Abstract

metástase de fígado é a principal causa de mortalidade por cancro colorectal (CRC). No entanto, os mecanismos subjacentes a este processo são largamente desconhecidos. A osteopontina (OPN) é uma glicoproteína fosforilada segregada que está envolvido na migração de tumores e metástases. O papel do OPN no câncer está claro. Neste estudo, a OPN do mRNA foi examinada em tecidos de CRC, mucosa normal adjacente, e as lesões metastáticas no fígado utilizando a análise quantitativa por PCR em tempo real. A expressão da proteína de OPN e seus receptores (aV da integrina e CD44 v6) foi detectada usando um imuno-histoquímica (

IHC

) método. O papel da OPN nas metástases do fígado foi estudada em cancro do cólon estabelecido linhas de células SW-480 transfectadas com plasmídeos de expressão eucariótica sensoriais ou anti-sentido-OPN por citometria de fluxo e ensaio de adesão de células Colo-205 e. Florescence redistribuição após a fotodegradação (FRAP) foi usado para estudar défice de comunicação intercelular funcional (GJIC) entre as células OPN-transfectadas. Verificou-se que a OPN foi altamente expressa em lesões hepáticas metastáticas de CRC CRC comparação com o tecido primária e da mucosa normal adjacente. A expressão de ARNm de OPN em tecidos de tumor foi significativamente relacionada com as fases de CRC. expressão OPN foi também detectada em hepatócitos normais circundantes lesões metastáticas CRC. Dois receptores conhecidos de OPN, aV da integrina e proteínas de CD44v6, foram fortemente expressos em hepatócitos de fígado normal. células CRC com expressão OPN forçada apresentaram maior adesão heterotípica com células endoteliais e comunicação intercelular enfraquecida. OPN desempenha um papel significativo no CRC metástase para o fígado através da interacção com os seus receptores nos hepatócitos, diminuição da adesão homotípica e heterotípica de adesão reforçada

citação:. Huang J, Pan-C, H, Hu, Zheng S, Ding L ( 2012)-osteopontina avançado hepática metástase de células de cancro colorrectal. PLoS ONE 7 (10): e47901. doi: 10.1371 /journal.pone.0047901

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de maio de 2012; Aceito: 18 de setembro de 2012; Publicação: 24 de outubro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma Fundação de Ciência Natural da China (81102012; https://www.nsfc.gov.cn/), Zhejiang projecto talentos Qianjiang (2011R10029; https://kjt.zj.gov.cn/) e Zhejiang medicina projectos do fundo de pesquisa científica (2010ZB073; https://www.zjtcm.gov.cn/) para LD. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) continua a ser a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos [1]. Aproximadamente 50% de pacientes de CRC tem metástases no fígado, mas apenas 10% -20% destes doentes pode ser submetido a ressecção cirúrgica. A taxa de sobrevida em 5 anos após a ressecção cirúrgica do tumor metastático é de apenas 30% a 40% [2], [3] .Os mecanismos moleculares subjacentes CRC metástases não são completamente compreendidos, mas evidências recentes sugerem que osteopontina (OPN) desempenha um papel na regulando a metástase das células do cancro do cólon [4].

OPN é uma fosfoglicoprote�a que é originalmente isolada de matriz óssea mineralizada [5], é também frequentemente secretado por diferentes tipos de células cancerosas, essenciais para o crescimento e metástase de câncer de mama [ ,,,0],6], próstata [7], [8], hepática [9], o melanoma [10], e outros tumores [11]. OPN sinais através de moléculas de adesão celular, tais como as integrinas CD44 e [12], [13]. Estudos de perfil genético identificaram uma correlação entre tumores colo-rectal avançado e metastáticos e expressão elevada de OPN [14]. A grande influência de OPN em potencial metastático é através da adesão celular e migração através proteins22 matriz extracelular. No entanto, os papéis funcionais e mecanismos subjacentes de OPN na metástase colorectal não foram estabelecidos.

Aqui, nós investigamos o papel de OPN na metástase do cólon para o fígado e os mecanismos pelos quais OPN promove a actividade metastática do cancro do cólon.

Materiais e Métodos

os pacientes

amostras tumorais de 44 casos de CRC e 20 pacientes com metástases hepáticas no Segundo Hospital Afiliado da Universidade de Zhejiang foram obtidos frescos de ressecções cirúrgicas com prévia consentimento. A idade mediana dos pacientes era de 57 anos em funcionamento, variando de 25 a 84. As características patológicas, incluindo a localização do tumor, a fase, e a diferenciação foi gravado. Este estudo obteve a aprovação de ética em pesquisa humana do Comitê de Ética da Segunda Hospital Filiado, Faculdade de Medicina, Universidade de Zhejiang.

Cultura celular

Duas linhas celulares de adenocarcinoma colorretal Colo-205 e células SW480 foram obtidos a partir do Instituto do cancro da Universidade de Zhejiang e mantidas em RPMI-1640 com soro de vitelo a 10%, a 37 ° C com 5% de CO

2.

quantitativa PCR em tempo real

As amostras de tecido foram snap-congelados imediatamente após a ressecção cirúrgica. O ARN total foi isolado utilizando Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. a integridade de ARN foi analisada por electroforese em gel com 1% de gel de formaldeído. 2,0 ug ARN total foi transcrito inversamente com o kit de RT-PCR Super Script II (Invitrogen). PCR em tempo real foi realizada em um volume final de 50 ul contendo 1 ul de RT transcrição, 5 uM de cada iniciador, 0,5 unidades de polimerase de ADN AmpliTaq (Invitrogen). Como um controlo positivo interno, a análise por PCR em tempo real foi executada no gene GAPDH em paralelo. Foram utilizados os seguintes iniciadores: iniciador de sentido directo do OPN 5′-CAA ATACCCAGATGCTGTGGC-3 ‘; OPN iniciador inverso 5’-TCCTGGCTGTCCACATGGTC-3 ‘; GAPDH iniciador directo 5’-CTTAGCACCCCTCCCCAAG-3 ‘; GAPDH iniciador inverso 5’-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3 ‘. OPN sonda TaqMan 5’-TGACCCTACTCAGAAGCAGAATCTCCTAGCC-3 ‘; sonda GAPDH TaqMan 5’-CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA-3 ‘. As amplificações de PCR foram realizadas num formato de placa de 96 poços de reacção e os sinais de fluorescência foram detectados com um PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detector (Perkin-Elmer). Os sinais de fluorescência foram convertidos para C

valores T (limiar de ciclo; correspondente ao número do ciclo em que um aumento significativo no sinal de fluorescência foi detectada pela primeira vez). O nível de expressão de mRNA de OPN OPN = C

valor T /GAPDH C

valor T.

produtos de PCR foram sujeitos a electroforese em géis de agarose e coradas com brometo de etídio e fotografados. Os produtos de PCR do tamanho esperado foram clonados num vector pGEM-T-Easy (Promega) e as sequências dos plasmídeos resultantes foram confirmados.

Antisense- e Sense-OPN Os plasmídeos de expressão eucariótico

para obtainan anti-sentido plasmídeo de expressão de OPN, é gerado um fragmento de ADNc de 201 pb (210-368) utilizando PCR com iniciadores OPN como mencionado acima. fragmento de ADNc foi então clonado no

EcoR

local I da pcDNA 3.1 (+). A direcção inversa do ADNc clonado foi confirmada por sequenciação de ADN (O vector é designada OPN-anti-sentido).

A grelha de leitura aberta (ORF) de OPN foi obtido por RT-PCR. OPN primário F: 5′-CCG ACC AAG GAA AAC TCA CT – 3 ‘, R: 5′- CTC CTT TTA ATT GAC CTC AG – 3’. Os 974 pb produtos de PCR foram clonados num vector pGEM-T-Easy e sequenciado em ambas as cadeias utilizando o ABI PRISM ™ 377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer). A ORF do OPN foi então clonado num vector de expressão eucariótica pcDNA 3.1 (+) para gerar 3,1 pcDNA-OPN (ORF). (O vector é designada OPN-sentido).

expressão estável Linhas Celulares

Os plasmídeos de OPN-antisense, OPN-sense e pcDNA3.1 (+) foram linearlized com

Bgl

digestão durante 4 h. transfecção de ADN foi realizada utilizando o Superfect Transfection Reagent (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. Após 48 horas, as células transfectadas foram seleccionadas com G418 durante 3 dias. Os clones seleccionados foram reunidas e expandido. As linhas celulares estabelecidas foram confirmados com análise parafuso Ocidental RT-PCR e.

In Situ

mRNA Hibridização (

ISH

)

sondas específicas que completem o ARNm de OPN foram concebidos com base no GenBank J04765 (ARNm osteopontina humana, cds completas). Estas sequências de oligonucleótidos tem 100% de homologia com o gene OPN e homologia mínima com outras sequências de genes de mamíferos, procurou no GenBank pela explosão. DIG RNA kit de etiquetas (SP6 /T7) (Roche) foi utilizado para gerar tanto sentido e anti-sentido. tecidos embebidos em parafina foram seccionados em 4 μ m. As lâminas foram desparafinadas e tratadas com 0,2% de M. HCl durante 20 min. Depois de digerido com proteinase K, as lâminas foram incubadas com solução de pré-hibridação (contendo 500 ug /ml de poli (A)) a 42 ° C durante 30 min numa câmara de humidade. A solução foi substituída por solução de hibridação (contendo 0,3 ug /ml de sentido ou anti-sentido sonda de ARN de cadeia simples, respectivamente, 50% de formamida, 10% dextransulfate, e 2 x SSC), e depois hibridizou a 42 ° C durante a noite. Depois lavou-se com 2 x SSC e 1 x SSC durante 15 min sucessão, as lâminas foram bloqueadas com PBS contendo 5% de albumina de soro de bovino durante 10 min, incubadas com anti-ratinho-digoxina anticorpo marcado com biotina durante 30 minutos e, em seguida, com phosphoesterase alcalino -affinitin durante 30 min. NBT-BCIP foi utilizado para corar lâminas em pH 10 tampão de substrato. Após a desidratação, as lâminas foram montadas com meio de montagem aquoso (Sigma).

Análise Imunohistoquímica

Rat anti-humana anticorpo monoclonal osteopontina (Chemicon, Billerica, MA) foi utilizado para

IHC

. Todas as secções (5 um de espessura) a partir de blocos de tecido embebidos em parafina e fixados em formalina foram montadas em lâminas de vidro revestidas com gelatina. Para aumentar a exposição ao antigénio, os slides foram tratados com 1 × EDTA a 98 ° C durante 10 min para recuperar o antigénio. As lâminas foram incubadas com solução de bloqueio de peroxidase endógena inibem a peroxidase endógena, em seguida, foram incubadas com o anticorpo primário (quer anti-OPN anticorpo monoclonal de ratinho (Akm2A1; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a uma diluição de 1:200, ou anticorpo monoclonal integrina aV (P2W7; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a uma diluição de 1:200, ou anticorpo monoclonal de CD44v6 (MAB-0038; Maixin, Fujian, China), a uma diluição de 1:100) à temperatura ambiente durante 60 min. Depois de lavado com solução salina tamponada com Tris, as lâminas foram incubadas durante 15 minutos com anticorpo secundário conjugado com biotina, lavadas e depois incubadas com a enzima conjugada com HRP (peroxidase de rábano) -streptavidin. Recentemente preparado DAB (Zymed, South San Francisco, CA) foi utilizado como substrato para detectar HRP. Finalmente, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina e montadas com meio de montagem aquoso.

Adesão Celular Ensaio

monocamada Colo-205 e células SW-480 foram mantidas em Ø 35 pratos mm e médio normal até 70% -80% de confluência. células fixadas foram, então, sobreposto sobre a monocamada de células, misturou-se bem e incubou-se durante diferentes períodos de tempo.

células flutuantes foram recolhidas após incubação durante 10 min, 20 min, 30 min e 40 min, e o número foi contado utilizando um hemocitómetro. rácio de adesão celular foi então calculada: relação de aderência = (soma das células acrescentado células em suspensão) /soma das células de amostra. ensaio de adesão homotípica foi realizada com linhas celulares mesmos, cada um deles entre células de endotélio dos vasos umbigo ECV 304 células foi utilizado, respectivamente, no ensaio de adesão heterotípica.

Análise por Citometria de Fluxo

1 × 10

6 /ml de amostras de células foram suspensos em PBS cuidadosamente, misturada com o anticorpo CD44-FITC 20 ul, controlado com 20 ul de IgG1 /2a anticorpo, células incubadas com Ab à TA durante 20 min. Lavados com PBS, misturado com 1% paraformal-dehyde, então detectado com FAC Scan (empresa BD, Cell Missão TM Versão 3.3 do software).

Gap-fluorescência redistribuição Após Fotodegradação (Gap-FRAP) Método

As células de 80% de confluência foram examinados para redistribuição fluorescência após a fotodegradação. As células lavadas com Hanks (Ca

2+, Mg

2+), incubada 15 min com 10 ug /ml de 5 (6) diacetato -carboxyfluorescein (CFDA) em 37 ° C, 5% de CO

2 . Depois de lavados pela PBS, uma célula adjacente a outras células foi selecionado e sua fluorescência foi Foto-descoloração sob LEICA TCS-SP microscópio co-foco do laser (argônio feixe de laser ion, 518 nM, programa /lampse Tempo de fotodegradação e digitalização, software Fisiologia para a imagem e de dados). As imagens digitais da emissão fluorescente excitado por pulsos de laser fracos foram registrados em intervalos regulares durante 12 minutos (período de digitalização 1 minuto antes e após a fotodegradação) e armazenados para posterior análise. Em cada experiência, um marcado, isolado de células não branqueada foi deixado como uma referência para a perda de fluorescência devido à verificação repetida e infiltração de corante, e, uma célula isolada branqueada serviu como um controlo.

Análise estatística

Os dados são expressos como média ± SEM. Emparelhados-amostras

t

teste, independente de amostras

t

de teste e one-way ANOVA foram utilizados. Computações foram realizadas usando SPSS 13.0.

P

valores inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

Expression OPN na Primária CRC, CRC metastático lesões no fígado e tecidos normais

Based em quantitativo em tempo real os valores de PCR, C

T estão em proporção inversa do valor de log dos números de cópia original de sequência alvo. Descobrimos que mRNA OPN foi expressa em 44 casos de tecidos CRC mas em diferentes níveis; a máxima C

valor T foi de 1,47 eo valor mínimo foi de 0,85, ±

s

= 1,15 ± 0,14. Quando emparelhado com amostras normais adjacentes, o máximo C

valor T foi de 1,75 eo valor mínimo foi de 0,94, ±

s

= 1,32 ± 0,18. (Emparelhados-amostras

t

teste,

t

= 5,81,

P

= 0,000). A expressão de mRNA OPN foi significativamente aumentada no tecido CRC primária em comparação com tecidos normais vizinhos.

ISH

, a mancha positiva apresenta azul-violeta com um microscópio. O ARNm do OPN, que indica um sinal positivo, foi encontrada no citoplasma de células de CRC em lesões primárias (400x). b, A mancha em tecidos normais adjacentes colorretal foi negativa (× 400). C, OPN mRNA foi encontrado no citoplasma das células de tecido metastático CRC fígado. tecidos do fígado normais adjacentes manchas negativo (× 100).

Em 20 de tecidos metastáticos fígado examinadas de CRC, o máximo C

valor T foi de 1,30 eo valor mínimo foi de 0,92, ±

s

= 1,07 ± 0,10. Em comparação com o câncer primário, a expressão de mRNA OPN em tecidos metastáticos do fígado foi maior (-amostras independentes

t

teste,

t

= 2,12,

P

= 0,038).

com base no estágio Dukes, sete do total de 44 pacientes CRC estavam em fase a e o mRNA OPN dizer C

valor T foi de 1,49 ± 0,38, 1,21 ± 0,28 para a fase B (17 pacientes), 1,11 ± 0,29 para a fase C (18 pacientes), e 0,92 ± 0,32 para a fase D (2 pacientes). O nível de expressão de mRNA OPN em tecidos CRC em fase inicial foi significativamente maior do que em estágio avançado (one-way ANOVA,

P

= 0,031).

Em seguida, usamos

ISH

análise para avaliar ainda mais a expressão do mRNA OPN e localização. Nesta análise, o positivo parece azul-púrpura sob o microscópio. OPN ARNm, que aparece coloração sinal, foi encontrada no citoplasma de células de CRC em ambas as lesões primárias e tecido metastático do fígado. O sinal de coloração não foi detectada em colorectal normal adjacente e tecidos normais do fígado (

Fig. 1