Sumário

Nós avaliamos a capacidade de paclitaxel, um dos taxanos, para induzir a morte de duas linhas de câncer de próstata, LNCaP e PC3. O paclitaxel manada uma via apoptótica em LNCaP, mas não em células PC3, em resposta a G2M prisão /. Uma análise dos níveis de proteínas anti-apoptóticas revelou que a Bcl-XL foi muito maior em células PC3 do que em células LNCaP e Bcl-2 pode ser detectado apenas em células PC3, não em células LNCaP. Derrubando Bcl-xl apoptose induzida por paclitaxel reforçada em células LNCaP, enquanto não fomos capazes de derrubar Bcl-XL eficientemente em células PC3. Significativamente, uma comparação de ABT-263, um inibidor específico de Bcl-2 e Bcl-XL, com ABT-199, um inibidor selectivo Bcl2, divulgado que apenas ABT-263, não ABT-199, poderia induzir a apoptose em células LNCaP e células PC3. Os resultados indicam que a proteína Bcl-XL tem um papel protector contra a apoptose induzida por paclitaxel em células LNCaP e PC3, e a sua sobre-expressão faz com que a resistência ao paclitaxel visto em células PC3. Curiosamente, o paclitaxel combinado com ABT-263 para o tratamento de células de LNCaP e PC3 demonstraram activação sinérgica de apoptose, indicando que ABT-263 poderia intensificar a apoptose induzida por paclitaxel em células LNCaP e superar a sobre-expressão de Bcl-XL para desencadear a apoptose induzida por paclitaxel em células PC3. Também se observou que a activação de apoptose em células LNCaP foi mais eficiente do que em células PC3, em resposta ao paclitaxel, mais ABT-263 ou ABT-263 sozinho, sugerindo que a via de apoptose em células PC3 podem ter diferenças adicionais de que em células LNCaP mesmo após a sobre-expressão de Bcl-xl é contabilizado

Citation:. Wang C, Huang SB, Yang MC, Lin YT, Chu IH, Shen YN, et al. (2015) Combinando Paclitaxel com ABT-263 tem um efeito sinérgico na Paclitaxel resistentes células cancerosas da próstata. PLoS ONE 10 (3): e0120913. doi: 10.1371 /journal.pone.0120913

Editor do Academic: Andreas Villunger, Innsbruck Medical University, ÁUSTRIA

Recebido: 03 de maio de 2014; Aceito: 09 de fevereiro de 2015; Publicação: 26 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada por Grant EX99-9935EI (a CHC) dos Institutos de pesquisa em Saúde Nacionais de Taiwan; Grant KMU-M103005 (CW) a partir de Kaohsiung de medicina da Universidade. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adquiriram resistência a quimioterapia relacionada com o taxano permanece um problema importante para os tumores malignos que mostram um benefício terapêutico inicial de tratamento do taxano. As células cancerosas com resistência taxano pode sobre-expressar um gene de resistência a múltiplos fármacos codificada para a bomba de P-glicoproteína de aumentar o efluxo de taxano, que conduz a concentrações intracelulares de taxano mínimas [1]. Além disso, a alteração das características de microtúbulos, principalmente através do aumento da actividade dinâmica dos microtúbulos após tratamento do taxano, pode também alterar a capacidade de resposta para os taxanos e diminuir a sua eficácia [2,3]. As mutações de genes de tubulina em microtúbulos o local de ligação de taxanos pode alterar a ligação de afinidade de taxano, resultando na perda significativa de eficácia [4,5]. Ganho de função para neutralizar vias apoptóticas pode também contribuir para a resistência a múltiplas drogas em cancros [6,7].

O padrão de regulamentação específica a apoptose em células cancerosas pode ser um factor crucial que determina a sensibilidade das células cancerosas para múltiplos diversos agentes de quimioterapia [8]. apoptose intrínseca ou mitocondrial geralmente ocorre em células cancerosas que respondem a paragem do ciclo celular induzida por quimioterapia, incluindo a paragem da mitose induzida por drogas [9,10]. A família Bcl-2, que consiste em três grupos de proteínas, incluindo proteínas anti-apoptóticas, proteínas pró-apoptóticas e BH3-apenas proteínas, é essencial para este apoptose intrínseca [9]. Bcl2, Bcl-xl, Mcl-1 e Bfl1 são proteínas anti-apoptóticas. Ambos Bax e Bak são proteínas pró-apoptóticas. BH3-somente proteínas incluem Bad, Bik, Bim, Bid, Noxa, HRK e Bmf. As proteínas anti-apoptóticas todos contêm quatro motivos de sequência conservados, os domínios de homologia de Bcl-2 (BH), que incluem BH1, BH2, BH3 e BH4 [10]. A sua função é manter a integridade da mitocôndria para suportar a sobrevivência de células. As proteínas pró-apoptóticas partilham semelhança notável com as proteínas anti-apoptóticas, especialmente nas características estruturais de todos os quatro regiões BH, enquanto que perturbe a integridade mitocondrial para desencadear a apoptose. Por último, os BH3-somente proteínas têm apenas um domínio BH3 para partilhar com o outro e com as proteínas anti-apoptóticas e pro-apoptóticas [11]. Curiosamente, este domínio BH3 comum das proteínas BH3-constitui apenas cerca de 26 aminoácidos, de resíduos e forma um α-hélice anfipática para interagir com e inactivar as proteínas anti-apoptóticas [12]. Ele liga-se, possivelmente, também de forma transiente Bax e Bak para a sua activação [13].

Recentemente, vários compostos têm sido desenvolvidos como miméticos de BH3 para induzir apoptose através da inibição das proteínas anti-apoptóticas [12,14]. Até agora, os inibidores mais potentes são os miméticos maus-like BH3, ABT-737 e seu análogo activo por via oral, ABT-263 [15-17]. Eles ligam-se a Bcl-2, Bcl-XL e Bcl-w, com uma afinidade muito elevada, mas com muito menor afinidade para Mcl-1 ou Bcl2A1 [14,18]. estudos pré-clínicos demonstraram que tanto o ABT-737 e ABT-263 pode deslocar as proteínas pró-apoptóticas das proteínas anti-apoptóticas, de acordo com um mecanismo de BH3-mimético de matar [19]. A apoptose induzida por ABT-737 via BAX ou BAK é sugerido para ser uma atividade on-alvo [20]. Além disso, a sensibilidade da resposta celular aos péptidos BH3 dos BH3-somente proteínas está altamente correlacionada com a sensibilidade das células ameaçadas com ABT-737 a apoptose [21]. Significativamente, os ensaios clínicos de ABT-263 ter sido realizada e foi observado algum benefício, mais notavelmente no tratamento da leucemia linfocítica crónica [22]. Além disso, tanto ABT-737 e ABT-263 podem ser utilizados como ferramentas para estudos mecanísticos de apoptose [14,23]. Recentemente, um novo ABT, ABT-199, foi desenvolvido com seletividade demonstraram especificamente para Bcl2 [24].

No presente estudo, nós exploramos os mecanismos normais de apoptose em células de câncer de próstata em resposta a paclitaxel, ABT- 199, ABT-263 e o paclitaxel mais ABT-263, utilizando células LNCaP e PC3. LNCaP e PC3 representam o andrógeno-resposta e linha de células de cancro da próstata independente de androgénios, respectivamente. Nós primeiro descobriu que paclitaxel causada G2 /M detenção em ambos LNCaP e células PC3, mas apoptose só resultou em células LNCaP. Além disso, observou-se a sobre-expressão Bcl-2 e Bcl-XL em células PC3 em comparação com células LNCaP, que têm baixos níveis e não detectáveis ​​de Bcl-XL e Bcl-2, respectivamente. O knockdown siARN da proteína anti-apoptótica de Bcl-XL aumento da apoptose em células LNCaP, mas não podia ser knockdown em células PC3 de forma eficiente. Comparou-se a capacidade de ABT-199 e ABT-263 para induzir a apoptose e descobriu que apenas ABT-263, não ABT-199, poderia induzir a apoptose. Nós também demonstrou que o paclitaxel em combinação com ABT-263 teve efeitos sinérgicos sobre a apoptose tanto em células LNCaP e PC3. Isto sugere que a ABT-263 pode melhorar os resultados terapêuticos para os cancros da próstata tanto paclitaxel-sensíveis e paclitaxel-resistente. A activação da apoptose era mais eficiente nas células LNCaP do que as células PC3 em resposta ao paclitaxel, mais ABT-263 ou ABT-263 sozinho, sugerindo que a via de apoptose em células PC3 pode diferir mais do que em células LNCaP, mesmo depois de Bcl-XL é contabilizada .

Materiais e Métodos

compostos

Paciltaxel (Sigma-Aldrich), ABT-199 (Selleck) e ABT-263 (Selleck) foram adquiridos a partir de fontes comerciais, tal como indicado . Os compostos foram dissolvidos em DMSO primeira e diluído com meio de cultura em novas experiências.

cultura celular e sincronização

células PC3 e LNCaP foram comprados da coleção e Research Center Bioresource (BCRC) em Taiwan . As células foram semeadas a 4 x 10

5-6 × 10

5 células por placa de petri (10 cm) em meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal de bovino e cultivado a 37 ° C sob 5% de CO

2. As células foram cultivadas quer não síncrono ou em sincronização. Para a sincronização, as células PC3 foram semeadas em timidina mM rica em soro de meio RPMI 1640 com 2 e incubou-se durante 19 horas. As células foram libertadas por lavagem três vezes com PBS e re-alimentadas com meio rico em soro fresco durante 8 h. Em seguida, as células foram re-alimentadas com meio fresco contendo 2 mM de timidina durante 16 h. As células foram lavadas por PBS três vezes antes de passos subsequentes. As células LNCaP foram privadas em meio RPMI isento de soro 1640 durante 48 horas depois de serem semeadas em meio rico de soro durante 24 h.

análise do ciclo celular por citometria de fluxo

células PC3 e LNCaP foram tratados pelos paclitaxel nos pontos de tempo indicados na sequência de sincronização na fase G1 /S. As células foram colhidas por tripsinização e /ou separados em fracções isoladas e aderentes. As células foram centrifugadas, lavadas com PBS e recolhidas por centrifugação. As células foram fixadas com gelo frio de 70% de etanol durante 30 min, lavadas com PBS e centrifugada para remover o sobrenadante. As células foram re-suspensas em PBS contendo 0,05% de Triton X-100 e RNase A (40 ug /ml) e incubou-se a 37 ° C durante 1 h, e iodeto de propídio (PI) foi adicionado à suspensão celular para uma concentração final de 50 ug /mL para a outra incubação de 1 h. As células foram colhidas por centrifugação, lavadas com PBS e centrifugada para remover o sobrenadante. Finalmente, as células foram re-suspensas por PBS e analisadas por citometria de fluxo (BD Biosciences) com o software (BD Biosciences).

Análise por imunofluorescência com um microscópio confocal

Cerca de 5 × 10

4 PC3 e 1 × 10

células 5 LNCaP foram semeadas em lamelas de vidro de 18 mm estéreis. As células foram sincronizadas nas condições descritas acima na secção de sincronização celular. As células foram cultivadas com diferentes compostos nos cursos de tempo indicados, fixos em metanol (-20 ° C, 10 min) e perfurada com 0,1% de Triton X100 (25 ° C, 2 min). As células foram bloqueadas em 3% de albumina de soro de bovino-TBS e, em seguida, coradas com anticorpo monoclonal primário α-tubulina (Sigma-Aldrich), seguido de anticorpos secundários, conjugados com fluoróforo (Invitrogen). As lamelas foram montadas com reagente Antifade com DAPI (Invitrogen) de cabeça para baixo em lâminas de vidro. As imagens de microscopia confocal foram obtidas utilizando um sistema de microscópio confocal (Olympus) e amplificados cem vezes.

Apoptosis Assay

Cerca de 1 × 10

5 células PC3 ou 2 × 10

5 As células LNCaP foram semeadas numa placa de Petri de 10 cm. Ambas as células PC3 e LNCaP foram sincronizadas e expostas aos tratamentos compostos indicados durante 48 h. As células foram colhidas por tripsinização e separada em frações aderente e destacadas. As células foram ressuspensas e coradas em 100 ul de tampão de ligação de anexina V, com 100? G de iodeto /mL de propídio e 100 ug /ml de anticorpo conjugado com FITC anexina V (Biotech forte) durante 15 min à temperatura ambiente antes de análise de FACS.

imunotransferência

As células foram lisadas em tampão de lise (NaCl 250 mM, DTT 1 mM, 0,1% de NP-40, 1 mM de EDTA, 10 mM de β-glicerofosfato, 0,1 mM de na

3VO

4H, um comprimido cocktail inibidor de protease, NaF 1 mM, HEPES 50 mM, pH 7,4, para 50 ml). A concentração de proteína foi determinada por um kit de ensaio de BCA Protein (Pierce). Cerca de 100 ug de proteína por poço foi sujeito a SDS-PAGE. Após a electroforese, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose. As membranas transferidas foram bloqueadas em 5% (w /v) de leite em pó desnatado ou 5% (w /v) de BSA em TBS (NaCl 0,5 M, Tris-HCl a 20, pH 7,4) com 0,1% (v /v) de Tween 20 e sondadas para o primeiro anticorpo, seguido por incubação com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (anti-coelho, anti-ratinho; Jackson ImmunoResearch) e visualização com um kit de detecção (Pierce) por desenvolvimento película fotográfica. Os primeiros anticorpos utilizados neste estudo foram como se segue: anticorpo anti-actina (Millipore), anti-gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e o anticorpo -α-tubulina (GeneTex), anticorpo anti-Bcl-XL (Abcam), anti-Bak, -Bax, -Bcl2, -Bim, -caspase 3, -caspase 3 (A), – a caspase 7 (A), – Mcl-1, poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e PARP- (C) anticorpo (Cell Signaling). imagens immunoblot foram quantificadas pelo software quantitativa (NIH).

Coimmunoprecipitation

lisados ​​celulares totais de células LNCaP ou PC3 tratados com paclitaxel ou controlar foram preparadas em tampão Chaps (5 mM MgCl

2, 137 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 1% CHAPS, 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5)), e inibidores de protease. Cerca de 500 ug de proteínas foram imunoprecipitadas com anticorpo Bcl-XL (Abcam) a 4 ° C durante 2 h. Os imunoprecipitados foram capturados por 50 ul da suspensão de esferas de proteína A-magnética (Millipore) em tampão de Chaps a 4 ° C durante a noite. Os imunoprecipitados foram então recuperados por suporte magnético e lavadas três vezes em tampão de 1% de CHAPS. Imunoprecipitados foram eluídos por tampão de amostra SDS-PAGE, foram submetidos a SDS-PAGE e depois immunoblotting.

Bcl-xl, Bim e Mcl-1 knock down por siRNA

PC3 ou LNCaP foram semeadas a 4 x 10

5-6 × 10

5 células por placa de petri (10 cm) durante 24 horas em 7 mL de RPMI 1640 com 10% de soro fetal de bovino e cultivado a 37 ° C sob 5% de CO

2. Bim (Qiagen), Bcl-XL e Mcl-1 (Invitrogen) siARN foi pré-incubada em meio de cultura de 1 ml sem soro antes da transfecção, e em seguida, 40 ul de reagente de transfecção (Qiagen) foi adicionado ao mesmo meio de cultura, misturou-se por vórtice e incubada para 5 ~ 10 min à temperatura ambiente para permitir a formação de complexos de transfecção. A concentração final de ARNip foi de cerca de 5 a 10 nm após adição dos complexos gota a gota às células PC3 e LNCaP. Após 24 horas, as células PC3 e LNCaP foram tratadas com 50 nM de paclitaxel e colhidas nos cursos de tempo indicados.

A análise estatística

Um teste de t emparelhado foi utilizado para mostrar a significância estatística de os resultados utilizando SigmaPlot 10. ** P 0,01 foi considerado significativo. Foram analisados ​​dados de dois experimentos independentes.

Resultados

Paclitaxel levou à paragem da mitose em G2 /M em ambas as células LNCaP PC3 e

células PC3 ou LNCaP sincronizados em G1 /S foram tratadas com 50 nM de paclitaxel ao longo de diferentes cursos de tempo e colhidas para análise do ciclo celular com citometria de fluxo. Verificou-se que o ciclo celular em células PC3 passou normalmente através da fase S e foi preso no ponto de tempo entre 8 e 12 h (Fig. 1A). Por causa de sua taxa de proliferação lenta, as células LNCaP demorou mais do que PC3 para responder ao composto de tratamento, mostrando parada do ciclo celular entre 36 e 48 horas (Fig. 1A)

.

(A) por citometria de fluxo análises de PC3 sincronizados ou células LNCaP tratadas por paclitaxel através dos cursos de tempo indicados. As análises foram em triplicado e os histogramas representativos são mostrados. X e Y eixos representam números de conteúdo de DNA e celulares, respectivamente. (B) Imunofluorescência micrografia dos microtúbulos de células PC3 ou LNCaP sincronizados tratadas por paclitaxel ao longo dos cursos de tempo indicados. As análises foram duplicados e micrografias de imunofluorescência representativas são mostrados. a-tubulina foi mostrado pela cor verde. DNA foi mostrado pela cor vermelha.

Em seguida, acompanhou o comportamento de ambos os microtúbulos e cromossomos por imagem imunofluorescência com um microscópio confocal sobre o mesmo curso do tempo. Observou-se que o paclitaxel afetados microtúbulos em 4 horas e 8 horas em células PC3, mostrando a distribuição dos microtúbulos anormalmente densa em torno do núcleo (Fig. 1B). Estes microtúbulos anormais perdido a capacidade para realizar a formação do fuso normal, resultando em fusos multipolares densas às 12 h (Fig. 1B). O efeito do paclitaxel em células LNCaP se assemelhava ao efeito sobre as células PC3 (Fig. 1B). No entanto, devido ao tempo de duplicação longo de LNCaP, a formação do fuso anormal em células LNCaP ocorreu muito mais tarde do que em células PC3 (Fig. 1B).

Nossos resultados sugerem que as células tratadas com paclitaxel ainda poderia ir para a frente através G2 e provavelmente inserir G2 /M para formar o complexo de fuso-cromossoma com defeito que causou, em seguida, a paragem do ciclo celular na fase presente.

paclitaxel manada uma resposta apoptótica através das vias apoptóticas caspase-dependente em LNCaP, mas não em PC3 As células, em resposta a G2 /M prender

O paclitaxel provocou a paragem do ciclo celular em G2 /M, em torno de 8-12 h, em células PC3 e 36-48 h em células LNCaP. Em seguida, investigou-se os apoptóticos respostas desencadeadas pelo paclitaxel através da avaliação da activação da caspase 3 e do nível de degradação de PARP. Nossos resultados revelaram que o paclitaxel provocou a ativação de caspase 3 e degradação PARP em células LNCaP a aparecer pela primeira vez em 48 horas, logo após G2 /M detenção, e atingiu um nível significativo às 72 horas (Fig. 2A). Em contraste, foi detectada nem a activação de caspase 3 nem a degradação de PARP em células PC3 por paclitaxel em G2 /M de detenção (Fig. 2A). Assim, concluiu-se que o paclitaxel activada uma resposta apoptótica altamente correspondente ao seu efeito em G2 /M de detenção em células LNCaP, mas não em células PC3.

(a) a análise de imunotransferência de lisados ​​celulares de LNCaP sincronizado e as células PC3 tratada por paclitaxel ao longo dos cursos de tempo indicados para a detecção de caspase 3 e PARP com o seu produto de degradação. (B) A análise de imunotransferência de lisados ​​celulares a partir das fracções separadas ou aderidas de LNCaP ou células PC3, após tratamento com paclitaxel sobre cursos de tempo para a detecção de forma a clivagem de PARP. As experiências foram repetidas três vezes e os resultados representativos são mostrados. PARP (c):. A ​​forma de clivagem de PARP

Paclitaxel causou a morte de células PC3 apenas no estatuto individual

Nós achamos que o paclitaxel não ativar uma resposta apoptótica correspondente ao paragem em G2 /M, em células PC3. Qual é o destino das células PC3 presas nesta fase? Após o tratamento com paclitaxel, observou-se que algumas células LNCaP ou PC3 independente a partir do fundo da placa de cultura. Assim, as células colhidas após a incubação com os compostos ao longo de diferentes intervalos de tempo, e recolhidas e analisadas as células aderiram e isoladas separadamente. Nós olhamos para a degradação da PARP nas frações aderiram e destacadas de LNCaP e células PC3 em diferentes intervalos de tempo. A forma de clivagem de PARP apareceu nas fracções aderidas e isoladas de células LNCaP (Fig. 2B). Esta forma só apareceu na fracção isolada de células PC3 em 48 h (Fig. 2B).

também realizada Anexina-V-FITC coloração /PI para avaliar a morte celular em células LNCaP ou PC3. A maioria das células PC3 aderiram permaneceram vivos, enquanto a fração aderiu de células LNCaP mostraram uma percentagem significativa cair em apoptose precoce (S1 Fig.). Para a fracção individual, com células LNCaP e PC3 apareceu na apoptose e necrose tardia (S1 Fig.).

Concluiu-se que o momento da apoptose precoce na fracção de células LNCaP aderida corresponde a G2 /M parada enquanto as células PC3 efectivamente exibir um fenótipo de resistência ao tratamento com paclitaxel. A morte nas fracções isoladas de LNCaP e PC3 parecia relacionada ao descolamento celular, bem como o stress celular causado por paclitaxel.

A expressão de Bim, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1 em LNCaP e células PC3 após o tratamento com paclitaxel

para perguntar por caspase apoptose 3-dependente ocorre em LNCaP, mas não em células PC3, em resposta a G2 M prisão /, nós checar o nível de proteína de Bim, Bak, Bax, BCL2, Bcl-XL e Mcl-1. Os nossos resultados mostraram que o nível de proteína de Bim diminuiu ao longo do tempo após o tratamento com paclitaxel em LNCaP e células PC3 (Fig. 3a). Em contraste, o nível de proteína de Bak, Bax, Bcl-XL e Mcl-1 não se alterou de forma significativa sob as mesmas condições (Fig. 3A e B). Nós não conseguimos detectar quaisquer proteínas BCL2 em células LNCaP (Fig. 3B). Interessantemente, as células PC3 expressa uma quantidade significativa de proteínas Bcl2 com ou sem tratamento com paclitaxel (Fig. 3B). Em seguida, comparou o nível de proteína de Bim, Bcl-XL e Mcl-1 entre LNCaP e células PC3. Os resultados revelaram que a expressão de Bcl-XL e Mcl-1 em células PC3 é muito mais elevado do que em células LNCaP (Fig. 3C). Portanto, a sobre-expressão de Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1 em células PC3 pode contribuir para a sua resistência ao paclitaxel.

(A) A expressão de BH3-única proteína Bim e proteínas pró-apoptóticas incluindo Bak e tanto Bax, em células LNCaP e PC3. (B) A expressão das proteínas anti-apoptóticas, incluindo Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1 em células LNCaP ou PC3. A análise de imunotransferência de lisados ​​celulares a partir de células LNCaP ou PC3 tratadas com paclitaxel ao longo do tempo, tal como indicado. As experiências foram repetidas três vezes e os resultados representativos são mostrados. (C) Comparação de Bim, Bcl-XL e Mcl-1 entre LNCaP e células PC3 com /sem tratamento com paclitaxel. A análise de imunotransferência de lisados ​​celulares de LNCaP ou células PC3 tratadas durante 48 h. As experiências foram repetidas três vezes e os resultados representativos são mostrados. imagens immunoblot de Bim, Bcl-xl, Mcl-1 e α-tubulina em LNCaP e PC3 com /sem tratamento com paclitaxel foram quantificados por ImageJ. As leituras, definida como unidades de luz de arbitrárias, Bim, Bcl-XL e Mcl-1 normalizado para a leitura de α-tubulina são mostrados no lado direito. (**) Significância estatística entre duas leituras.

O nível Bim de LNCaP ou células PC3 diminuiu drasticamente após o tratamento paclitaxel, e correlacionados com a morte celular (Fig. 3A). Pedimos por isso que o nível de Bim foi significativamente reduzida após o tratamento paclitaxel. Mais uma vez, foram coletados e analisados ​​dados para as células aderidas e destacadas separadamente. Bim reduzida só apareceu na fracção individual, enquanto se manteve constante na fracção aderida tanto em células LNCaP e PC3, após tratamento com paclitaxel (S2 Fig.). Assim, o nível Bim reduzida não pode estar relacionada com o seu papel na via apoptótica.

Em seguida, perguntou se Bim envolve em via de apoptose induzida por paclitaxel em cancros da próstata por RNAi knockdown e coimmunoprecipitation, uma vez que é um Bim principal proteína só de BH3 necessária para a apoptose induzida por paclitaxel em câncer de mama [25]. Diferente de cancros da mama, os nossos resultados demonstraram que Bim knockdown não pode afectar a apoptose induzida por paclitaxel em células LNCaP (S3 Fig.). Além disso, não se observou interacção significativa entre Bim e Bcl-xl em IP (S3 Fig.). Estes resultados sugerem que o BIM pode não ser uma proteína de BH3 somente essencial responsável pela apoptose induzida por paclitaxel em cancros da próstata.

Bcl-XL ou Mcl-1 knockdown intensifica a apoptose em células LNCaP, mas não as células PC3

para perguntar se a sobre-expressão de Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1 em células PC3 pode contribuir para sua resistência paclitaxel, que explorou pela primeira vez que eles podem se envolver na via apoptótica. Os resultados demonstraram que a Bcl-XL knockdown por siRNA aumentou significativamente a activação de caspase 3 e a degradação de PARP em células LNCaP (Fig. 4). Mcl-1 knockdown também aumentou a activação de caspase 3 e a degradação de PARP em células LNCaP, mas o seu efeito não foi tão boa como a Bcl-XL knockdown (Fig. 4). Estes resultados sugerem que o Bcl-XL pode ser um factor importante que afecta a via apoptótica induzida por paclitaxel em células LNCaP.

Bcl-XL e Mcl-1 knockdown causou aumento da apoptose, avaliada pela activação da caspase 3 e PARP degradação em células LNCaP, mas não em células PC3. células LNCaP ou PC3 foram transientemente transfectadas com Bim, Bcl-XL ou Mcl-1 siRNA ou mexidos ARNsi durante 24 h. As células foram tratadas com /sem 50 nM de paclitaxel durante 48 horas, e, em seguida, submetidos a análise de imunotransferência. Caspase 3 (a): a forma activa da caspase 3. PARP (C): a forma da clivagem de PARP. Bcl-XL (s): A imagem exposição curta de Bcl-XL. Bcl-xl (l): a imagem de longa exposição de Bcl-XL. As experiências foram repetidas três vezes e os resultados representativos são mostrados. As respectivas leituras das imagens de imunotransferência da proteína Bcl-xl, Mcl-1 e de caspase 3 (um) normalizados para a-tubulina em células LNCaP são mostradas na parte inferior. Apenas knockdown com /sem tratamento paclitaxel foi quantificado. (**) Significância estatística entre duas leituras.

Em seguida, realizaram os mesmos testes em células PC3. Tivemos dificuldade derrubar a Bcl-xL de forma eficiente em células PC3, provavelmente devido ao elevado nível desta proteína (Fig. 4). Em contraste, o nível de proteína de Mcl-1 foi significativamente reduzida pela sua siRNA knockdown mas esta não teve efeito sobre a activação de caspase 3 e a degradação de PARP em células PC3 (Fig. 4).

A sobreexpressão de Bcl-xl mais contribuíram para o fenótipo resistente ao paclitaxel em células PC3

Desde que não poderiam de forma eficiente derrubar Bcl-xl para avaliar seu efeito na apoptose induzida por paclitaxel em células PC3, a nossa abordagem alternativa foi usar ABT -263 para knockdown química de Bcl2 e Bcl-XL simultaneamente. Além disso, utilizou-se ABT-199, um inibidor específico da Bcl-2, para distinguir entre Bcl2 e Bcl-XL em células PC3. Usando ABT-263 induziu a degradação de PARP e a activação de caspase 3 tanto em células LNCaP e PC3 (Fig. 5a). No entanto, o efeito de ABT-263 em células LNCaP foi cerca de 3 vezes maior do que para PC3 em termos da activação da caspase 3 (Fig. 5A). Significativamente, ABT-199 não apresentaram qualquer efeito apoptótica em ambos células LNCaP e PC3, descartando um papel anti-apoptótica de Bcl-2 no PC3.

(A) ABT-263, mas não ABT-199, poderia efectivamente provocar a degradação de PARP em células LNCaP e PC3 de um modo dependente da dose, mas que só podiam activar caspase 3 a um nível detectável em células LNCaP. A análise de imunotransferência de lisados ​​celulares de LNCaP ou células PC3 tratadas por ABT-199 ou ABT-263 sozinho durante 48 horas a várias concentrações, foram ensaiadas como indicado. Caspase 3 (a): a forma activada da caspase 3. Caspase 7 (a): sob a forma de activação de caspase 7. As experiências foram repetidas três vezes e os resultados representativos são mostrados. As leituras de caspase 3 (a) normalizado para GAPDH entre LNCaP e células PC3 tratadas com 5 uM de ABT-263 são mostradas na parte inferior. (**) Significância estatística entre duas leituras. (B) A combinação de 50 nM de paclitaxel com várias concentrações de ABT-263 teve um efeito sinérgico sobre a apoptose tanto em células LNCaP e PC3. A eficácia de ABT-263 em combinação com paclitaxel em células LNCaP foi maior do que em células PC3. A análise de imunotransferência de lisados ​​celulares de LNCaP ou células PC3 tratadas com paclitaxel em combinação com o ABT-263 ou ABT-263 sozinho durante 48 horas a várias concentrações, foram ensaiadas como indicado. Caspase 3 (a): a forma activada da caspase 3. Caspase 7 (a): sob a forma de activação de caspase 7. As experiências foram repetidas três vezes e os resultados representativos são mostrados. As respectivas leituras de caspase 3 (a) normalizados para o controlo interno, α-tubulina ou GAPDH em LNCaP ou PC3 com LNCaP são mostrados na parte inferior. (**) Significância estatística entre duas leituras.

Colectivamente os resultados sugerem que o Bcl-XL é o factor mais importante para a apoptose e a sua sobre-expressão contribui para o fenótipo de resistência ao tratamento com paclitaxel em células PC3. Além disso, também descobrimos que as células PC3 exibir resistência parcial para o tratamento de ABT-263, se a resposta de LNCaP ao mesmo tratamento é considerada como uma resposta completa.

A combinação de ABT-263 com o paclitaxel demonstrou um efeito sinérgico sobre a apoptose tanto em células LNCaP e PC3

Demonstrámos que ABT-263 sozinho pode conduzir células resistentes a paclitaxel paclitaxel-sensível e para a apoptose, embora a linha de células de LNCaP sensíveis ao paclitaxel mostra efeitos melhores do que o paclitaxel linha de células PC3 resistentes. Foram avaliados ainda mais o efeito da combinação de ABT-263 com paclitaxel. De modo significativo, os nossos resultados demonstraram que ABT-263 em combinação com paclitaxel tinham um efeito sinérgico sobre a apoptose tanto em células LNCaP e PC3 (Fig. 5B). No entanto, a eficácia deste tratamento de combinação foi maior em células LNCaP do que em células PC3 (Fig. 5B).

A sinergia entre o paclitaxel e ABT-263 para a activação da apoptose claramente demonstrado que ABT-263 pode neutralizar Bcl-XL em células sensíveis-paclitaxel e do paclitaxel-resistente do cancro da próstata. Segmentação de proteínas anti-apoptóticas tem o potencial para melhorar a quimioterapia para o cancro da próstata. No entanto, a diferença na activação de apoptose entre LNCaP e células PC3 para ABT-263 sozinho ou ABT-263 em combinação com paclitaxel sugerido que a via de apoptose em células PC3 pode diferir mais do que em células LNCaP, mesmo depois de Bcl-XL é contabilizado.

Discussão

em nosso estudo paclitaxel desencadeada apoptose no início da fração aderente de células LNCaP em resposta a G2 M prisão /. Em contraste, a apoptose precoce não podia ser detectada na mesma fracção de células PC3 ao longo de todo o curso de tempo, sugerindo que as células PC3 não respondem a G2 M prisão /para iniciar este programa de morte. Curiosamente, a morte celular PC3 ocorreu num estado independente após o tratamento com paclitaxel, principalmente através de necrose. Além disso, o nível Bim diminuiu apenas na fracção isolada de ambas as células após o tratamento com paclitaxel. Se a diminuição dos níveis de Bim está relacionado à morte celular em condições destacadas ainda precisa ser resolvido. Outro estudo indicou que Bim knockdown em células da próstata e cancro da mama causada separação celular e por fim, apoptose [26]. No entanto, não observamos o fenômeno descrito nesse relatório.

Se desprendimento de células pode acontecer

in vivo

em terapias anti-mitóticas é uma questão interessante que ainda não foi determinado. Logicamente, as células cancerosas cercadas por tecido conjuntivo pode ser muito difícil de separar de tecido de câncer após a quimioterapia anti-mitótico. Assim, a morte celular em resposta a G2 /M de detenção num estado aderida torna-se o ponto crítico para avaliar se células são sensíveis ou resistentes ao tratamento com paclitaxel. No presente estudo, foi demonstrado que células LNCaP exibem sensibilidade ao tratamento com paclitaxel, enquanto que as células PC3 mostram resistência.

Também demonstramos que sobreexpressão de Bcl-XL pode contribuir para o fenótipo resistente à apoptose de células PC3. Parece que o sinal de apoptose induzida por tratamento com paclitaxel pode não ser suficiente para neutralizar a sobre-expressão das proteínas anti-apoptóticas, tais como Bcl-XL em células PC3. Esta especulação é ainda apoiada pela combinação de paclitaxel com ABT-263 que teve efeitos sinérgicos sobre a activação de caspase 3 e a degradação de PARP em comparação com o paclitaxel ou o ABT-263 sozinho.

Na verdade, um estudo indicou que a sobre-expressão de Bcl-XL em carcinoma da próstata de elevado grau está associada com um fenótipo refractário a hormonas [27].