local de início

cofatores potenciais colaborando com PBX1

Ao analisar sequências de ADN enriquecidos por PBX1 Chip, cis-regulatórias cofatores de PBX1 puderam ser identificados por varredura motivos de ligação a DNA de os factores de transcrição previamente caracterizados. O aplicativo baseado na web Cistrome foi utilizado para esta análise (https://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/). O motivo de ligação PBX1 canónica foi encontrado a estar entre os motivos de sequência significativamente enriquecida (Figura 2 . Tabela S3). Um gráfico das distâncias entre a ligação e a sua PBX1 motivo previsto revelou uma distribuição normal (em forma de sino) (Fig. S1). Em adição ao motivo PBX1, GATA1, FOSL1, JunB e motivos do factor de transcrição foram significativamente enriquecida, sugerindo o seu envolvimento com potencial PBX1 na regulação da transcrição. Além disso, o motivo de MEIS1 que é um co-factor bem conhecido de PBX1 e o motivo “TAATTA” tanto para MEOX1 HOX e também foram enriquecidos na PBX1 chiped sequências.

exemplos seleccionados de factor de transcrição que são motivos de ligação estatisticamente enriquecido em sequências de ADN PBX1 imunoprecipitadas

PBX1 diretamente regulamentado transcriptoma

os fatores de transcrição pode funcionar tanto directamente como através de longo alcance ou mecanismos indiretos.; Assim, para identificar genes cuja transcrição foi diretamente regulada por PBX1, que se sobrepôs ao transcriptoma regulado pelo PBX1 com os genes-alvo ChIP-chip PBX1. O transcriptoma PBX1 foi identificado por meio da comparação de dados de expressão de microarranjo entre as células OVCAR3 tratados com siRNA PBX1 siRNA-tratados e controle. A eficiência de knockdown PBX1 siARN foi validado por Western blot (Fig. S2). Foram identificados 2.094 genes únicos cujos níveis de expressão foram significativamente regulada por PBX1 (FDR 0,01). As vias de sinalização canônicos enriquecido no transcriptoma PBX1 incluem sinalização de Wnt, a sinalização do receptor de insulina, e caveolar mediada por sinalização de endocitose (Tabela S4).

sobrepostas PBX1 genes alvo ChIP-chip e do transcriptoma PBX1 identificados 195 genes que foram potenciais PBX1 genes-alvo directos (Fig. 3A e Tabela S5). Analisou-se ainda mais a distribuição de genes alvo PBX1 chip com respeito às alterações na transcriptoma em células OVCAR3 tratados com PBX1 siARN. Fomos capazes de mostrar um enriquecimento significativo de metas ChIP PBX1 apenas entre genes regulada para baixo após o tratamento PBX1 siRNA (Fig. 3B). Em contraste, os alvos PBX1 chip não foram enriquecidos em genes supra-regulados ou em genes cuja expressão foi inalterada (FDR 0,01). Para determinar o potencial de co-regulação da transcrição de genes alvo PBX1, os 195 genes identificados foram cobertas com os conjuntos de dados que contêm marcas ChIP histona modificados (ver acima). Os resultados demonstraram que a maioria (~ 70%) de promotores de genes alvo PBX1 também continha H3K4me3 mas apenas ~ 2% de promotores de genes alvo PBX1 H3K27me3 contido (Fig. S3 e coluna de Q na Tabela S5). Os testes estatísticos demonstraram que os 195 genes alvo PBX1 presuntivos significativamente co-ocorreram com H3K4me3 e ARN polimerase II, mas não com H3K7me3 (Tabela S2). Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que PBX1 foi necessária para a expressão activa dos genes alvo e os promotores dos seus genes-alvo foram muitas vezes ocupado com H3K4me3, uma marca de histona associadas com genes transcritos activamente

A:. Diagrama de Venn de PBX1 genes alvo ChIP-chip e transcriptoma PBX1 revelar um conjunto de sobreposição de genes que são genes alvos diretos de PBX1. A lista completa dos genes de sobreposição é mostrada na Tabela S5. As experiências foram realizadas em células OVCAR3. B: Análise conjunto de enriquecimento de Gene foi realizada para determinar se as metas PBX1 chips estão enriquecido no transcriptoma PBX1. Genes down-regulados por PBX1 siRNA são significativamente enriquecido no PBX1 chip set-alvo.

Sete candidatos representativos, com base em suas funções conhecidas na biologia do câncer, foram selecionados entre os alvos PBX1 195 candidatos para validação usando qPCR. Os resultados confirmaram a ligação específica de PBX1 aos promotores analisados ​​(Fig. 4A), e confirmou transcrito a sub-regulação, em resposta a knockdown PBX1 para cada um destes genes analisados ​​(Fig. 4B).

. Sete genes foram escolhidos a partir da lista gene alvo PBX1 Chip, e ocupação de cada promotor de PBX1 foi validado pela análise ChIP-qPCR. Chip foi realizada utilizando IgG ou anticorpo anti-PBX1, e o ADN imunoprecipitado foi submetido a análise de qPCR utilizando iniciadores que flanqueiam o pico da região delimitada PBX1. B. regulação da transcrição desses genes alvo por PBX1 ou MEOX1 foi avaliada utilizando siRNA e análise por RT-qPCR. Expressão de todos os sete genes alvo são significativamente sub-regulada por PBX1 siRNA em relação ao controle siRNA (de Student

t

-teste,

p Art 0,01). Exceto para ZHX2, MEOX1 siRNA subregulado significativamente a expressão dos genes testados (Student

t

-teste,

p Art 0,01). validação C. ChIP-qPCR de GATA1 e MEOX1 vinculativo perto das sequências-bound PBX1. Chip foi realizada utilizando IgG, anti-GATA1, ou anticorpo anti-MEOX1 e o ADN imunoprecipitado foi submetido a qPCR utilizando mesmos iniciadores em A. Excepto para a ligação de MEOX1 para o

promotor ZHX2

, ou ligação de GATA1 MEOX1 aos promotores de genes é significativamente maior do que a ligação de IgG aos mesmos promotores (Student

t

-teste,

p Art 0,01).

para determinar se os potenciais co-fatores PBX1 identificados a partir da análise motivo descrito acima co-ocorrem com a ligação PBX1 em regiões promotoras, realizamos ChIP-qPCR para GATA1 e MEOX1 utilizando iniciadores de PCR flanqueando a sequências de PBX1 ligação de pico. A análise por Western blot demonstrou que ambos os factores de transcrição foram expressos em células OVCAR3 (Fig. S4A). ChIP-qPCR demonstrou que GATA1 obrigado a todos os promotores testados e MEOX1 estava presente em 6 de 7 testado promotores (

t

do Estudante – teste,

p Art 0,01; Fig 4C.).

a correlação da expressão do gene alvo e PBX1 em tecidos de cancro do ovário

para extrapolar a significância biológica dos genes alvo identificados PBX1 na linha de células OVCAR3 no que diz respeito a tecidos de cancro humano, foi realizada

in silico

análise usando uma expressão microarray conjunto de dados acessível ao público [21] para determinar se a expressão PBX1 foi correlacionado com seus genes-alvo em 9 diferentes tipos de tecidos de carcinoma. Um total de 86 genes alvo PBX1 candidatos foram identificados no conjunto de dados de microarray [21], e estes genes foram consultados em Oncomine. Os resultados demonstraram que o carcinoma do ovário tem um elevado nível de expressão PBX1 em comparação com os outros tipos de cancros 8 (Fig. 5). Além disso, 28 dos 86 genes consultados foram significativamente up-regulada nos cânceres de ovário, em comparação com outros carcinomas (

p Art 0,05).

meta-análise Oncomine foi realizada em um anteriormente publicada do gene do conjunto de dados de microarray expressão contendo nove tipos de tumores diferentes. Genes foram classificados de acordo com a sua sobre-expressão em cancro do ovário e os 18 melhores genes foram plotados.

O TCGA ovário dataset câncer seroso recentemente disponíveis nos permitiu realizar a análise estatística para determinar a co-regulação positiva de PBX1 e seus genes alvo em carcinomas do ovário. Entre 195 potenciais genes alvo PBX1, uma análise mais aprofundada foi realizada em um total de 137 para os quais os dados de expressão de genes estavam presentes em todas as três plataformas diferentes microarrays disponíveis do Portal CBio Cancer Genomics (https://www.cbioportal.org/public-portal /). Entre estes genes-alvo 137 PBX1, 53 genes mostrou uma tendência para a co-regulação positiva com PBX1 (odds ratio 1,5), dos quais 18 (13,1%) foram significativas (

p Art 0,05). Esse número é maior do que seria esperado pelo acaso (

p

= 0,013, teste de Qui-quadrado), porque a aplicação a mesma análise para todo o conjunto de 11,201 genes disponíveis para análise revelou que apenas 873 (7,8%) genes mostrou tanto um odds ratio superior a 1,5 e

p Art 0,05. O odds ratio e significância (

p

-valor) de co-regulação positiva de PBX1 e seus genes alvo são mostrados em colunas Tabela S5 H e I, respectivamente.

MEOX1 interage diretamente com PBX1 e resgata o efeito retiradas-PBX1

em seguida, selecionado

MEOX1

, um dos alvos diretos de PBX1, para estudos funcionais adicionais. Como PBX1, MEOX1 é uma proteína de homeodomínio e pode potencialmente interagir com PBX1 para formar complexos de transcrição heterodiméricos. Assim, perguntamos se MEOX1 e PBX1 fisicamente interagiram nas células. Uma experiência de co-imunoprecipitação foi realizada em células HEK293 transfectadas com vectores de expressão de cDNA MEOX1-FLAG-PBX1 e V5. Os resultados demonstraram que PBX1 suspenso utilizando uma proteína MEOX1 significativamente enriquecida anticorpo V5 detectado por Western blot com um anticorpo FLAG (Fig. 6A). co-imunoprecipitação recíproca confirmou que co-imunoprecipitada MEOX1 com PBX1 (Fig. 6A).

A. As células HEK293 foram transfectadas com PBX1-V5 e /ou vetores de expressão MEOX1-FLAG. Imunoprecipitação e mancha de Western foram realizadas utilizando anticorpos específicos para o epitopo tag. painel B. Esquerda: células OVCAR3 foram transfectadas com vector de expressão de MEOX1 ou vetor de controle. Western blot foi realizada para testar a expressão MEOX1 (topo). As mesmas células foram transfectadas com PBX1 ou ARNsi de controlo e de Western blot foi realizada para testar a regulação negativa da proteína PBX1 (meio). A detecção da proteína de GAPDH foi usada como um controle de carga (parte inferior). Painel direito: número de células relativas foram medidas em células OVCAR3 transfectadas com MEOX1 cDNA, PBX1 siRNA, o plasmídeo de controlo (pLPC), e controlar siRNA (siLuc). Student

t

-test foi usada para determinar a significância entre o MEOX1 grupo sobre-expressos e o grupo controle.

Nós também testamos um painel de genes regulados por PBX1 para determinar se MEOX1 estava envolvido na regulação da sua transcrição. Usando MEOX1 siRNA, descobrimos que a expressão de seis dos sete genes regulados-PBX1 também era dependente MEOX1. Além disso, descobrimos que

PBX1

transcrição era dependente MEOX1, como MEOX1 siRNA diminuiu o

PBX1

nível de mRNA. Reciprocamente, a

MEOX1

nível de mRNA foi regulada pelo knockdown PBX1. Estudos anteriores demonstraram que PBX1 foi essencial para o crescimento celular em células de cancro do ovário, incluindo OVCAR3; aqui, foi realizada siRNA knockdown para determinar se MEOX1 knockdown produziu um fenótipo semelhante a knockdown PBX1. Os resultados demonstraram que MEOX1 knockdown reduzida significativamente o crescimento celular em células OVCAR3, um fenótipo que se assemelha o efeito retirado-PBX1 (Fig. S5).

Para testar se a função mediada MEOX1 crescimento celular de PBX1, que expressa constitutivamente MEOX1 (conduzido por um promotor de CMV) e suprimiu a expressão PBX1 utilizando siARN. Descobrimos que a expressão MEOX1 células constitutivas parcialmente protegidos de supressão do crescimento induzida por retirada PBX1, como foram observados significativamente maiores números de células em células transfectadas com MEOX1 em comparação com células de controlo transf ectadas com o plasmídeo (Fig. 6B). Estes achados sugerem que MEOX1 é um mediador essencial do sinal de crescimento relacionado com a PBX1, embora a expressão de si MEOX1 não é suficiente para estimular a proliferação celular (Fig. S6).

Discussão

A caixa homeo família de genes, o que é fundamental na regulação da transcrição, codifica proteínas nucleares contendo homeodomains de ligação a DNA altamente conservadas [22]. proteínas homeobox estão envolvidos em atividades críticas durante o desenvolvimento e tumorigênese. Neste relatório, é focada sobre um dos genes homeobox, PBX1, que se verificou desempenhar um papel crítico no cancro do ovário, com a intenção de identificar e caracterizar a sua rede de transcrição em células cancerosas. análise que integra de promotores de genes ligados por PBX1 e do transcriptoma PBX1 permitiram identificar genes diretamente regulados por PBX1.

A robustez do nosso ensaio ChIP-chip do genoma é evidenciado pela observação de que o motivo PBX1 canônico é altamente enriquecida nas sequências PBX1 chiped. Nós demonstramos que as metas ChIP 195 PBX1 significativamente sobreposto com ocupação promotor de ARN polimerase II e H3K4me3, uma marca de histona associadas com transcrição activa, mas não com H3K27me3, uma marca de histona associadas com a repressão da transcrição. Além disso, verificou-se que as metas fichas era significativamente enriquecida apenas entre genes cuja transcrição é apoiado por PBX1 (reprimidos por PBX1 siRNA), mas não entre os genes cuja transcrição é reprimida ou não afectada por PBX1. Estes dados tomados em conjunto apoiar a visão de que PBX1 serve principalmente como um activador da transcrição em vez de um repressor em células de cancro do ovário.

O estudo também revelou potenciais cis-regulatórias cofatores de PBX1, que incluem GATA1, FOSL1, MEIS1 , JUNB, e um motivo “TAATTA” para MEOX1 [23] e HOX [24]. Os motivos de estes co-factores de transcrição foram significativamente enriquecida em sequências de ligado-PBX1, sugerindo que estas proteínas podem funcionar em conjunto com PBX1 para facilitar a regulação da transcrição. Curiosamente, vários destes potenciais co-factores, incluindo PBX1 BCL6 e MEOX1, foram também identificados sendo directamente regulada pela PBX1, sugerindo um controlo transcricional de auto-regulação destes genes. O estudo incidiu sobre MEOX1 para avaliar a sua actividade de co-regulação co-ligação e com PBX1. Outros experimentos devem ser realizados para determinar se outros cofatores servem como fatores de co-regulação com PBX1 em células cancerosas.

Outro achado interessante neste estudo é a identificação de um novo papel do MEOX1 na patogênese do câncer. Embora MEOX1 está bem estabelecido como um dos principais reguladores da transcrição durante o desenvolvimento embrionário, os nossos resultados demonstram que MEOX1 também está envolvida no desenvolvimento de cancro através de participar na rede PBX1 transcricional. O facto de MEOX1 é co-regulada positivamente com PBX1 em um subconjunto de carcinomas do ovário (Fig. 5) sugere que um eixo molecular PBX1-MEOX1 está envolvido na regulação da transcrição destes carcinomas. Com base neste raciocínio, foi realizado um ensaio de “resgate” por expressar ectopicamente MEOX1 em células cancerosas com knockdown PBX1. Nosso resultado mostra que a expressão MEOX1 reverteu o efeito inibidor do crescimento de knockdown PBX1 sugere que MEOX1 medeia a função de apoiar o crescimento de PBX1 em células de cancro do ovário. Ambos PBX1 MEOX1 e pertencem à família homeodom�io, cujos membros normalmente interagem com outras proteínas homeodomain para gerar complexos de proteínas heterodiméricas que são os mediadores funcionais de regulação da transcrição. Na verdade, a experiência de co-imunoprecipitação de proteínas demonstrou interacção PBX1 e MEOX1, sugerindo que MEOX1 pode ser um co-factor crítico homeodomínio de PBX1. Assim, PBX1 parece actuar não só como um regulador a montante, mas também como um co-factor obrigatório de MEOX1. Esta descoberta é uma reminiscência de um estudo anterior mostrando que PBX1 e HOXB1 cooperar na regulação da atividade expressão HOXB1 em tecidos de camundongos [25]. Ele pode ser previsto que este ciclo auto-regulação positiva opera para garantir a atividade transcricional sustentada de outros genes PBX1 regulado.

Os resultados relatados aqui representam um primeiro passo para a compreensão da rede de regulação complexa de PBX1 em carcinomas. Como o papel da PBX1 em tumores sólidos humanos está a emergir, os genes alvo directamente controladas por PBX1 aqui relatado servirá como passos para decifrar como PBX1 contribui para o desenvolvimento do tumor. Este estudo também levanta várias questões importantes ainda a ser abordados. Por exemplo, seria interessante para testar se os genes regulados PBX1 identificados no carcinoma do ovário são compartilhados com o equipamento a funcionar durante o desenvolvimento de órgãos. Uma vez que a sobre-expressão de PBX1 MEOX1 e é relativamente específico para o cancro do ovário, em comparação com outros tumores sólidos (Fig. 5), o significado biológico da PBX1 e MEOX1 co-expressão e a sua cooperação na regulação da transcrição são susceptíveis de ser conjuntura e dependente de tecido . A partir desta perspectiva, seria importante para determinar se MEOX1 modula a afinidade e selectividade sequência alvo ligação do complexo PBX1 transcrição no câncer de ovário, e, finalmente, seria interessante determinar como PBX1 /MEOX1 formação do complexo promove oncogênese.

Materiais e Métodos

linhas celulares

As linhas de células utilizadas neste estudo incluiu uma linha de ovário célula cancerosa, OVCAR3, e uma linha de células epiteliais de rim embrionário, HEK293. Ambas as linhas celulares foram adquiridas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia). As linhas de células foram mantidas em RPMI1640 suplementado com soro fetal bovino a 5% e antibióticos. Não havia nenhuma evidência de contaminação por micoplasma baseado em um ensaio de PCR.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) Análise

Para cada imunoprecipitação, aproximadamente 12 × 10

foram utilizados 6 OVCAR3 células. As células foram colocadas em placas em pratos de 150 mm e cultivadas até 80% confluentes. As células foram fixadas por adição de formaldeído (1% de concentração final) aos meios de cultura e a incubação durante 10 min. A reacção foi extinta com glicina 125 mM durante 5 min. As células foram lavadas em DPBS, núcleos estavam inchados em núcleos em tampão de inchamento (PIPES 5 mM, pH 8,0, KCl 85 mM, 0,5% de NP 40), e lisadas em tampão de lise núcleos (1% de SDS, EDTA a 10 mM, Tris-HCl 50 , pH 8,0). núcleos lisadas foram sonicados em um modelo Fisher 100 sonicador por 5 ciclos de pulso constante, 40 seg, com 2 min de incubação de gelo entre pulsos. Os lisados ​​sonicados foram diluídos em tampão de diluição de chip (0,01% de SDS, 1,1% de Triton X-100, EDTA 1,2 mM, Tris-HCl a 16,7, pH 8,0, NaCl 167 mM) e incubada com proteína G-Sepharose (Invitrogen) durante 1 h. As esferas foram removidas, e afastada do grânulo lisados ​​foram incubados com anticorpos contra PBX1, GATA1, ou MEOX1 (Santa Cruz SC-899, SC-265 ×, e Epitomics T2204, respectivamente) durante a noite com rotação a 4 ° C. Uma lama de Proteína 01:01 BSA bloqueou-G-Sepharose foi adicionado ao anticorpo lisados ​​incubados e rodado a 4 ° C durante 2-3 horas. complexos de anticorpo-proteína ligada a esferas foram lavadas uma vez com tampão de baixo teor de sal (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, Tris-HCl a 20, pH 8,0, NaCl 150 mM), uma vez com tampão de LiCl (0,25 M de LiCl, 1% de NP 40, 1% desoxicolato de sódio, EDTA 1 mM, Tris-HCl a 10, pH 8,0), e duas vezes com TE, pH 8,0. Os complexos foram eluídos a partir de grânulos por incubação em 1% de SDS, 0,1 M de NaHCO

3 (aquecida a 65 ° C) durante 30 min a 37 ° C com agitação. As amostras foram tratadas com 200 mM de NaCl e 1 ug de ARNase A a 65 ° C durante a noite. Após 1 h de tratamento com proteinase K a 37 ° C, o DNA foi purificado utilizando o kit Qiagen de purificação de PCR QIAquick e eluiu-se em 100 ul de TE.

Para a análise qPCR, 2,5 uL de amostra foi utilizada por reacção. A PCR foi realizada utilizando SYBR verde e um corante iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA). Os números do ciclo limiar (TC) foram obtidos utilizando o software de interface do sistema Optical iCycler. Os iniciadores de PCR foram concebidos utilizando o programa Primer 3 (sequências de nucleótidos dos iniciadores são apresentadas na Tabela S6). Os dados foram normalizados utilizando uma curva padrão, que foi preparada a partir de ADN de entrada sonicado (total).

ChIP-chip array Análise

Para a análise matriz ChIP-chip, chip foi realizada como descrito acima, excepto para o passo de purificação do ADN. O ADN foi purificado utilizando o kit de purificação de PCR da Qiagen MinElute e eluiu-se com 10 ul de H2O. Toda a amostra de ADN imunoprecipitado foi amplificado utilizando um kit de WGA2 (Sigma) e purificado utilizando o kit Qiagen de purificação de PCR QIAquick com um volume de eluição de 40 ul de H2O. Para ADN de entrada, 200 ng de ADN purificado foram utilizados para WGA2 PCR. Uma alíquota de cada amostra amplificada foi diluída para 5 ng /ul e utilizado para qPCR. Se 4 ug de ADN não foram produzidos a partir da WGA2 PCR, 10 ng de a reacção WGA2 foram novamente amplificados utilizando o kit WGA3 (Sigma), e testado com os iniciadores de controlo novamente. Alíquotas de cada amostra (4 ug) foram enviados para NimbleGen para a rotulagem e hibridação array. O promotor NimbleGen 385K RefSeq matriz 1-Plex foi utilizada para a hibridação da amostra.

Para a análise de matriz, o programa NimbleGen Mapa sinal foi usado para obter picos de sinal para cada amostra e mapear esses picos às suas regiões genômicas correspondentes. Usando os GenomicRanges pacote Bioconductor (disponível em bioconductor.org), nós analisamos as regiões de pico de alvo ChIP-chip com FDR≤0.2 para sobreposição com picos de IgG ChIP-chip não-específica e descartados aqueles picos com pelo menos uma sobreposição pb. Os picos restantes do alvo ChIP-chip foram considerados positivos para a ligação às proteínas.

análises dos motivos pesquisados ​​foram realizadas utilizando a ferramenta de descoberta seqpos motif (Cistrome, https://cistrome.org/ap/root) eo TRANSFAC banco de dados motivo com o seguinte parâmetro: largura do pico a ser digitalizado = 600 pb;

p

. 0,05 foi definido como o limiar de significância

Gene Expression matriz Análise

RNA foi isolado a partir de células OVCAR3 que foram tratados previamente com qualquer PBX1 siRNA ou controlo siRNA alvejando gene da luciferase. rotulagem de ARN, a hibridação com a HT-12 de expressão de matriz Ilumina humana, e análise de normalização foram realizados pela facilidade da família de Lowe Genomics Core, Johns Hopkins Bayview Medical Center. A mudança de nível de dobragem de cada gene de expressão foi calculada como a razão de tratamento para controlar PBX1 siARN. Como só havia uma matriz em cada momento, foi utilizado o logaritmo da mudança vezes como a estatística de teste, e realizou uma análise de importância para calcular o

p

-valor, que foi definido como a probabilidade de obter um teste estatística de pelo menos tão extrema como a que realmente observado sob a hipótese nula. Para a distribuição nula assumimos a estatística de teste seguiram uma distribuição normal, onde a média eo desvio-padrão foram estimados a partir das amostras de controlo. Nós também implementado o procedimento de Benjamini e Hochberg [26] para o teste de hipóteses múltiplas, e estima a taxa de descoberta de falsas (FDR) de genes expressos de forma significativa. Significativamente regulada para cima e para baixo genes regulados foram finalmente determinada por um predefinido FDR corte. 0,01

O teste estatístico para a sobreposição de genes entre conjuntos de dados de matriz

Para avaliar a significância de sobreposição entre os conjuntos de dados (ou seja, entre chip-fritas e entre 195 genes-alvo e chip-chip), determinou-se a probabilidade de obter o mesmo número ou mais genes sobrepostos por amostragem aleatória do conjunto completo de genes. O número de genes no conjunto completo era 18.511 para Chip-chip e 30.500 para a matriz de expressão. O

p

-valor foi calculada pela determinação das probabilidades de cauda superiores da distribuição hipergeométrica correspondente utilizando phyper () função em R versão 2.14.1.

O teste estatístico para a co-expressão entre PBX1 e seus genes-alvo

os Z-scores de dados de expressão de mRNA do estudo do cancro do ovário TCGA foram recuperados do cancer Genomics Data Server (CGDS) hospedado pelo Memorial-Sloan-Kettering cancer Center (http: //www. cbioportal.org/) utilizando o pacote 1.1.19 CGDS-R (https://cran.r-project.org/web/packages/cgdsr/index.html). Os escores Z foram calculados utilizando tumores diplóides (diplóides para cada gene) como a população de referência, e apenas genes representados por todas as três plataformas de expressão utilizados no estudo foram incluídos TCGA [27]. Um total de 11.202 genes de 316 amostras de tumores com escores-Z foram recuperados para análise

Sobre-expressão de cada gene foi definida por um Z-score . 1.65 (representando o top 5% na expressão de mRNA). A tendência da co-superexpressão de PBX1 e seus genes alvo na mesma amostra foi avaliada no conjunto de amostras 316 tumor, e odds ratio (OR) foram calculados.