Abstract
Fundo
O câncer é causado por alterações de ADN somáticas tais como mutações pontuais genéticas, as aberrações no número de cópias de DNA (CNA) e variantes estruturais (SVS). análises de todo o genoma de VV em grande série de amostras com informações clínico bem documentado ainda são escassos. Consequentemente, o impacto da SVs sobre carcinogênese e resultado para o paciente permanece mal compreendido. Este estudo teve como objetivo realizar uma análise sistemática de genes que são afectados por quebras cromossômicas CNA-associados no cancro colorectal (CRC) e determinar a relevância clínica destes genes ponto de interrupção recorrentes.
Métodos
Primária amostras de CRC dos pacientes com doença metastática do Cairo e CAIRO2 ensaios clínicos foram caracterizados anteriormente pela hibridização genômica matriz comparativa. Estes dados foram agora usado para determinar a prevalência de quebras cromossômicas CNA-associados dentro de genes em toda 352 amostras de CRC. Além disso, estado de mutação do comumente afetadas
APC
,
TP53
,
KRAS
,
PIK3CA
,
FBXW7
,
SMAD4
,
BRAF
e
ARN
genes foi determinada para 204 amostras de CRC por sequenciamento paralelo maciço alvo. relevância clínica foi avaliada mediante a estratificação de pacientes com base em mutações genéticas e pontos de interrupção de genes que foram observados em . 3% dos casos CRC
Resultados
No total, foram identificados 748 genes que foram recorrentemente afectados por quebras cromossômicas (FDR 0,1).
MACROD2
foi afectada em 41% das amostras de CRC e mais 169 genes apresentaram pontos de interrupção em 3% dos casos, indicando que a prevalência de pontos de interrupção de genes é comparável à prevalência de mutações pontuais bem conhecidas de genes. estratificação dos pacientes com base em pontos de interrupção de genes e mutações pontuais revelou um subtipo CRC com prognóstico muito pobre.
Conclusões
Nós concluímos que quebras cromossômicas CNA-associados dentro de genes representam um subconjunto altamente prevalentes e clinicamente relevante dos SVs no CRC
Citation:. van den Broek E, Dijkstra MJJ, Krijgsman O, Sie D, Haan JC, Traets JJH, et al. (2015) alta prevalência e relevância clínica dos genes afetados por quebras cromossômicas no câncer colorretal. PLoS ONE 10 (9): e0138141. doi: 10.1371 /journal.pone.0138141
editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPÃO
Recebido: 05 de março de 2015; Aceito: 25 de agosto de 2015; Publicação: 16 de setembro de 2015
Direitos de autor: © 2015 van den Broek et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability: Array-CGH dados tenham sido depositados em Gene Expression Omnibus NCBI (GEO número de acesso GSE63216; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)
Financiamento:. Este estudo foi financiado por doações do VUmc -Câncer Center Amsterdam (E. van den Broek) eo Cancer Society Holandês (KWF-2007-3832) e realizada no âmbito do Centro de Translational Molecular Medicine, projeto decodificar (concessão 03O-101) eo câncer colorretal Holandês grupo (DCCG). Esses financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
introdução
O câncer é causado por aberrações cromossômicas que impulsionam a iniciação e progressão tumoral. Oncogene activação e inactivação de genes de supressão tumoral pode ser causada por várias classes de aberrações de ADN somáticas, incluindo mutações não sinónimas (pontuais), aberrações numéricas cópia cromossómica (ANC) e variantes estruturais (SVS) [1]. VV representam deleções, inserções, inversões, translocações e intra- e inter-cromossómicas, todos os quais envolvem quebras cromossómicas [2]. Curiosamente, enquanto mutações pontuais e número de mudanças de cópias de ADN foram examinados extensivamente, os efeitos de genes com quebras cromossômicas são mal caracterizadas. Tomando o cancro colorectal (CRC) como um exemplo, até à data vários em-frame genes de fusão foram relatadas, incluindo
VTI1A-TCF7L2
,
NAV2-TCF7L1 Comprar e as fusões-espondina R
EIF3E-Rspo2
PTPRK-Rspo3 Comprar e [3-5]. As fusões-espondina R ativar a via de sinalização Wnt e são mutuamente exclusivos com
APC
mutações, indicando que estas translocações causar alterações na proteína ganho de função. Alternativamente, VV também pode causar alterações de perda de função. Por exemplo, a exclusão da códon de parada do
EpCam
gene resulta em uma transcrição ler-through que faz com que a hipermetilação e, consequentemente, o silenciamento do gene de reparo incompatível adjacente
MSH2
[6]. No entanto, apesar destes exemplos intrigantes, investigação completa de SVs no CRC tem sido dificultado pela falta de informações sobre o genoma profunda sequenciamento inteiro em grande série de amostras. Consequentemente, o impacto putativa de SVs no (colorretal) o desenvolvimento do tumor é provavelmente altamente subestimada.
Nós hibridização genômica (array-CGH) função matriz de análise comparativa de alta resolução previamente realizada em uma série de cerca de 350 amostras de CRC primárias de pacientes que desenvolveram doença metastática e participou do Cairo e CAIRO2 de fase III de ensaios clínicos [7-9]. No presente estudo, utilizamos esses dados para determinar as posições genômicas de pontos de interrupção cromossômicas, com base no pressuposto de que mudanças intra-cromossômicas em CNA-status só pode ser explicada por mecanismos que envolvem quebras cromossômicas. Embora tal análise não fornece uma visão abrangente de SVs no genoma do câncer, a hipótese de que esta análise seria identificar um subgrupo substancial de SVs com uma resolução suficiente para alocar quebras cromossômicas a posições de genes. Além disso, nós antecipamos que os eventos recorrentes não aleatórios entre as amostras de CRC iria revelar genes que aumentam o desenvolvimento do tumor. Aqui, mostramos que esta abordagem revelou 748 genes de ponto de interrupção recorrentes e demonstrar o seu impacto sobre a classificação CRC.
Materiais e Métodos
Copiar número associado aberração cromossômica de detecção de ponto de interrupção
Os pacientes selecionados para o estudo atual participou de qualquer um dos dois multicêntrico de fase III de ensaios do grupo holandês colorectal Cancer (DCCG), nomeadamente CAIRO (CKTO 2002-07, ClinicalTrials.gov; NCT00312000) e CAIRO2 (CKTO 2005-02, ClinicalTrials.gov ; NCT00208546). Os dois ensaios clínicos randomizados foram aprovadas pela Comissão da Human-Related Research Arnhem-Nijmegen e pelos conselhos de revisão institucionais locais. O consentimento informado por escrito necessário para todos os pacientes antes da entrada estudo também incluiu a investigação translacional em tecido tumoral. detecção de ponto de interrupção cromossômica CNA-associada foi realizada através de 352 amostras de CRC. dados de matriz-CGH anteriormente foram obtidos utilizando DNA isolado de fixado em formol embebido em parafina (FFPE) tumores primários e os pares de tecido normal de correspondência paciente [9]. As sondas 4548 que tinham sido adicionados para enriquecer para a cobertura de 238 genes Censo Cancer agora estavam excluídos para análise cromossômica ponto de interrupção, deixando 168823 sondas que foram distribuídos uniformemente em todo o genoma em aproximadamente 17kb intervalos (S1 tabela). posições de sondas genômicas foram baseadas no genoma humano NCBI Build36 /hg18. dados de matriz-CGH tenham sido depositados em Gene Expression Omnibus NCBI (número de acesso GEO GSE63216). DNA segmentos número de cópias foram definidos pelo R-pacote “DNAcopy” (versão 1.36.0) e foram demarcadas pela primeira e última sonda do segmento [10]. pontos de interrupção cromossómicas foram definidas pelas posições de início genómicas de segmentos no número de cópias de ADN (Fig 1B), com a excepção de o primeiro segmento de ADN de cada um dos cromossomas e de pontos de interrupção entre as regiões neutros dois do número de cópias, tal como definido por R-pacote “CGHcall” (versão 2.17.6) [11]. Para detectar genes que foram afetados pela quebras cromossômicas CNA-associados, pontos de interrupção foram mapeados para anotações de genes baseados em genoma humano de referência hg18 /Ensembl54.
(A) de matriz-CGH copiar DNA perfil número de uma amostra CRC. O eixo X apresenta cromossomas X e 1-22 (numerados de 23) com limites de cromossomas indicadas por linhas tracejadas verticais. O eixo Y representa a relação de log2 da quantidade de ADN tumoral
relação
ADN normais pareados por paciente. Os pontos pretos representam datapoints individuais sonda matriz-CGH. As linhas horizontais azuis representam segmentos de DNA, indicativo de DNA tumor aberrações no número de cópias quando se trate de 0. A seta verde e bar indicar a região do cromossomo 6 que está destacado na figura 1B. (B) O alargamento da figura 1A (barra verde). Vertical pontilhada linhas vermelhas indicam localizações genômicas de pontos de interrupção cromossômicas CNA-associados,
i
.
e
. as posições genômicas, onde os rácios log2 de segmentos de DNA mudar. (C) gráfico de frequência de pontos de quebra cromossômicas CNA-associados no q-braço do cromossomo 13. O eixo X mostra a posição genômica em Mb. O eixo Y representa as frequências cromossômica ponto de interrupção em toda a coorte de 352 amostras de CRC. freqüências de ponto de interrupção são indicados no nível sonda matriz-CGH (barras pretas verticais) e gene-level (barras vermelhas horizontais). genes de ponto de interrupção recorrentes (FDR 0,1) são nomeados. A seta verde e bar indicar o
PIBF1 região de 13q cromossomo que está em destaque na Fig 1D. (D) Ampliação da Fig 1C (barra verde), que ilustra que
PIBF1
pontos de interrupção de genes são concentrados na parte distal do gene. A vizinha genes que não abrigam as taxas de recorrência de ponto de interrupção significativos são indicados em azul.
A análise estatística de detecção cromossômica breakpoint
A análise de significância estatística dedicada foi elaborado para o ponto de interrupção cromossômica à base de gene análise, que consiste em três etapas. Em primeiro lugar, por matriz-CGH perfil a probabilidade de linha de base de um ponto de interrupção que ocorre num gene ao acaso foi determinado, representando o número de pontos de quebra em um perfil, o comprimento do gene por uma cobertura de sonda associada ao gene e o número de sondas associadas com o gene usando uma regressão logística. Em segundo lugar, a estatística de teste foi definida como o número de perfis com pelo menos um ponto de interrupção de um dado gene. Em seguida, um
P
-valor foi calculado a partir da null-distribuição da estatística de teste. Este nulo distribuição foi uma convolução (mais perfis independentes) de variáveis aleatórias de Bernoulli com a ‘probabilidade de sucesso (= ponto de interrupção)’ gene- e específico do perfil. Em terceiro lugar, a todos
P
-Valores dos genes de ponto de interrupção candidatos, testes de múltipla foi aplicada por um tipo Benjamini-Hochberg dedicado correção FDR [12]. Esta correcção explica a singularidade da null-distribuição. O cromossômica análise estatística breakpoint à base de sonda foi realizada sob a suposição de que por matriz-CGH perfil a probabilidade de ser uma sonda de ponto de interrupção CNA-associado é igual em toda sondas. Neste caso, a correcção Benjamini-Hochberg-tipo FDR dedicado é equivalente à correcção padrão Benjamini-Hochberg FDR, porque, ao contrário dos genes, todas as sondas correspondem ao mesmo nula-distribuição. FDR inferior a 0,1 foi considerado significativo.
mutação genética análise
APC
,
TP53
,
KRAS
,
PIK3CA
,
FBXW7
,
SMAD4
,
BRAF
e
ARN Quais são genes com uma prevalência de mutação publicado na CRC de aproximadamente 3% ou mais [4]. As amostras de ADN FFPE foram analisados por sequenciação de geração seguinte utilizando o Painel de TruSeq amplicon do cancro (TSACP; Illumina Inc, San Diego, CA EUA). estado de mutação do gene foi determinada utilizando o gasoduto chamada variante “Falco” [13]. Lê foram alinhados ao genoma de referência humana (NCBI Build37 /hg19) e variantes foram anotados para entradas dbSNP (build 137). As mutações foram chamados quando a variante anotada foi observadas em pelo menos 20% das leituras e foi designada como uma aberração não sinónima.
Rede Baseada Estratificação
NBS foi usada para aglomerar amostras de CRC, enquanto incluindo informações de interações moleculares de ponto de interrupção de genes e mutações no gene [14]. As características clinicopatológicas de linha de base de amostras de CRC (n = 203, ver Tabela S5) foram semelhantes à série analisada por Haan et al. [9]. O
gene SMAD4
adquiriu ambos os pontos de interrupção e mutações, que foram incorporadas para análise NBS. Para o passo de propagação da rede da rede interacção proteína humana string pré-determinada foi usado como fornecido com a distribuição de NBS. parâmetros NBS foram definidas para seus valores padrão, exceto para
k
que foi definido para 4. Usando a matriz da amostra-similaridade da NBS, as amostras foram designados para subtipos CRC pela ligação média de agrupamento hierárquico. pacientes com CCR foram agrupados em quatro subtipos de CRC e as taxas OS foram visualizados por curvas de Kaplan-Meier e correspondente
P
-Valores foram calculados pelo teste de log-rank.
CRC genes associados ao subtipo
NBS não fornece pontuações aberração gene baseados em rede como padrão de saída. Portanto, para determinar quais genes foram significativamente associados com um subtipo específico CRC, as pontuações de aberração gene baseados em rede para cada gene por amostra foram extraídas como se segue. Em primeiro lugar, para cada iteração NBS
i
de um total de
n
iterações (n = 1000) as matrizes de entrada
V
i
foram reconstruído a partir do fator de matrizes
W
i
e
H
i
que foram obtidos durante a fatoração de matriz não-negativo procedimento:
as matrizes,
V
i
, representam os dados utilizados pela NBS para determinar o agrupamento de exemplo para cada iteração. Um vector média das pontuações aberração gene baseados em rede,
R
s
foi agora obtido para cada amostra
s
pela média sobre a entrada de matrizes
V
i
em todos os
n
iterações:
Aqui,
V
é
é a linha de
V
s
que corresponde à amostra
s
na iteração
i
.
C
s
é um factor de normalização, definida como o número de iterações em que uma amostra
s
foi selecionado para clustering. Observe que, se a amostra não foi selecionada durante o agrupamento tudo
V
é
valores são definidos como zero. testes de Mann-Whitney foram realizadas ao longo das pontuações gene aberração baseados em rede médios para testar se um gene específico contribuiu para a formação de um subtipo de CRC. Para cada gene estes
R
s
pontuações foram agrupados de acordo com o subtipo CRC para determinar o
P
-Valores, indicando se um gene contribuiu significativamente para o formação de um subtipo específico de CRC.
multi-Dendrix
de entrada de dados para análise multi-Dendrix era idêntico ao de entrada de dados utilizado para a análise de NBS, excepto para os genes que tinham os mesmos pontos de ruptura, os quais agora estavam agrupados em “pools” (S8 tabela). parâmetros Multi-Dendrix foram definidos para k7t7s11 [15].
Resultados
Detecção de genes de ponto de interrupção recorrentes
estatuto cromossômica CNA de 352 amostras de CRC avançados primário foi determinada utilizando 180K Agilent matrizes que cobrem o genoma, com um espaçamento médio sonda de aproximadamente 17kb, como previamente descrito [9]. Na sequência de ADN do número de cópias de segmentação, os locais genómicos de alterações no estado do número de cópias de ADN foram agora utilizados para estimar a posição de pontos de interrupção cromossómicas CNA-associados (Fig 1A e 1B). A avaliação estatística rendeu 1605 locais de ponto de interrupção do genoma com recorrências em várias amostras de CRC (FDR 0,1; S1 Tabela), indicando que a posição de quebras CNA-associado é muitas vezes não aleatória. Ao agrupar os pontos de interrupção por gene afetado, um total de 748 genes de ponto de interrupção recorrentes foram identificados (FDR 0,1; S2 Tabela). A distribuição do genoma e prevalência de pontos de interrupção cromossômicas no q-braço do cromossomo 13 é fornecida na Fig 1C e para todos os outros cromossomos em S1 Fig.
O gene com maior prevalência de pontos de interrupção cromossômicas era
MACROD2
, que foi afetado em 40,9% das amostras de CRC. Mais 169 genes de ponto de interrupção recorrentes foram afetados em . 3% das amostras avançadas CRC, semelhantes às frequências de mutação de oncogenes comumente afetadas e genes supressores de tumor (Fig 2)
frequências Gene ponto de interrupção (barras vermelhas) foram baseados na análise de 352 amostras de CRC e frequências de mutação do gene (barras azuis) na análise de 204 amostras. Genes marcado com um “*” indica um conjunto de genes que compartilham sonda (s) associado com pontos de interrupção cromossômicas: o
PCMTD2 *
piscina também inclui
LINC00266-1; PARK2 *
também inclui
PACRG
;
ZNF337 *
também inclui
NCOR1P1
,
FAM182A
,
FAM182B
,
FRG1B
,
MIR663A
,
MLLT10P1
;
CD99 *
também inclui
XG
;
PARP8 *
também inclui
EMB
.
relevância clínica de genes de ponto de interrupção recorrentes
genes de ponto de interrupção recorrentes podem representar regiões genômicas que são vulneráveis a quebras cromossômicas,
i
.
e
. um epifenómeno associado com CNAs. Alternativamente, genes de ponto de interrupção recorrentes podem conduzir o câncer e passar por seleção positiva durante tumorigênese e, consequentemente, afetar os resultados clínicos tais como a sobrevida global do paciente (OS). Por conseguinte, para cada um dos genes de ponto de interrupção recorrentes que foi identificado, o sistema operacional do subgrupo de pacientes com ponto de interrupção de genes específicos que foi comparado com o subgrupo de pacientes sem que ponto de interrupção. Nenhum dos genes de ponto de interrupção recorrentes individuais foi significativamente associada com OS (log-rank
P
-Valores seguido pela correção de Bonferroni para múltiplos testes, dados não mostrados).
processos biológicos relacionados com o câncer são complexo e controlado por uma acção combinada de múltiplos genes. Por essa razão, foi realizada uma análise combinada dos 170 mais prevalentes ( 3%) genes de ponto de interrupção recorrentes descritos acima e estado de mutação gênica de genes-chave cancerosas. Usando DNA isolado a partir de tecido de arquivo embebido em parafina fixado em formalina, estado de mutação do
TP53
,
APC
,
KRAS
,
PIK3CA
,
FBXW7
,
SMAD4
,
BRAF
e
ARN
foi determinada por sequenciação alvo próxima geração, que sucedeu em 204 amostras de CRC (Fig 2, S3 e S4 tabelas). Tal como um caso faltavam pontos de interrupção e as mutações de genes seleccionados, 203 casos estavam disponíveis para fornecer dados tanto de ponto de interrupção de genes e de mutação genética como entrada para a rede baseada Estratificação (NBS) [14]. NBS foi aplicado para propagar eventos de ponto de interrupção de genes e mutações no gene esparsas para a cadeia de rede de interação proteína predefinido seguido por agrupamento de pacientes em subtipos de CRC com base nas afetadas sub-redes [14]. Esta análise revelou quatro subtipos de CRC (Fig 3A e S6 tabela). Basais características clinicopatológicas dos pacientes eram altamente comparáveis entre os quatro subtipos de CRC (uma do lado do teste Exato de Fisher; S5 tabela). análise OS revelaram diferenças significativas entre esses subtipos (log-rank
P
= 0,001; Fig 3B), com o subtipo 3 que tem um sistema operacional significativamente mais pobres do que os outros três subtipos de CRC (HR = 2.17 CRC; log-rank
P
= 0,0002; Fig 3C), com 218 dias diferença na sobrevida global mediana
(a) matriz de Co-agrupamento de amostras de CRC gerados pela análise de NBS.. A intensidade da cor da matriz representa a pontuação de similaridade. A barra de cores no topo indica os grupos de pacientes relacionadas com os quatro subtipos de CRC (k = 4), conforme determinado pelo agrupamento hierárquico após a análise NBS. (B) diagrama de Kaplan-Meier para a sobrevivência global (em dias) de CRC de subtipo 1 (n = 80 doentes), subtipo 2 (n = 45 doentes), subtipo 3 (n = 27 doentes) e subtipo 4 (n = 51 pacientes ). Existem diferenças significativas na OS entre os quatro subtipos de CRC (log-rank
P
= 0,001), com OS mais pobres para subtipo 3 pacientes com CCR. (C) enredo Kaplan-Meier para o OS da CRC subtipo 3 pacientes
pacientes versus
em outros subtipos de CRC, mostrando uma taxa de risco (HR) de 2,17 e uma sobrevida média de 392 dias
contra
610 dias, respectivamente (log-rank
P
= 0,0002).
ao explorar ainda mais as redes associadas com esta classificação CRC, a maioria dos genes que contribuem acabou por ser ponto de interrupção recorrente genes suplementado com alguns dos oncogenes CRC comumente mutantes e genes supressores de tumor (S7 tabela). A nível gene individual dentro dos genes associados ao subtipo CRC identificados, o mau prognóstico CRC subtipo 3 foi
a
.
o
. enriquecido para mutações pontuais do gene em
BRAF
(frente e verso teste exato de Fisher:
P Art 0,0001) e
FBXW7
(
P = 0,01
), e para pontos de interrupção de genes em
WWOX
(
P Art 0,0001),
FHIT
(
P Art 0,0001) e
PIBF1
(
P
= 0,03). Por causa mutações em
BRAF
são frequentemente associados com microssatélites instáveis (MSI) tumores [16], examinamos a distribuição de amostras MSI entre os quatro subtipos de CRC. Curiosamente, oito em cada dez amostras MSI neste grupo de 203 CRCs estavam em subtipo 3 (teste exato de dois lados Fisher:
P Art 0,0001; S5 Tabela). Tomados em conjunto, estes dados indicam que os genes recorrente de ponto de interrupção CNA-associados são clinicamente relevantes em que contribuam para a classificação CRC de subtipos com valor prognóstico.
importância biológica dos genes de ponto de interrupção recorrentes
Para investigar se genes de ponto de interrupção recorrentes podem impulsionam o desenvolvimento CRC, o algoritmo multi-Dendrix foi aplicado para identificar caminhos ou módulos gene oncogênico com base em dois critérios, a saber: 1) os eventos dentro de um módulo devem ser mutuamente exclusivos, e 2) os eventos adversos devem cobrir a quase totalidade amostras de câncer estudados [15]. Os dados de entrada para esta análise foi idêntica à do NBS,
i
.
e
. o status de mutação genética de oito genes CRC comumente afetadas eo estado ponto de interrupção dos 170 mais prevalentes ( 3%) recorrente genes de ponto de interrupção de 203 amostras de CRC. Esta análise revelou quatro módulos de genes distintas, três módulos que contêm ambas as mutações de genes e pontos de interrupção de genes e um módulo a ser inteiramente composta de genes de ponto de interrupção de repetição (figura 4). Observou-se o mais forte exclusividade mútua entre
TP53
mutações e
PIBF1
pontos de interrupção, um gene cuja breakpoints foram mais prevalentes no subtipo CRC 3 que apresentou pior prognóstico. A localização genômica de
PIBF1
no q-braço do cromossomo 13 é destacado na figura 1D, ilustrando o enriquecimento de pontos de interrupção de genes na parte distal deste gene. Além disso, também
MACROD2
,
PPP1R12B
,
AKAP13
,
ERGIC1
,
PTPRT
,
SLC22A5
,
HIST1H1A
,
ASNS
, e
rock1
genes de ponto de interrupção foram representados em um dos módulos de genes, e contribuiu para CRC classificação de subtipo (Fig 4 e S7 Tabela). Estes dados implicam que múltiplos genes de ponto de interrupção recorrentes desempenham um papel biológico importante no desenvolvimento da CRC.
Os nós compreendem ambos os pontos de interrupção de genes (esboço vermelho) e mutações genéticas (esboço azul). Bordas (linhas cinzentas) ligar genes que são mutuamente exclusivamente afetadas. A espessura das linhas cinzentas eo número correspondente refletem a pontuação robustez. O mais forte exclusividade mútua é observada entre
PIBF1
e
TP53
. Genes marcado com um “*” indica um conjunto de genes que compartilham sonda (s) associado com pontos de interrupção cromossômicas: o
ZNF337 *
piscina também inclui
NCOR1P1
,
FAM182A
,
FAM182B
,
FRG1B
,
MIR663A
,
MLLT10P1
;
ZNF519 *
também inclui
ANKRD20A5P
,
ANKRD30B
.
Discussão
Caracterização molecular de aberrações de ADN somáticas é um estratégia útil para auxiliar a previsão do prognóstico e terapia de pacientes individuais. Embora a análise de mutações pontuais não sinónimas em genes de câncer comumente mutantes e determinação cromossômica CNAs tornaram-se padrão de prática para a caracterização de amostras de tumores, a análise em larga escala do genoma-wide detalhado de SVs ainda está em sua infância. Nós aqui demonstrado que os perfis CNA permitem detectar genes cuja função pode ser afetado por quebras cromossômicas CNA-associados. Em Foram identificados no total 748 genes de ponto de interrupção recorrentes com base na análise de uma grande série (n = 352) de alta resolução de amostras de matriz-CGH de tumores primários de pacientes que participaram de dois estudos clínicos fase III em câncer colorretal metastático. Em adição à sua abundância também a prevalência dos genes de ponto de interrupção recorrentes foi relativamente elevado, com 170 genes a ser afectados por quebras cromossómicas em mais de 3% dos casos de cancro. Como tal, a prevalência dos genes afectados por quebras cromossómicas CNA-associados é comparável à prevalência de mutações pontuais em locais bem conhecidos e vulgarmente afectada CRC oncogenes e genes supressores de tumor (Figura 2).
Um dos principais perguntas que tinha como objectivo abordar é se quebras cromossômicas dentro genes são apenas um epifenómeno associado com instabilidade cromossômica ou se os genes de ponto de interrupção recorrentes representam controladores de câncer com relevância biológica e clínica. Embora nenhum dos genes de ponto de interrupção recorrentes individuais apresentaram efeitos significativos sobre OS, a propagação dos 170 genes de ponto de interrupção mais prevalentes em combinação com oito genes comumente mutado em uma rede pré-definido permitiram classificar CRC em quatro subtipos pelo NBS. Um dos subtipos de CRC, CRC subtipo 3, tiveram um prognóstico significativamente mais pobres do que as outras (figura 3), indicando que os subtipos clinicamente distintas podiam ser identificadas. Em uma análise multivariada (dados não apresentados) foram retidos os fatores “Quem performance status ‘,’ LDH na randomização”, “terapia adjuvante antes ‘,’ estágio do tumor primário do tumor”, “Número de órgãos afetados” e “estado MSI ‘. Porque mutações genômicas são causais para tumorigênese e ditar o comportamento do tumor, é bem possível que os fatores fenotípicos, que em última análise são um resultado da biologia subjacente, mascarar o efeito prognóstico dos subtipos CRC genômicos. Tal dependência entre parâmetros prognósticos clínico-patológicos e os subtipos de CRC, conforme descrito aqui, portanto, não refuta valor prognóstico univariada dessa classificação.
CRC subtipo 3 acabou por ser enriquecido para tumores com
BRAF
mutações (33% dos casos
contra
5% nas outras amostras CRC; S7 Table) e tumores MSI (30% dos casos
contra
1% nas outras amostras CRC).
BRAF
é mutado em frequências muito mais elevados em tumores MSI do que em tumores instáveis cromossômicas, e dentro de tumores MSI,
BRAF
mutação é conhecida por estar associada a um mau prognóstico [16]. Embora os tumores MSI têm um prognóstico relativamente bom na doença em estágio inicial, eles também estão associados com explicitamente mau prognóstico no câncer colorretal metastático [17]. tumores MSI muitas vezes têm uma menor freqüência de aberrações CNA que os tumores que são estáveis microssatélite (MSS) e, portanto, têm menos pontos de interrupção cromossômicas CNA-associados do que os tumores MSS. Isto sugere que os tumores MSI pode tornar-se agrupados em um subtipo CRC distinta, independentemente do (alterações na função dos genes) de ponto de interrupção recorrentes. Seguindo esta linha de raciocínio, pode-se prever que o mau prognóstico CRC subtipo 3 carece de genes de ponto de interrupção recorrentes com maiores frequências de mutação em comparação com os outros subtipos de CRC. No entanto, nossos dados mostram o contrário (S7 Table), com enriquecimento significativo de frequências ponto de interrupção no CRC subtipo 3
contra
as outras amostras de CRC para
WWOX
(33%
contra
5%),
FHIT
(59%
contra
13%), e
PIBF1
(15%
contra Sims 3%). Estes dados enfatizam que os genes de ponto de interrupção recorrentes contribuir significativamente para a classificação clinicamente relevante CRC.
Como os nossos dados suportam relevância clínica dos genes de ponto de interrupção recorrentes, espera-se que quebras cromossômicas dentro destes genes de alguma forma resultar em seleção positiva das células cancerosas e estimular o desenvolvimento do tumor. Análise funcional de genes de ponto de interrupção recorrentes para compreender os seus efeitos biológicos foi além do escopo do presente estudo. No entanto, para muitos destes um papel na tumorigénese foi descrito na literatura.
WWOX
e
FHIT
têm sido conhecidos a residir em locais frágeis comuns e têm sido demonstrados para atuar como supressores de tumor desenvolvimento por modelos de ratos knockout gene [18]. Além disso,
WWOX
superexpressão foi mostrado para promover a resposta imune em um modelo de glioma [19], enquanto
FHIT
regula positivamente a expressão de moléculas MHC classe I em células de câncer [20]. Estes dados sugerem que a perda da função de
WWOX
e
FHIT
ajuda para escapar vigilância imunológica. De igual modo, o factor de ligação a progesterona imunomodulador
PIBF1
foi identificado como um factor secretado que pode evitar a perda de gravidez por atenuante da resposta imune. Considerando-se que
PIBF1
breakpoints foram predominantemente observados na parte distal do gene (Fig 1D) é tentador especular que
PIBF1
pontos de interrupção de genes interromper seu sinal de localização nuclear em que se tornou um secretado proteína com anti-tumorais capacidades de imuno-supressoras [21]. tumores MSI são pensados para evocar uma resposta imune anti-tumor que impede a propagação metastática, no entanto, uma vez que estes tumores contornada tornar-se muito agressiva [16]. A este respeito, é interessante notar que os genes de ponto de interrupção que mais contribuíram para a classificação do mau prognóstico CRC subtipo 3,
i
.
e
.
WWOX
,
FHIT
, e
PIBF1
, todos têm sido implicados para modular respostas imunes.
MACROD2
foi o mais gene prevalente ponto de interrupção recorrente em nossa coorte, sendo afetado em 41% dos casos de CRC. Este gene também foi um dos genes rearranjados mais frequentemente observadas através de uma deleção focal em outros estudos [3,22].
MACROD2
é capaz de hidrolisar os grupos mono-ADP-ribosilo endógenos, uma porção de modificação pós-traducional reversível, a partir de proteínas-alvo, tais como o
GSK3B
. Isto restabelece a função de
GSK3B, que é um inibidor chave da via de sinalização Wnt. Assim, a ausência de funcional
MACROD2
pode diminuir a actividade de quinase de
GSK3B
e, assim, promover a sinalização Wnt [23-25]. Além disso,
MACROD2
pode desempenhar um papel na modulação da função das proteínas histonas e é recrutado em caso de DNA danos resposta [23,25].
Para abordar ainda mais a relevância biológica de ponto de interrupção recorrente genes que tentou construir módulos de genes do cancro condução putativos, usando multi-Dendrix. Por um lado, esta análise pode revelar vias oncogênicas, procurando por padrões de mutação de genes mutuamente exclusivos que cobrem quase todas as amostras de CRC. Por outro lado, se um grupo aparentemente homogénea de tumores consiste em subtipos distintos de tumores, a exclusividade mútua entre os genes pode também reflectir a presença de (previamente desconhecidos) subtipos de cancro. Observou-se o mais forte exclusividade mútua entre
TP53
mutações e
PIBF1
breakpoints (Fig 4).