Humana

Abstract

O gene supressor de tumor APC é frequentemente mutado no cancro colorectal humano, com mutações nonsense representando 30% de todas as mutações neste gene. Reintrodução do gene WT APC em células cancerosas geralmente reduz tumorigenicidade ou induz a apoptose. Neste estudo, exploramos a possibilidade de utilização de drogas para induzir prematura codão de terminação (PTC) readthrough (aminoglicosídeos, negamycin), como um meio de reactivação endógena APC. Ao quantificar a readthrough de 11 mutações nonsense em APC, fomos capazes de identificar aqueles que dá os mais altos níveis de readthrough após o tratamento. Por estas mutações, foi demonstrado que aminoglicósido ou tratamento negamycin levou a uma recuperação da actividade biológica da APC em linhas celulares de cancro e mostrou que o nível de actividade de APC foi proporcional ao nível de readthrough induzida. Estes resultados mostram que o tratamento com indutores readthrough deve ser considerada como uma estratégia potencial para o tratamento de cancros causados ​​por mutações sem sentido do gene APC. Eles também fornecem uma base racional para a identificação de mutações que respondem a indutores readthrough

Citation:. Floquet C, Rousset JP, Bidou L (2011) Readthrough de códons de terminação prematura na Coli Gene polipose adenomatosa Restaura sua atividade biológica in Human Células cancerosas. PLoS ONE 6 (8): e24125. doi: 10.1371 /journal.pone.0024125

editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de fevereiro de 2011; Aceito: 04 de agosto de 2011; Publicado: August 31, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Floquet et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos da Association pour la Recherche sur le Câncer (ARC No. 5016 para JPR) e Association Française contre les Miopatias (contrato 13986). CF foi financiado em parte pelo Ministério da Educação e da Investigação francês e em parte por uma bolsa da Ligue Nationale Cancer Contre le. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O gene supressor de tumores APC (adenomatous polyposis coli) codifica uma proteína de múltiplos domínios 311 kDa com sítios de ligação para vários parceiros, incluindo os microtúbulos, axina e beta-catenina [1]. Esta proteína funciona como um regulador negativo da via Wnt, que está implicado na transactivação de genes alvo tais como o oncogene c-myc e o gene ciclina D1 [2]. O gene APC está mutado em 80% dos cancros do cólon e mutações ocorrem precocemente no desenvolvimento da maioria dos cancros colo-rectais poliplóides. Tem sido demonstrado que a reintrodução do gene APC do tipo selvagem em células cancerosas geralmente reduz a tumorigenicidade ou induz apoptose [3], [4]. Em geral, 30% de todas as mutações neste gene estão mutações nonsense [5].

Nos últimos anos, certos antibióticos têm sido mostrados para interferir com o ribossoma de mamífero, induzindo a readthrough de codões de paragem prematuro (PTCs ). Os aminoglicósidos são os antibióticos mais frequentemente estudados, a este respeito, e vários estudos têm sugerido que estas drogas podem ser utilizadas em estratégias inovadores para o tratamento de doenças genéticas causadas por mutações sem sentido (para revisão [6], [7], [8]) . O dipéptido negamycin antibiótico não está estruturalmente relacionado com aminoglicósidos [9] e verificou-se ser mais eficaz do que a gentamicina para promover a readthrough de alguma mutação sem sentido [10]. Este medicamento pode constituir um tratamento alternativo atraente para pacientes portadores de uma mutação nonsense.

Em um estudo recente, foi demonstrado que mesmo um nível readthrough induzida por aminoglicosídeo modesta (6%) desencadeou a apoptose das células cancerosas abrigando um absurdo -mutated gene p53 [11]. Estes resultados forneceram a prova de conceito de que os indutores readthrough pode ser utilizado no tratamento de cancros relacionados com a presença de uma mutação sem sentido num gene supressor de tumor. No presente estudo, investigamos a possibilidade de alargar esta abordagem ao câncer ligada a uma mutação nonsense no gene APC. Recentemente, Zilberberg et ai mostraram que os indutores readthrough melhorou os sintomas clínicos da tumorigénese em um modelo de rato transportando uma mutação sem sentido no gene APC. No entanto, a ligação entre o nível mais baixo de desenvolvimento do tumor e PTC readthrough não foi estabelecida [12]. É cada vez mais evidente que apenas um subconjunto de mutações nonsense beneficiaria de tratamento de gentamicina, dependendo do contexto de nucleótidos [13], [14], [15], [16].

avaliada a eficiência de readthrough 11 mutações nonsense envolvidos no câncer colorretal, com vista a identificar as mutações nonsense no gene APC a mais responsiva aos tratamentos de indução readthrough. Para as mutações com os mais altos níveis readthrough, incluindo uma mutação endógenos, o tratamento antibiótico resultou na recuperação da actividade biológica de APC.

Resultados e Discussão

Identificação de mutações nonsense APC que respondem ao tratamento de aminoglicosídeos

Foram estudados 11 mutações nonsense encontrados em 23% das células cancerosas carregando uma mutação nonsense no gene APC (T. Soussi, comunicação pessoal). Readthrough eficiência tem sido demonstrado que dependerá da natureza das sequências que rodeiam o codão de paragem [13], [17], [18], [19]. Assim, para cada mutação, inserimos uma região que engloba os contexto envolvente (27 nucleotídeos) para o pAC99 vector dupla repórter (Tabela 1). Readthrough foi quantificada em células NIH3T3 transfectadas transientemente com o vector repórter duplo, na presença ou ausência de gentamicina (Figura 1). taxas Readthrough variou de 0,01% (Q1131X) a 0,2% (L360X) para readthrough basal, e de 0,09% (APC Q789X) a 1,6% (L360X) na presença de 800 ug /ml de gentamicina. variações semelhantes em níveis readthrough basais e capacidade de resposta aos aminoglicosídeos têm sido relatados em vários estudos anteriores [13], [18]. Também testámos outro antibiótico, a amicacina, o qual deu os níveis readthrough semelhantes ou inferiores do que aqueles obtidos com gentamicina (dados não mostrados). Este resultado é consistente com um estudo anterior de Howard et ai, que compararam a actividade de vários readthrough aminoglicosídeos [20].

eficiências Readthrough para 11 mutações nonsense no gene APC foram avaliadas em células NIH3T3 com e sem gentamicina ( /ml) de tratamento de 800 ug por 24 h. Duas mutações nonsense (L360X e R1114X) apresentaram níveis de readthrough induzida por gentamicina de mais do que 0,5%. Meios valores são apresentados, juntamente com o erro padrão da média (SEM) (n = 5).

Foi avaliado se os níveis readthrough foram semelhantes em células de origem cólon, também por avaliar o readthrough dirigido por cada mutação nonsense no colorectal linha de células de câncer de DLD-1. Os resultados obtidos foram semelhantes aos de células NIH3T3 (dados não mostrados).

Para caracterização adicional, que incidiu sobre as mutações sem sentido e L360X R1114X, que apresentou os maiores níveis de readthrough na presença do aminoglicósido gentamicina (1,6% e 0,7%, respectivamente). Para as duas mutações nonsense seleccionados, que os níveis quantificados readthrough obtidos na presença de várias concentrações de G418 (geneticina), porque este antibiótico é o indutor mais potente readthrough dos aminoglicósidos [11], [21], [22]. Ambas as mutações nonsense exibido uma resposta dependente da dose a G418, resultando em níveis readthrough maiores do que os observados no caso da gentamicina, atingindo 2,3% para 1,8% e L360X para R1114X (Figura 2 A e 2B, respectivamente). Os níveis readthrough obtidos na presença do dipéptido negamycin foram inferiores (L360X) ou semelhante (R1114X) aos obtidos com gentamicina (Figura 2 A e 2B, respectivamente).

(A) eficiências Readthrough para APC L360X mutações sem sentido foram determinados em células DLD-1 na presença de G418 (10, 25, 50, 100 e 200 ug /ml), negamycin (1 mg /ml), amicacina (2 mg /ml) ou de gentamicina (800 ug /ml). (B) eficiências Readthrough para mutações nonsense APC R1114X foram determinados em células NIH3T3 na presença de G418 (50, 100 e 200 ug /ml) ou negamycin (1 mg /ml). As eficiências readthrough em células DLD-1 foram consistentes com os das células de NIH3T3 (dados não mostrados). (C) aminoglicosídeos tratamento restaurado actividade APC. APC ligação a beta-catenina (reppression do repórter pTOPGlow) é restituída pelo tratamento de células DLD-1 transfectadas transientemente com ADNc de APC L360X com G418 (10, 25, 50, 100 e 200 ug /ml), negamycin (1 mg /mL), amicacina (2 mg /ml) ou de gentamicina (800 ug /ml). de ligação (D) para a APC beta-catenina (repressão de repórter pTOPGlow) é restituída pelo tratamento de células LoVo transportando APC R1114X com G418 (50, 100 e 200 ug /ml) ou negamycin (1 mg /ml). Como um controlo, as células LoVo foram co-transfectadas com o plasmídeo repórter pTOPGlow e quer o siRNA de APC-direccionamento (siARN APC) ou um ARNsi não segmentação (siARN NT) e tratou-se com G418 (200 ug /ml). (E) Efeito do siRNA alvejando ARNm APC. Nós transientemente transfectadas células LoVo com um siRNA alvejando (siARN APC) ou não segmentação (siARN NT) APC ARNm. PCR quantitativa foi usada para determinar os níveis de mRNA. Os resultados são expressos em relação à quantidade de ARNm na presença de siRNA NT. Os valores médios são apresentados, juntamente com o SEM (n = 3).

Readthrough nível depende da natureza do codão de paragem e o contexto de nucleótidos circundante, mas as regras que regem nível readthrough são complexos e permanecem para ser determinada para células de mamífero. A presença de um resíduo C imediatamente após o codão de paragem (4) está correlacionada com um elevado nível de readthrough, embora isto não parece ser o único determinante de nível readthrough. Vários estudos também demonstraram que apenas alguns mutações nonsense dar readthrough “significativa” na presença de gentamicina. Neste estudo, apenas dois dos onze mutações nonsense testados, L360X e R1114X, apresentaram níveis readthrough induzida por gentamicina superiores a 0,5%, mas apenas L360X tinha um resíduo de C na posição 4. A mutação R1114X teria, portanto, sido descartado se este tinha sido o único critério utilizado para identificar mutações que respondem bem à indutores readthrough. Nossa abordagem proporciona, assim, uma estratégia racional para identificar pacientes que possam se beneficiar do tratamento com indutores readthrough.

Recuperação de actividade biológica APC a partir de cDNA L360X da APC após o tratamento aminoglicosídeo

Em seguida, investigaram se o tratamento aminoglicosídeo induziu níveis detectáveis ​​de actividade biológica de uma proteína de APC produzido a partir de um ADNc que carrega a mutação L360X. Activo APC medeia o sequestro de beta-catenina no citoplasma, impedindo assim a interacção dessa molécula com o TCF factor de transactivação necessária para a expressão de genes alvo. a actividade da proteína APC foi avaliada através da determinação da capacidade desta proteína para se ligar a beta-catenina, utilizando uma construção repórter contendo TCF /locais inserido a montante do gene da luciferase de pirilampo (pTopGlow) [23] de ligação de beta-catenina. Neste sistema repórter, a interacção entre APC e beta-catenina activos resulta na inibição da expressão de luciferase de pirilampo.

células DLD-1 desprovido de proteína APC funcional (APC del 1 pb 1406) foram transfectadas com o ADN pCMV vector de expressão contendo ADNc de APC quer WT ou mutante L360X, em conjunto com pTopGlow (Figura 2C). A transfecção com o vector de WT APC resultou em níveis de expressão do pirilampo um décimo dos obtidos após a transfecção com um vector vazio. Sem tratamento, L360X apresentaram níveis residuais de actividade, provavelmente devido à perda de função incompleta desse alelo, como actividade residual foi também demonstrada a presença de mutações em posições vizinhas [23]. A dose mais elevada de G418 diminuiu a actividade da luciferase por um factor de 2.5, o que demonstra a produção de uma proteína funcional de APC no tratamento aminoglicósido. G418 reprimido actividade de luciferase de um modo dependente da dose correlacionado com os níveis readthrough medidos em células DLD-1 (figura 2A). O tratamento com a gentamicina ou amicacina aminoglicosídeos, ou com negamycin também desencadeou a repressão da actividade da luciferase, indicando que a síntese de uma proteína activa APC (Figura 2C). Para cada tratamento, a actividade da proteína foi correlacionado com o nível de nível readthrough medido no sistema repórter duplo (Figura 2A e 2C). Foi utilizado o teste de correlação não paramétrico de Spearman (bicaudal) para avaliar a importância desta correlação. Descobrimos que havia uma correlação forte, altamente significativa (rs = -0,95, p 0,0001) entre o nível readthrough ea diminuição da atividade luciferase. Assim, tanto aminoglicósido e o dipéptido negamycin pode induzir a actividade biológica da APC a partir de um ADNc mutante, e o nível de actividade é proporcional ao nível readthrough. Como um controlo, foi utilizado o vector pFopGlow contendo sítios de ligação mutado TCF /beta-catenina. Com este vector, não foi observada nenhuma alteração significativa após aminoglicósido ou tratamento negamycin (dados não mostrados).

A recuperação da actividade biológica da APC a partir do gene endógeno R1114X APC após o tratamento aminoglicósido

, em seguida, investigou se o tratamento aminoglicosídeo de mutações nonsense endógenos daria resultados semelhantes. células LoVo (APC R1114X) foram transfectadas com o plasmídeo repórter pTopGlow e deixada sem tratamento ou tratada com G418 ou negamycin. A actividade do gene repórter da luciferase de pirilampo foi máxima na ausência de tratamento e foi fixado em 100%, o que reflecte a falta de actividade da proteína de APC. O tratamento com negamycin e G418 diminuiu pTopGlow actividade da luciferase do pirilampo para 50% e 18% do valor de referência, respectivamente (Figura 2D). O nível de actividade foi correlacionada com eficiência readthrough (Figura 2B). Surpreendentemente, o tratamento de gentamicina, apesar de promover níveis de readthrough semelhantes aos obtidos com negamycin, não diminuiu a actividade da luciferase do pirilampo pTopGlow (dados não mostrados). Assim, a eficiência readthrough não é o único factor determinante para a recuperação da actividade da proteína de comprimento completo. Com efeito, a PTC readthrough corresponde à incorporação de uma aminoacil quase cognato ARNt [24], [25], [26], [27] (complementar a dois dos três nucleótidos de um codão de paragem), potencialmente resultando na substituição de o resíduo normais por um aminoácido incompatível com a estabilidade ou a actividade da proteína de comprimento completo [10]. É possível que os aminoácidos diferentes são incorporados no lugar do codão de paragem na presença destas duas drogas, com apenas negamycin tratamento levando à incorporação de ácido (s) (um) amino compatível com a actividade biológica da proteína. Esta situação pode surgir devido aos diferentes modos de actividade destes fármacos: aminoglicosidos parecem ligar-se exclusivamente ao centro da descodificação [28], enquanto que negamycin foi mostrado ligar-se, não só para o local A da pequena subunidade do ribossoma [9], mas também com a parede do túnel de saída nascente cadeia da subunidade ribossomal grande [29]. Podemos esperar, portanto, o subconjunto de ARNt supressores naturais selecionados para ser diferente depois de aminoglicosídeo e tratamentos negamycin.

Quanto à outra mutação testado, expressão luciferase de pFopGlow abrigar mutado sítios de ligação /beta-catenina TCF não foi significativamente afectada por tratamento com antibiótico (dados não mostrados). Verificámos que a proteína APC ativa era realmente responsável pela redução observada na expressão de luciferase de vaga-lume, usando uma siRNA visando especificamente o mRNA APC. Primeiro nós utilizamos RT-PCR para verificar se o siRNA eficaz diminuição dos níveis de mRNA APC (Figura 2E). células LoVo foram co-transfectadas com o plasmídeo repórter pTOPGlow e siRNA segmentação ou não segmentação de APC.

Após o tratamento de G418 (200 ug /ml), o siARN da APC-direccionamento deu uma diminuição na actividade de luciferase duas vezes menor do que a observada na ausência de ARNsi, enquanto que o siARN não específica não teve nenhum efeito sobre a inibição da luciferase (Figura 2D). Assim, o efeito sobre o sistema repórter foi detectado especificamente na presença de ARNm de APC, indicando que ela é mediada por uma proteína activa APC.

Para estes dois mutantes, investigou-se a capacidade de tratamento de aminoglicósido para restaurar a produção APC da proteína de comprimento completo. Fomos capazes de detectar a proteína APC de comprimento completo em células HeLa (APC WT), mas esta proteína não era detectável após tratamento com drogas quer em células LoVo (R1114X) ou células DLD-1 transfectadas com o ADNc L360X (Figura 3). Esta falta de detecção foi, provavelmente, devido às limitações da técnica para a detecção de pequenas quantidades de uma proteína grande (311 kDa). Estes resultados sugerem que os níveis baixos de proteína APC pode ser suficiente para regular a actividade do complexo de transcrição TCF /beta-catenina.

LoVo células foram deixadas sem tratamento ou foram tratados com G418 (200 ug /ml) durante 72 horas. As transferências de Western foram sondadas com o anticorpo FE-9 dirigido contra o terminal N da APC. As formas truncadas correspondentes aos alelos mutados presentes nas células LoVo são indicados por setas. Um extracto de células HeLa (APC WT) foi usada como um controlo; uma banda foi detectada a 311 kDa.

Conclusão

Neste estudo, investigou-se a capacidade de moléculas indutoras readthrough para induzir a produção de uma proteína APC funcional em células que transportem várias mutações sem sentido no gene APC. A atividade biológica foi detectada para as duas mutações nonsense mais responsivos ao tratamento aminoglicosídeo (R1114X e L360X) e esta actividade foi diretamente proporcional aos níveis readthrough medidos com um sistema repórter dupla. Este estudo mostra que os indutores readthrough, tais como aminoglicósido e negamycin, pode reactivar o gene supressor de tumor APC em células cancerosas. Ele fornece uma estratégia racional para identificar pacientes que possam responder e, portanto, mais susceptíveis de beneficiar do tratamento com indutores readthrough. Um estudo recente forneceu a prova de princípio de que a re-expressão de uma proteína APC de comprimento completo depois do tratamento com indutores readthrough reduz o tamanho do tumor num ratinho de xenoenxerto [12]. Além disso, mostraram recentemente que o tratamento de células que transportam uma mutação sem sentido no gene supressor tumoral p53 leva à re-expressão de uma proteína de comprimento completo capaz de desencadear a apoptose em células tumorais em cultura [11]. Todos estes dados sugerem que as moléculas que induzem a paragem-codão readthrough poderia potencialmente ser usado não só para o tratamento de doenças genéticas, mas também para diversificar o arsenal de tratamentos para o cancro e como uma base racional para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento mais individualizadas.

Materiais e Métodos

linhas de células e cultura de células

Todas as células foram cultivadas em DMEM mais GlutaMAX (Invitrogen), suplementado com 10% de soro de vitela fetal (FCS, Invitrogen) e 100 L /ml de penicilina /estreptomicina. As células foram incubadas numa atmosfera humidificada contendo 5,5% de CO

2, a 37 ° C. NIH3T3 (gentilmente cedido por Marc SITBON) células são fibroblastos embrionárias de rato. LoVo (APC R1114X e del 1 pb 1430, gentilmente cedido por Françoise Praz, [30]) e DLD-1 (APC del 1 pb 1406, gentilmente cedido por Françoise Praz, [31]), as células são células epiteliais derivadas de um colorectal humana adenocarcinoma. HeLa células (APC WT) são células epiteliais derivadas de um adenocarcinoma colo do útero humano (gentilmente cedido por Fabrice Lejeune).

quantificação Readthrough em cultura de células

oligonucleotídeos complementares correspondentes às mutações nonsense incorporado em seu habitat natural (sequências de contexto na Tabela 1) foram emparelhados e ligados ao plasmídeo pAC99 repórter duplo, como descrito anteriormente [32]. Esta dupla repórter permite a quantificação de paragem readthrough-codão, através da medição das actividades da luciferase e da beta-galactosidase (calibração interna), como previamente descrito [16]. Os níveis readthrough de mutações nonsense foram analisadas na presença ou ausência de gentamicina. As células NIH3T3 foram electroporadas com 20 ug de plasmídeo repórter e, no dia seguinte, as células foram lavadas e meio fresco, com ou sem a gentamicina, amicacina, negamycin ou suplementação de G418, foi adicionado. Nestas experiências, não foi observada toxicidade celular para as doses de antibióticos utilizados. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram colhidas e lisadas com tripsina-EDTA (Invitrogen). actividades de beta-galactosidase e luciferase foram ensaiadas como previamente descrito [32]. eficiência Readthrough foi estimado por cálculo da razão de luciferase a actividade de beta-galactosidase obtida com o construto de teste e normalizando-o com respeito à razão obtida com uma construção de controlo em grelha. Para cada construção, foram realizadas, pelo menos, cinco experiências de transfecção independentes. Para a quantificação readthrough em DLD-1, foi utilizado o mesmo protocolo, com excepção de que o método do fosfato de cálcio foi utilizado para transfecção. Para cada construção, foram realizados pelo menos três experiências de transfecção independentes.

construções de plasmídeo de expressão

pCMV APC WT foi gentilmente cedido pelo Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins Oncology Center, Baltimore). A mutagénese dirigida foi realizada num fragmento do gene APC para criar a mutação sem sentido L360X APC (APC L360X pCMV). A sequência do fragmento inserido-re foi verificada.

análise de Western-blot

células LoVo foram tratados com G418 (200 ug /ml) durante 72 horas. O meio foi substituído e antibióticos fresco foram adicionados a cada dia. As células foram tratadas tal como anteriormente descrito [11]. Os níveis totais de proteína foram determinadas com o reagente de Bradford (Biorad) e os extractos foram desnaturadas por incubação em tampão de Laemmli durante 5 min a 90 ° C. Nós submetido 100 mg de proteína total a SDS-PAGE em NuPAGE Novex 3/8% Tris /géis pré-moldados de etilo (Invitrogen). As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose durante a noite, tal como recomendado pelo fabricante. As membranas foram saturados por incubação durante 1 hora em TBS suplementado com leite em pó sem gordura a 5%, e incubadas com o anticorpo monoclonal primário, FE-9 (mapeamento de epítopos do terminal N entre os resíduos de aminoácidos 1 e 35 do APC; Calbiochem, 1 /100). As membranas foram lavadas três vezes em TBS suplementado com leite em pó não gordo a 1% e incubadas com o anticorpo secundário (conjugado de peroxidase de rábano-anti-IgG de ratinho (1/2500) ou alcalina anti-IgG de ratinho (1/7000) Promega conjugado com fosfatase ) durante 45 minutos. Eles foram lavadas seis vezes e foi detectado por quimioluminescência com reagentes ECL Western Blotting de detecção (Amersham, GE Healthcare).

Os ensaios de actividade da proteína

A actividade biológica de APC foi estimada com o vector pTOPGlow (gentilmente fornecida pelo Dr. Marc Van de Wetering, Hospital Universitário de Utrecht, Holanda).

células DLD-1 foram co-transfectadas com pCMV L360X (4 ug), pTOPGlow ou pFOPGlow (10 ug) e pCMVLacZ (2 ug) , pelo método do fosfato de cálcio. Cada precipitado de ADN foi dividida entre duas cavidades de uma placa de seis poços. Antibióticos (10 ug /ml a 200 ug /ml de G418; 800 ug /ml de gentamicina; 2 mg /ml da amicacina; 1 mg /ml) foram adicionados negamycin imediatamente após a transfecção, excepto para G418, que foi adicionada no dia seguinte. O meio foi substituído diariamente e foram adicionados antibióticos frescos. Nós preparado proteína extrai 48 horas após a transfecção, e as actividades enzimáticas medidos

Para as células LoVo, antibióticos. (G418 em concentrações de 50, 100 e 200 ug /mL; 1 mg /ml negamycin) foram adicionados no dia anterior a transfecção e em cada dia subsequente. células LoVo foram co-transfectados, pelo método do fosfato de cálcio, com ou TOPGlow FOPGlow (10 ug) e pCMVLacZ (2,8 ug) para normalizar para a eficiência da transfecção, a viabilidade celular e a variabilidade de extracção de proteína. Cada precipitado de ADN foi dividida entre duas cavidades de uma placa de seis poços. Três dias após a transfecção, extratos de proteína foram preparados e atividades enzimáticas foram medidas.

Para cada linha celular, pelo menos três experiências de transfecção independentes foram realizadas.

siRNA transfections

células LoVo, a actividade da proteína foi determinada como descrito acima. As células foram transfectadas com siRNA alvo mRNA APC (Dharmacon ON-Target Plus J-003869-12) ou NS, nontargeting (Dharmacon ON-Target Plus controlar siRNA # 1), na presença de DharmaFECT Duo (Thermo Scientific; 1,3 mg de siRNA por poço de uma placa de seis poços), 24 h após a transfecção inicial como acima descrito. As células transfectadas foram imediatamente incubadas em meio com ou sem G418 (200 ug /ml) suplementação. Três dias após a transfecção, as células foram recolhidas e as actividades da luciferase e da beta-galactosidase foram ensaiadas como descrito acima. Pelo menos quatro experiências de transfecção independentes foram realizadas.

Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório e Mounira Amor-Guéret (Institut Curie, CNRS, Orsay) para discussões úteis. Agradecemos também Julie Frugier para assistência técnica.