Sumário

A metástase das células cancerosas do cólon aumenta o risco de mortalidade por câncer de cólon. Temos demonstrado recentemente que o ginseng americano previne o câncer de cólon, e um extrato de hexano of American Ginseng (HAG) tem particularmente potentes propriedades anti-inflamatórias e anti-câncer. Desregulado expressão (MIR) microARN tem sido observada em várias condições de doença, incluindo o cancro do cólon. Usando mundial perfil de expressão de miR, observamos aumento de miR-29b em células de câncer de cólon após a exposição a HAG. Uma vez que o miR-29b desempenha um papel na regulação da migração de células de cancro, a hipótese de que HAG induz a expressão de miR-29b para segmentar metaloproteinase de matriz-2 (MMP-2) suprimindo assim a migração de células de cancro do cólon. Os resultados são consistentes com esta hipótese. Nosso estudo apóia a compreensão de que a segmentação MMP-2 por miR-29b é um mecanismo pelo qual HAG suprime a migração de células cancerígenas do cólon

Citation:. Poudyal D, Cui X, Le PM, Hofseth AB, Windust A , Nagarkatti M, et al. (2013) um papel fundamental de microRNA-29b para a Repressão da migração de células do cancro do cólon pela American Ginseng. PLoS ONE 8 (10): e75034. doi: 10.1371 /journal.pone.0075034

editor: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute, da Universidade de Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Abril 2013; Aceito: 07 de agosto de 2013; Publicação: 09 de outubro de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de CAM Investigação sobre doenças autoimunes e inflamatórias, concessão NIH 1P01AT003961-01A1 (PN, LJH, MN) eo COBRE financiado University of South Carolina Centro de Colon Cancer Research, NIH P20RR17698-01 concessão (Franklin Berger, Director). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cancro colorectal (CRC) é o terceiro câncer mais comumente diagnosticado em homens e mulheres e a terceira principal causa de morte por câncer. Nos EUA, a American Cancer Society estima 141,210 novos casos de cancro colorectal e 49,380 mortes em 2011. Metástase leva a 90% de casos de mortalidade relacionada ao câncer [1], [2]. Em princípio, durante a metástase do CRC, algumas células cancerosas da massa do tumor primário invadir o tecido circundante, intravasate na vasculatura de viajar através dos vasos sanguíneos e linfáticos, prisão em capilares distantes, extravasate no parênquima do tecido distante (principalmente fígado e os pulmões), onde semeiam novas colónias para formar os tumores secundários macroscópicas [3]. Estas células cancerosas metastáticas perdem a capacidade de aderir a células tumorais vizinhas e desenvolver propriedades migratórias e invasivos para divulgar aos órgãos metastáticos distantes. Enquanto isso, as células metastáticas sofrer alterações na expressão e função do gene, ganhando assim mais mesenchymal- como características e este processo é denominado como epitelial para mesenquimal Transição (EMT), um evento crucial na malignidade. MicroRNAs (MIRs) são pequenos RNAs não codificantes de aproximadamente 22 nucleótidos (nts) de comprimento que o pós-transcricionalmente regula a expressão de genes em plantas e animais. Em animais, MIRs transcritos alvo através de emparelhamento de bases de 2-7 imperfeita nts da extremidade 5 ‘de miR (os chamados “semente” de sequência) para vários locais nas regiões não traduzidas 3′ (UTRs) de ARNm alvo, e este imperfeita híbridos miR-mRNA com protuberâncias centrais (nt 9-12) recruta miRNP (complexo Ribonucleoproteína microRNA), que permitem a inibição de translação ou exonucleol�ica mRNA decadência [Avaliado em [4]]. Muitos genes de limpeza evoluíram com menor tempo de 3’-UTR para evitar a regulamentação miR [5]. Cerca de 50% dos genes humanos miR anotada estão localizados em regiões genómicas cancro associado ou sítios frágeis que são susceptíveis a amplificação, deleção e translocação em grande variedade de tumores, incluindo tumores do cólon [6]. Devido a este algumas miRs poderia actuar quer como supressor de tumores ou oncogenes [7], [8], [9], [10], [11]. análise de perfil de expressão revelou assinaturas miR característicos que podem prever os resultados clínicos de CRC [12], [13].

Uma das características clássicas de câncer é a capacidade de células tumorais para invadir e metástase [14] . miRs são ambos os reguladores positivos e negativos da metástase do cancro [15], [16], [17]. Um regulador negativo da metástase do cancro é o miR-29b [Por exemplo [18], [19], [20], [21], [22]]. miR-29b pertence à família de miR-29. A família miR-29 é composto por três parálogos: miR-29a, -29b e -29c. miR-29a e miR-29b1 estão localizados no cromossoma 7q32; miR-29b2 e miR-29c estão localizados no cromossoma 1q23 [23]. sequências de miR-29b1 e miR-29b2 são idênticos, mas distinguem-se b1 e b2, devido à diferença no local. MMP-2, uma matriz extracelular (ECM) enzima de degradação que tem uma grande implicação na metástase e angiogénese foi demonstrado que é o alvo directo de miR-29b [20]

ginseng americano (AG;.

Panax quinquefolius

) é um sombra nativa perene obrigatório da América do Norte. De Bioensaio guiada fraccionamento de AG, que demonstraram recentemente que uma fracção de hexano AG (HAG) é um anti-oxidante e anti-cancro potente agente de [24], [25]. Até à data, estando apenas limitada estudos anti-cancro dos extractos lipofilicos de AG foram realizadas, e estes estudos estão principalmente focados em efeitos anti-proliferativos e citotóxicos [26], [27], [28], [29]. Para entender melhor o mecanismo anti-câncer do HAG (um extrato lipofílico), estudamos o papel de miR na migração de células cancerosas.

Materiais e Métodos

Fraction hexano da AG

O

P. quinquefolius

extracto foi descrito previamente em detalhe pelo nosso laboratório [30]. Como assim, que recentemente descreveu a geração do HAG utilizado no presente estudo [24].

Cell Cultures

HCT 116 do tipo selvagem (WT), LaVO e DLD-1 de cólon as células cancerosas foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Células HCT 116 foram cultivadas em meio de McCoy (ATCC, Manassas, VA); células LOVO eram cultura em meio F-12K (ATCC, Manassas, VA); e DLD-1 As células foram cultivadas em meio RPMI-1640. Todos os meios foram suplementados com 10% recém-nascido Soro de Vitelo (NBCS; Gibco /Life Technologies, Grand Island, NY), 2 mM de glutamina (Biofluids, Rockville, MD), penicilina (10 U /ml, Biofluids) e estreptomicina (10 ug /ml, Biofluids).

global mir Expressão

HCT 116 células WT foram semeadas a 1 × 10

6 células /placa em placas de 6 poços em quatro repetições. Depois da cultura durante 24 h, 260 ng /ml HAG foi adicionado em cada poço. As células foram recolhidas a 0, 12, e 24 h separadamente em tubos de PE RNase livre. O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Ambion, Austin, TX). A concentração de RNA foi determinada pelo Nanodrop 2000 (NanoDrop, Wilmington, DE). 100 ng de ARN a partir de células HCT 116 WT foi utilizado para a expressão v1.2 Ensaio nCounter miARN (Nanostring Technologies, Seattle, WA) contendo 800 de miARN seguindo as instruções do fabricante.

miR-29b Expressão

As células foram semeadas, expostas a veículo (apenas meio) ou 260 ug /ml de HAG e colhidas às 24 h. Para a detecção de miR-29b, 10 ng de ARN total foi usada para inverter-transcrever para ADNc utilizando o kit TaqMan miR Transcrição Reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante e iniciadores miR específicos para HSA-miR-29b para a detecção e o pequeno RNU6B proteína nuclear (U6) para a normalização (Applied Biosystems). medição de qPCR de miR-29b e U6 expressão foi realizada utilizando TaqMan Ensaios miR (Applied Biosystems) com o Sistema de Ensaio de PCR 7300 (Applied Bioystems). O método de ciclo limiar comparativa (Ct) foi usada para avaliar a abundância relativa de miR-29b em comparação com a expressão U6 (dobrar as mudanças relativas ao U6). Todos os tratamentos experimentais foram realizados em três ocasiões separadas; cada vez com três repetições.

siARN e miR Transfecção

para MMP-2 de siRNA, 1,5 × 10

5 células foram cultivadas em meio em placas de 6 poços um dia antes da transfecção. Usando INTERFERin siARN Transfection Reagent (Plyplus, iLllkirch, França), as células foram transfectadas com 5 nM de MMP-2 Trilencer-27 humana siRNA (Origene, Rockville, MD). Após 48 h de transfeco, as culas foram processadas para análise de Western blot para avaliar a eficácia de derrubar (Figura S3). Para inibidor miRvana-miR-29b e inibidor de controlo miRvana-negativa (Ambion, Austin, TX) transfecção, 1,5 x 10

5 células foram cultivadas em meio em placas de 6 poços um dia antes da transfecção. Usando INTERFERin siARN Transfection Reagent (Polyplus transfecções, Illkirch, França), as células foram transfectadas com 10 nmol /L de inibidor de miRvana-miR-29b ou inibidor de controlo miRvana-negativa. Após 48 h de transfeco, as culas foram colhidas em tubos de PE RNase livre. O ARN total foi extraído utilizando TRIzol Regent. A concentração de RNA foi determinada por Nanodrop 2000. 10 ng de ARN total foi transcritos de modo inverso em ADNc utilizando o kit TaqMan MicroRNA transcrição reversa com os iniciadores específicos para HSA microRNA-miR-29b e o pequeno RNU6B proteína nuclear (U6) para normalização. medição de qPCR de miARN-29b e U6 expressão foi realizada utilizando TaqMan microARN Ensaios de PCR com o Sistema de Ensaio 7300. A mudança vezes em relação em nível de miR-29b foi usado para representar a abundância relativa de miRNA-29b em comparação com a expressão U6. De acordo com o fornecedor de inibidor miRvana-miR-29b (Ambion por Life Technologies, Austin, TX), a eficácia com que as células de mamífero são transfectadas com o inibidor de miR-miRvana depende do tipo de célula e agente de transfecção utilizado. Recomenda-se que a optimização experimental (concentrações desde 1 nM a 100 nM de inibidor de miR) ser realizado para obter a actividade máxima com citotoxicidade mínima. A eficácia de transfecção e a origem de 3 linhas celulares HCT116, LoVo e DLD-1 são diferentes e a partir do experimento de optimização (dados não mostrados), miRvana miR-29b Inibidor mostrou actividade máxima a 10 nm após 48 horas de transfecção para células HCT116 e 50 nM para células LoVo e DLD-1. Após 48 h de transfecção com Inibidor miRvana-miR-29b, foi adicionado HAG (260 ug /ml) durante 24 horas e as células foram colhidas para expressão do gene alvo (MMP-2) e para o ensaio de migração. Todas as amostras de controlo experimentais foram tratados com uma concentração igual de uma sequência de controlo negativo inibidor não-direccionamento, para uso como controlos para os efeitos não-específicos de sequência em experiências com miR. controles transfectadas por simulação não produziu qualquer efeito significativo sobre qualquer um dos parâmetros analisados.

Análise mRNA

O RNA total foi extraído utilizando Trizol reagente (Invitrogen, CA). Um? G de ARN total serviu como molde para a síntese de cDNA de cadeia simples numa reacção utilizando oligo (dT) e iniciadores de transcriptase inversa de AMV (Promega Corp., WI), sob as condições indicadas pelo fabricante. PCR de amostras de cDNA foi realizada com amostras amplificadas durante 30 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 30 s, emparelhamento a 50 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 30 s com extensão final a 72 ° C durante 10 min . As sequências para os iniciadores Real Time PCR utilizados foram: MMP-1 directo 5′-AGG TCT CTG AGG GTC AAG CA-3 ‘; MMP-1 reverso 5’-CTG GTT GAA AAG CAT GAG AC-3 ‘; MMP-2 directo 5’-TCA ACA GCA TTC AGG AGG AG-3 ‘; MMP-2 reverso 5’-CCG TCG ACC TAT GCA TCA AT-3 ‘; MMP-7 directo 5’-GAG TGC ATG CAG TTG CAG AA-3 ‘; MMP-7 reverso 5’-AAA TGC AGG GGG ATC TCT TT-3 ‘; MMP-9 directo 5’-TTG GCG ACA ACA AGT AGA GG-3 ‘; MMP-9 reverso 5’-GCC GTC ATT CAC CTT GTC AT-3 ‘e 5′-GAPDH para a frente GAG ​​TCA ACG TTG GAT GTC GT-3′, reverso 5’-GAPDH TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3 ‘( Tecnologias de ADN integradas, Inc). PCR em tempo real (qPCR) foi realizada utilizando a PCR em Tempo Real Sistema de Ensaio 7300 (Applied Biosystems, CA) com potência SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA) e os iniciadores para a MMP-1, -2, -7, -9 e GAPDH de acordo com o protocolo do fornecedor. A expressão de genes MMP foi normalizada pela expressão do gene GAPDH. A mudança vezes na expressão do gene é relativo ao vector tratado [1x Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)] as células colhidas às 24 h.

Western Blot e análise de anticorpos

As transferências de Western foram realizadas tal como descrito anteriormente [31]. Os anticorpos utilizados incluem: MMP-2 (policlonal de coelho, diluído 1 em 500, Cat # 4022s; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), e GAPDH (policlonal de coelho, diluído a 1: 1000, Cat # 5174; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Para todos os borrões, uma proteína padrão (benchmark prestained Escada Protein; Invitrogen, Carlsbad CA) foi executado para garantir o peso molecular correcto de cada bandas observadas. anticorpos secundários anti-coelho conjugados com peroxidase de rábano foram adquiridos a Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Os anticorpos secundários foram diluídas a 1:2000. Todos os anticorpos foram diluídos em 5% leite /PBST (0,1% de Tween 20 em 1 × PBS). sinal de Western blot foi detectada por Pierce ECL Western Blotting Substrato (Thermo Scientific, Rockford, IL) e desenvolvido em Hyperfilm.

In Vitro

Ensaio de Migração

A 24 bem Costar Transwell de suporte permeável com uma 8 mícrons de tamanho de poro da membrana de policarbonato (Corning Incorporated, NY), e com uma inserção de 6,5 milímetros foi utilizado para analisar a migração de células tumorais. Para este ensaio de migração, a membrana Transwell foi embebida com 15 ug /ml de colagénio tipo I (BD Biosciences) durante 30 min a 37 ° C em meio isento de soro. O colagénio foi removida por pipetagem e colagénio membrana revestida foi lugar sobre uma placa de 24 poços. As células foram privadas de soro durante 12 horas e 50.000 células foram ressuspensas em 200 ul de meio isento de soro Médio (SFM) e transferido na câmara superior do Transwell. A câmara inferior foi preenchida com 750 ul de SFM ou meio de crescimento completo (10% NCS suplementado, como um quimioatractor para células) ou HAG (260 ug /ml em meio completo). A placa transwell foi incubada a 37 ° C durante 12 h. Após a incubação, o meio foi removido da câmara, a membrana Transwell foi lavada em 1X PBS e as células foram fixadas por formaldeído (3,7% em PBS) e permeabilizadas por metanol a 100% e coradas com 0,4% de corante violeta de cristal. A membrana foi lavada com PBS 1X e não migrada sobre o topo da membrana Transwell foram raspadas com a mecha de algodão estéril. A membrana Transwell foi cortada da câmara transpoço e fixos em lâmina de microscópio, com Permount e visto sob o microscópio (aumento de 100x). 7 secções aleatórias foram fotografados a partir de cada lâmina e as células que migraram na parte inferior da membrana foram contados automaticamente Transwell usando o software Image J. (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Análise estatística

para análise global miR, todos os dados foram importados para Software análise NSolver v1.0 (Nanostring Technologies) e normalizados para a média geométrica dos 100 miRs com os valores mais altos de expressão. de dados normalizado foi importado para BRB-ArrayTools v4.1.0 para análise. Antes da análise, os dados foram filtrados, onde qualquer valor inferior a 10 foi omitida e miR qualquer falta na 50% das amostras foram excluídos deixando 248 de miR para análise. Os critérios de filtragem foi fixado de tal modo que qualquer ponto de dados normalizado 10 ou o valor de 3,321928 foram chamados ausente e foram excluídos porque é que o nível de fundo. Apenas os pontos de dados 10 ou valor de dados log2 transformado 3.321928 foram tomados em consideração e passou os critérios de filtragem deixando 248 miRs para análise. teste de comparação de classe utilizados t de Student para comparar miR do das células não tratadas tratados vs.. testes de tendência utilizados modelos de regressão linear em variáveis ​​categóricas ordenadas de 0 h, 12 h e 24 h. O procedimento Benjamini-Hochberg foi usado para calcular as taxas de descoberta de falsas. Quando mais do que dois grupos foram comparados, determinou-se diferenças estatisticamente utilizando uma análise de uma via da variância, seguida pelo teste de comparação múltipla de Scheffe um. Se dois grupos foram comparados, utilizou-se um teste t de Student. O valor P escolhido para significância neste estudo foi de 0,05.

Resultados

HAG Induz miR-29b em células de cólon

American Ginseng e HAG têm ambos exerceram efeito preventivo sobre o modelo induzido quimicamente cancro do cólon [24], [32]. Para iniciar nosso estudo, uma vez que miRs foram mostrados para ter tanto pró-tumorais e anti-tumorais propriedades, olhamos para o efeito de HAG na expressão global de miR em células de câncer de cólon. Houve uma correlação significativa positiva em 2 miRs, e correlação negativa significativa em 6 miRs após a exposição das células HCT 116 a HAG (260 ug /ml) durante 0 h, 12 h e 24 h (Tabela 1). Com base no pressuposto de que a família de miR-29 foi regulada negativamente em várias malignidades [21], [23], [33], [34], que vários estudos têm mostrado que a regulação de miR-29 para ter efeitos anti-tumorais [22], [35], e que o aumento da expressão de miR-29b foi mostrado com dois métodos estatísticos diferentes (Tabelas 1 e 2), voltadas para essa miR. Para confirmar miR-29b-regulação pela HAG, que repetiu a experiência e examinou miR-29b regulação positiva por qRT-PCR. Consistente com os resultados de análise de miARN globais, a Figura 1 mostra que houve um aumento da expressão de miR-29b (7,3-vezes) com uma exposição de células HCT 116 a HAG. Houve também um aumento na expressão de miR-29b com a exposição de duas outras linhas de células de câncer de cólon (DLD-1, 3,1 vezes; e LOVO, 1,5 vezes). (Figura 1)

HCT 116, DLD -1 e células LOVO foram expostas a 260? g /mL HAG durante 24 h (n = 3 por ponto de tempo). níveis endógenos relativos de expressão de miR-29b foram detectados por qRT-PCR utilizando iniciadores Taqman e sondas para detectar madura miR-29b e o pequeno ARN nuclear RNU6B (U6), um controlo interno. Os níveis de expressão de miR-29b relativos foram normalizados ao valor médio das amostras não tratadas (0 h). *, Indica diferença significativa (pValue 0,005). A partir da 0 h de controle

HAG Suprime MMP-2 expressão em células cancerígenas do cólon

alvo potencial genes de miR-29b foram inicialmente previu usando bancos de dados on-line, incluindo miRTarBase, TargetScan, PicTar, e miranda. MMP-2 foi previsto para ser o alvo potencial de miR-29b por todas estas bases de dados (Figura 2A). Porque MMP-2 é sobre-expresso em tecidos tumorais [36], [37], [38], e tem uma implicação direta na metástase e angiogénese de células de câncer [39], [40], primeiro examinados os efeitos de HAG em MMP expressão -2. O tratamento de células HCT-116 com ASS durante 24 h resultou numa redução da expressão do gene de MMP-2 em aproximadamente metade dobrar [(1 ± 0,14-0,57 ± 0,05), p-valor = 0,078] (Figura 2B). HAG tratamento durante 24 h, reduziu significativamente a expressão do gene de MMP-2 em células DLD-1 [(1 ± 0,03 para 0,03 ± 0,01), p-valor 0,005] (Figura 2D). De modo semelhante o tratamento de células LOVO com ASS durante 24 h resultou numa redução da expressão de MMP-2 [(1 ± 0,06-0,74 ± 0,017), p-valor 0,05] (Figura 2F). Para verificar se HAG reduz a actividade de MMP-2, as células HCT-116 foram tratadas com ASS durante 24 h e a proteína de MMP-2 foi analisada. Figura S4, HAG reduziu o pró e ativo-expressão da proteína MMP-2; confirmando que HAG reduzida MMP-2 atividade e expressão gênica. Adicionalmente outras MMPs degradantes ECM, tais como MMP-1, MMP-7 e MMP-9 não expressão do gene foi regulada por tratamento HAG (Tabela S2). Curiosamente, estes MMPs (MMP-1, -9 e -7) não são o alvo directo de miR-29b.

(A) miR-29 família (miR-29a /b /c) e a sua putativa sequência de ligação na 3’UTR do gene de MMP-2. A sequência de semente da família miR-29 é mostrado na caixa. (B) As células WT HCT116 foram expostas a 260? G /mL HAG durante 24 h. células (C) HCT116 transfectada com 10 nM de miRvana miR-29b, 48 h e expostas a 260 ug /ml HAG durante 24 h. células (D) DLD-1 foram expostas a 260? g /mL HAG durante 24 h. (E) As células DLD-1 transfectadas com 50 nM de miRvana miR-29b, 48 h e expostas a 260 ug /ml HAG durante 24 h. Células LOVO (F) foram expostas a 260? g /mL HAG durante 24 h. Células LOVO (g) transfectadas com 50 nM de miRvana miR-29b, 48 h e expostas a 260 ug /ml HAG durante 24 h. Relativa nível de expressão de MMP-2 foi detectada por qRT-PCR. mRNA MMP-2 para cada amostra foi normalizada pela expressão de GAPDH. Dobrar a mudança no nível de ARNm de MMP-2 foi relativo de células não-tratadas colhidas às 0 h (n = 3 por ponto de tempo). Os resultados indicam a Fracção de hexano AG suprime nível de ARNm de MMP-2 em comparação com as células não tratadas. *, Indica diferença significativa, o valor de P . 0,05 de 0 h de controle

Além disso, para verificar se a HAG supressão mediada do gene MMP-2 é dependente de miR-29b, que silenciou miR- 29b (Figura S1), utilizando um inibidor de miR-29b (ver métodos 4.2.5). O HAG não suprimir a MMP-2 expressão do gene quando miR-29b é silenciado (Figuras 2C, 2E e 2G). Na verdade, há um aumento de 2,4 vezes na expressão de MMP-2 em miR-29b células HCT116 silenciados quando expostos a HAG, 24 h (Figura 2C). Não houve diminuição na expressão do gene de MMP-2 em miR-29b silenciados células cancerígenas do cólon DLD-1 LOVO e quando exposta a HAG, 24 h (Figuras 2E e 2G). Todos juntos, estes resultados são consistentes com a hipótese de que a supressão da MMP-2 pela HAG é dependente de miR-29b.

HAG Suprime migração de células do cancro do cólon

alvos de miR-29b chave jogadores para reprimir a invasão e metástase [19], [20], [21], [22]. MMP-2 está envolvido na migração de células de cancro do cólon (Tabela S1; S2 Figura). redução de cerca de 3,5 vezes no número de células que migraram /campo microscópico nas células HCT116 de MMP-2 batida /as células em comparação com as células HCT116 WT na presença de 10% de soro como quimioatractora é relatado (Tabela S1; Figura S2). Esta é uma clara indicação de que MMP-2 é um fator chave na regulação da migração celular, no entanto, não deve excluir-se que outras MMPs degradantes ECM tais como MMP-1, MMP-7, MMP-9 e MMP-13 têm foi demonstrado estar associada com a progressão do cancro colorrectal [37], [41], [42], [43], [44]. Desde HAG-se-regula a expressão de miR-29b e sub-regula a expressão de enzimas degradantes gene MMP-2 ECM, investigou ainda mais o efeito funcional de HAG sobre a migração de células de cancro. Em células HCT116, HAG suprimiu a migração de células cancerosas por quase sete vezes (Figuras 3A e 3C). No miR-29b silenciados células HCT-116, HAG não suprimiu a migração. Consistente com a MMP-2 resultados (Figura 2C), na ausência de actividade de miR-29b, HAG elevado o número de células que migram para a câmara inferior de Transwell membrana quase 2,5 vezes quando comparado com o controlo positivo (Figuras 3B e 3D). Da mesma forma, HAG suprimiu a migração de células DLD-1 apenas na presença de miR-29b, onde se reduziu o número de células que migram de quase 5 vezes em comparação com o controlo positivo (Figuras 4A e 4C). HAG não exerceu atividade anti-migratório quando miR-29b foi silenciado em células DLD-1 (Figuras 4B e 4D). No geral, os resultados aqui mostram miR-29b está na encruzilhada na capacidade de HAG para exercer actividades anti-migratórias.

O colágeno tipo I (15 ug /mL) câmara de Transwell revestido foram aplicados com 5 × 10

4 HCT116 (A /B) durante 12 h. A câmara inferior contém SFM /Soro (10%) ou HAG (260 ug /mL em meio completo). (A) As células WT 5 × 10

4 HCT116 foram aplicadas para a câmara superior da membrana Transwell. (B) 5 × 10

4 HCT116 (transfectadas com Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h), as células foram aplicadas para a câmara superior da membrana Transwell. Após 12 h de incubação a 37 ° C, as células migraram para o interior (membrana inferior) Transwell de membrana foi contada utilizando o software ImageJ (7 campos aleatórios microscópicas (100X) foram avaliados por contagem de células). (C) representa a imagem representativa da migração de células HCT116 WT a partir de cada tratamento. (D) ilustra a imagem representativa de HCT116 (transfectadas com Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h) a migração de células de cada tratamento. O fundo na imagem mostra o poro de 8 um na membrana Transwell. * Indica diferença estatisticamente significativa (p-valor 0,005) quando comparado com SFM. #, Mostram uma diferença significativa (p-valor 0,005). Quando em comparação com 10% de soro

O colagénio do tipo I (15 ug /mL) câmara Transwell revestidas foram aplicados com 5 × 10

4 As células DLD-1 (A /B) durante 12 h. A câmara inferior contém SFM /Soro (10%) ou HAG (260 ug /mL em meio completo). (A) 5 x 10

4 células DLD-1 WT foram aplicadas para a câmara superior da membrana Transwell. (B) 5 × 10

4 DLD-1 (transfectadas com Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h), as células foram aplicadas para a câmara superior da membrana Transwell. Após 12 h de incubação a 37 ° C, as células migraram para o interior (membrana inferior) Transwell de membrana foi contada utilizando o software ImageJ (7 campos aleatórios microscópicas (100X) foram avaliados por contagem de células). (C) representa a imagem representativa de DLD-1 migração celular WT a partir de cada tratamento. (D) ilustra a imagem representativa de DLD-1 (transfectadas com Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h) a migração de células de cada tratamento. O fundo na imagem mostra o poro de 8 um na membrana Transwell. *, Indica diferença significativa (pValue 0,005), quando comparado com SFM

Discussão

Aqui nós demonstramos que HAG suprime migração de células de câncer de cólon.. Esta propriedade anti-metastático de HAG é mediada pelo aumento da regulação do microRNA-29b, que visa diretamente e para baixo-regula uma molécula-chave envolvida na metástase, MMP-2

Análise global miR de HAG -. Tratada células HCT116 resultou na expressão elevada de miR-29b que combinava tanto a tendência e análise estatística fold-change (Tabelas 1 e 2). Houve 8 miRNAs (HSA-miR-938, hsa-miR-203, hsa-miR-1975, hsa-miR-29b, HSA-miR-600, hsa-miR-1244, hsa-miR-548o e hsa-miR -590-5p) que foi estatisticamente (p 0,05) para cima ou para baixo-regulado. Um coeficiente de correlação positiva indicou aumento dos níveis de miR com o aumento da exposição a HAG (0 h para 12 h para 24 h) com apenas 2 miRs (HSA-miR-29b e hsa-miR-590-5p) que caem nesta categoria. Destes 2 miRs, miR-29b teve o valor mais alto coeficiente de correlação de 0,621. Assim, uma vez que o miR-29b também foi estatisticamente significativamente sobre-regulada por HAG na análise mudança vezes (Tabela 2), e que esta miR tem sido mostrado por outros para desempenhar um papel supressor de tumores [23], [33], [ ,,,0],45], [46], [47], nós nos concentramos em miR-29b para este estudo particular. O papel de miR-29b como um supressor de tumores tem sido bem elucidadas em várias condições malignas, incluindo, LMA [23], [45], do pulmão [33], CLL [46], [47] e colangiocarcinoma [48]. A regulação negativa da família miR-29 foi avaliado em vários cancros humanos, incluindo os de pulmão [49], da próstata [50], o cancro da mama invasivo [51]. Recentemente, Kuo et’al relataram um nível de expressão mais baixos do miR-29a /c num grupo precoce recorrência do cancro colo-rectal em comparação com a de um grupo não-recidiva precoce indicando expressão de baixo nível de miR-29a /C como um biomarcador potencial de recorrência precoce da CRC [52]. Nossos resultados têm melhor elucidados os possíveis mecanismos deste achado

A família miR-29 é composto por três membros:. MiR-29a, miR-29b, e miR-29C (miR29a /b /c) que exibem alta similaridade de sequência e partilham uma sequência comum de sementes para reconhecimento do alvo (Figura 2A). Outros relataram uma relação inversa com a expressão de miR-29b e MMP-2 [20], [22], [53], [54]. Assim, porque miR bases de dados (miRTarBase, TargetScan, PicTar, e Miranda) indicam a MMP-2, como um alvo potencial de miR-29b, foi examinada a importância funcional deste. MMP-2, também conhecida como gelatinase A ou colagenase de tipo IV, é uma enzima de degradação de ECM, e é amplamente expressa na maioria dos tecidos e células [55]. Assim, a MMP-2 é sobre-expressa em tecidos tumorais [36], [37], [38] e a activação de MMP-2 resulta na degradação da ECM, o que facilita a invasão e metástases de células de tumor [56]. Os nossos dados em tempo real de RT-PCR mostrou que HAG reduz a expressão de MMP-2 por 2 vezes em células HCT116 e a redução de aproximadamente 30 vezes em células DLD-1 (Figuras 2C e 2E). HAG também reduziu MMP-2 a expressão da proteína (Figura S4). Quando a actividade de miR-29b é silenciado por transfecção de células de cancro do cólon com um inibidor miRvana miR-29b (Figura S1), hag não tem nenhum efeito sobre a redução de MMP-2 de expressão (Figuras 2C, 2E e 2G) e, em certa medida induzida a MMP expressão -2. A razão pode ser devido à ausência de endógena miR-29b, HAG foi incapaz de regular o miR-29b que reforçada a secreção de MMP-2. Alguns dos componentes presentes na hag, pode ter o potencial para aumentar a expressão de MMP-2 directamente na ausência de endógena miR-29b, no entanto, este necessita de mais estudo a ser confirmado. Portanto, um processo de isolamento vigorosa de componentes ativos da HAG é estudos em curso e futuras em relação a este estão na linha. Todos em conjunto, os nossos dados sugerem que o miR-29b é crítica para HAG para suprimir a expressão de MMP-2 em células cancerosas.

As metaloproteinases de matriz têm sido considerados moléculas importantes auxiliar células de tumor durante a metástase [57], [58 ], [59], [60]. As MMPs são uma família de endopeptidases que contêm zinco melhor conhecidas pelo seu papel na remodelação fisiológica e patológica da ECM durante a angiogénese, a cura de feridas, a embriogénese, metástase de tumor, e várias doenças cardiovasculares e inflamatórias [61], [62]. Tem sido demonstrado que o miR-29b está envolvido na regulação negativa de metástases em vários tipos de cancro [18], [20], [63]. Combinando estes resultados, onde miR-29b é um regulador negativo de metástase e metas jogador-chave da metástase MMP-2, e HAG induz miR-29b e suprime a MMP-2 expressão (Tabelas 1 e 2 e Figuras 1, 2 e S4), que fez a pergunta, se HAG funcionalmente suprime a metástase das células do câncer de cólon. Nós demonstramos que HAG funcionalmente suprime o

in vitro

metástase de células cancerígenas do cólon através da realização de ensaio de migração de células de câncer de cólon (Figuras 3A, 3C, 4A e 4C). Na ausência de actividade de miR-29b, HAG não era eficaz em suprimir a migração de células de cancro do cólon (Figuras 3B, 3D, 4B e 4D). Embora, ainda a ser mostrado

in vivo

, todos juntos, a nossa

in vitro

dados indicam que HAG desenvolve a sua actividade anti-metastático, regulando miR-29b.

Maior componentes presentes no extracto de hexano (extracto lipofílico) de AG são poliacetilenos (Panaxydiol, panaxydol e panaxynol), que compreende cerca de 50% do total de extracto, bem como ácidos gordos, com quase nenhuma ginsenósidos [24]. Mostrámos recentemente que HAG possui propriedades anti-inflamatórias e anti-cancro [24]. Vários outros estudos sobre as propriedades anti-inflamatórias e anti-cancro de ginseng americano têm-se centrado na ginsenosídeo ou o teor de saponina de ginseng [64], [65], [66], [67], que é obtido a partir de um extracto de etanol aquoso (solvente polar) de ginseng.