Abstract

Alterações em tetraspanina expressão CO-029 estão associados com a progressão e metástase de cancros no sistema digestivo. No entanto, como CO-029 promove a metástase do câncer ainda é pouco compreendido. Para determinar o mecanismo, que silenciados CO-029 a expressão em células de cancro do cólon HT29 e descobriram que o knockdown CO-029 reduziu significativamente a capacidade migratória célula. A migração celular foi acompanhado por diminuição da regulação positiva de ambos adesão célula-matriz dependente de integrina sobre a laminina e adesão célula-célula dependente de cálcio. Os níveis de superfície celular de α3β1 integrina de ligação a laminina e fibronectina α5β1-integrina foram aumentadas, enquanto o nível de CD44 foi diminuída com a co-029 silenciamento. Estas alterações contribuir para a adesão célula-matriz alteradas. Os resultados desregulados de adesão célula-célula, pelo menos parcialmente, do aumento da actividade de caderinas e redução do nível de MelCAM. Em conclusão, CO-029 funciona como um regulador de ambos célula-matriz e adesão célula-célula. Durante a progressão do câncer de cólon, CO-029 promove o movimento de células cancerosas através da desregulamentação adesões celulares

Citation:. Guo Q, Xia B, Zhang F, Richardson MM, Li M, Zhang JS, et al. (2012) tetraspanina CO-029 inibe câncer colorretal Movimento celular através da desregulamentação Adesões Cell-Cell-Matrix e. PLoS ONE 7 (6): e38464. doi: 10.1371 /journal.pone.0038464

Edição: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Recebido: 08 de julho de 2011; Aceito: 06 de maio de 2012; Publicação: 05 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health CA096991. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal, um dos cancros mais comuns, tem uma alta mortalidade [1]. Os pacientes com metástases para órgãos distantes como o fígado e os pulmões sofrem extremamente pobre prognóstico. Portanto, compreender os mecanismos celulares e moleculares da progressão do cancro colorectal é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias para melhorar as taxas de prognóstico e sobrevida de pacientes com câncer colorretal.

Tetraspanins regular uma variedade de processos fisiológicos e patológicos, e alguns tetraspanins são associada com a progressão e metástase de câncer [2] – [11]. tetraspanina humano CO-029 e o seu homólogo de rato, D6.1A, foram inicialmente classificado como um antigénio associado a um tumor expressa em gástrico, colorectal, e células de cancro do pâncreas e exercem actividade promotora de progressão tumoral [12]. expressão CO-029 é frequentemente regulada no carcinoma hepatocelular [13]. O nível de expressão D6.1A é marcadamente aumentada, em relação ao um em uma linha parental diferenciada, em uma linha de células de hepatoma de rato desdiferenciado [14]. A expressão simultânea de α6β4 integrina e D6.1A em nonmetastasizing pancreático de rato linha celular de adenocarcinoma BSp73AS facilita a metástase do fígado desta linha [15]. CO-029 também apresenta um nível de expressão mais elevado em células metastáticas de carcinoma de cólon, em comparação com o nível em células cancerígenas do cólon primários [16]. Um mecanismo possível para a actividade de prometastatic CO-029 é a sua associação com as integrinas ou tetraspanins, ambos os quais afectam a motilidade celular. D6.1A está associada a integrinas α3β1, α6β1, e depois α6β4 C (PKC) a activação de proteína quinase [15], [17]. Em linhas de células pancreáticas e de carcinoma colo-rectal metastático, a activação de PKC aumenta a co-localização de CO-029 e tetraspanina CD151 com α6β4 integrina nas células tumorais, promove a internalização do complexo integrina-tetraspaninas, diminui a adesão célula-matriz em laminina 332, e aumenta a migração de células [18]. Além disso, as células tumorais sobre-expressam D6.1A libertar os exossomas que contêm D6.1A, e estes exossomas induzir angiogénese para facilitar a difusão do tumor [19]. Um estudo recente mostrou que a E-caderina e antagonizam p120-catenina CO-029 migração promovido de células cancerígenas do cólon Isreco [20]. Estes estudos sugerem fortemente um papel importante para o CO-029 na progressão e metástase de tumores no sistema digestivo. Para determinar o mecanismo através do qual CO-029 promove a progressão do tumor e metástases, é silenciado a expressão de moléculas co-029 em células de adenocarcinoma do cólon humano HT29. Através da combinação in vitro e in vivo, verificou-se que a perda de CO-029 atenuou significativamente a motilidade celular e alterou o equilíbrio de adesões célula-célula e célula-matriz, que conduz ao potencial metastático de células de tumor diminuiu.

Materiais e Métodos

Cultura celular, anticorpos, Proteínas da matriz extracelular, e outros reagentes

HT29 linha celular de adenocarcinoma colorrectal humano foi obtida a partir de ATCC (Manassas, VA) e cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina.

Os anticorpos utilizados neste estudo foram intergrin α1 mAb TS2 /7, intergrin α2 mAb IIE10, intergrin A3X8 mAb α3, intergrin α5 mAb BIIG2, intergin α6 mAb A6BB, intergrin β1 mAb TS2 /16, intergrin β4 mAb 439-9B (BD Pharmingen, San Diego, CA), CD9 mAbs C9BB [21] e Mab7, CD63 mAb 6H1 [22], CD81 mAb M38, CD82 mAb M104, CD151 mAbs 5C11 e TS151r [23], CO29 mAb NS1116 (gentilmente cedido pelo Dr. Dorothee Herlyn do Instituto Wistar), e-caderina mAb (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), EpCam mAb VU1D9 (Cell Signaling, Danvers, MA), EWI2 mAb 5E8 (gentilmente cedido pelo Dr. T. Schweighoffer do Instituto Novartis para Pesquisa Biomédica) e MelCam mAb P1H12 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Um IgG2b de rato foi utilizado como um anticorpo de controlo negativo (Sigma, Saint Louis, MO). Os segundo anticorpos utilizados neste estudo foram o anticorpo IgG-peroxidase de rábano conjugado de cabra anti-ratinho (Sigma, Saint Louis, MO) e de fluoresceína de cabra anti-ratinho conjugado com isotiocianato de -rat ou anticorpo IgG (Biosource International, Camarillo, CA) .

As proteínas da matriz extracelular foram reconstituídos membrana rato cave Matrigel (BD Biosciences, mountain View, CA), laminina de rato 111 (Invitrogen, San Diego, CA), e fibronectina de plasma humano (Invitrogen, San Diego, CA ). Outros reagentes foram da Sigma se a fonte não for especificado.

A interferência RNA e Retrovirus Preparação e Transdução

O CO-029 pequeno RNA hairpin (shRNA) (TGCTGTTGACAGTGAGCGATGAATGAAACTCTCTATGAAATAGTGAAGCCACAGATGTATTTCATAGAGAGTTTCATTCACTGCCTACTGCCTCGGA), que tem como alvo a sequência TGAATGAAACTCTCTATGAA de CO-029 mRNA humano, e shRNA controlo (RHS1703) foram obtidos a partir de OpenBiosystems (Huntsville, AL). Outra CO-029 shRNA que tem como alvo uma parte diferente da sequência de ARNm CO-029 foi obtido a partir de (OpenBiosystems Materiais Métodos S1). O vírus da estomatite vesicular (VSV) vector de expressão de proteína -G pVSV-L (gentilmente fornecer pelo Dr. C. Stipp, Universidade de Iowa) e shRNA foram transduzido para as células de empacotamento GP293 por Lipofectamina 2000 (Invitrogen, San Diego, CA). Após 48 h, o vírus contendo partículas sobrenadante da cultura foi recolhido, e os detritos celulares foram removidos por passagem do sobrenadante através de um /L filtro de seringa de 0,45 umol. O estoque viral purificado foi incubado com as células HT29 para a transdução, as células HT29 e transduzidas com o controlo ou CO-029 shRNA foram seleccionadas com puromicina. As células puromicina-resistente em CO-029 shRNA transductante foram ordenados por citometria de fluxo para enriquecer a população de células CO-029-silenciados.

citometria de fluxo

As células foram destacadas com 0,5% de tripsina-EDTA , lavou-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes, bloqueadas com soro de cabra a 5% em DMEM a 4 ° C durante 1 h, incubados com o mAb primário, e, em seguida, coradas com IgG conjugado com FITC de cabra anti-ratinho, a 4 ° C durante 1 h. As células coradas foram analisadas num citómetro de fluxo FACScan (BD Biosciences).

Imunofluorescência

As células foram fixadas com paraformaldeído a 3% à temperatura ambiente (TA) durante 15 min, permeabilizadas com 0,1% de Brij 98 à TA, durante 2-5 min, bloqueadas com soro de cabra a 20%, a 4 ° C durante 1 h, e incubadas com mAbs primários, a 4 ° C durante 1 h, seguido por coloração com um anticorpo secundário, a 4 ° C durante 1 h. Depois de cada incubação do anticorpo, as células foram lavadas três vezes com PBS. Para a análise de imunofluorescência, as células foram examinadas com um microscópio de fluorescência Axiophot (Carl Zeiss, Thornwood, NY), e as imagens foram captadas com uma câmara digital Optronics.

Imunoprecipitação e Western Blot

imunoprecipitações foram realizada como descrito anteriormente [24]. As células foram lisadas com 1% de tampão de lise Nonidet P-40 a 4 ° C durante 1 h. Em algumas experiências, a superfície da célula foi marcada com 0,5 mg /ml EzLink sulfo-NHS-LC Biotina (Pierce) antes da lise celular. Após a remoção do material insolúvel por centrifugação a 14.000 x g e dois ensaios de pré-depuração, os lisados ​​foram incubados com o mAb primário proteína absorvida-A- e pérolas G-Sepharose (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a partir de 3 h, para se durante a noite a 4 ° C. Os imunoprecipitados foram lavados com tamp de lise três vezes, dissolvido em tampão de amostra de Laemmli e aquecidos a 95 ° C durante 5 min, separadas por SDS-PAGE, e, em seguida, transferidos electricamente para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA). As membranas foram sequencialmente colocados a hibridar com Ab primária e peroxidase de rábano conjugada segundo Ab (Sigma) para as experiências de imunotransferência ou extravidina rábano conjugado com peroxidase (Sigma) para experiências de biotinilação, seguido por quimioluminescência (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA).

Ensaios de adesão celular

ensaio de adesão de célula-matriz foi realizada como descrito no nosso estudo anterior [25]. Resumidamente, placas de 96 poços de microcultura (BD Bioscience) foram revestidas com laminina de rato 111 ou fibronectina a 4 ° C durante a noite e, em seguida, bloqueadas com albumina de soro bovino a 1% inactivado pelo calor (Sigma) a 37 ° C durante 1 h. Laminina 332 foi preparado através da cultura de células de RAC-11P em confluência em placas de 96 poços durante 3 dias como descrito anteriormente [26]. As células foram tripsinizadas e suspensas em meio DMEM isento de soro a uma densidade de 1 x 10

4 células /ml, e 0,1 ml da suspensão de células foi então adicionado a cada poço. Após incubação durante 1 h a 37 ° C, as células não ligadas foram removidas por lavagem quatro vezes com PBS. As células fixadas foram contadas visualmente.

adesão célula-célula foi examinada usando o ensaio de agregação de gota suspensa tal como descrito anteriormente [27]. As células foram descoladas com 0,5% de tripsina-EDTA e lavadas duas vezes com PBS, em seguida, traduzido para suspensão de uma única célula por três passagens suaves através de uma agulha de calibre 27. A suspensão de uma única célula de 1 × 10

4 células em 30 ul de solução foi suspenso como uma gota de suspensão a partir da tampa de uma placa de cultura de 24 poços e deixou-se agregar durante a noite a 37

° C em 5% de CO

2 com umidade. DMEM completo foi usado para medir a aderência total de célula-célula, enquanto DMEM isento de cálcio foi de adesividade célula-célula independente de cálcio. Para ensaiar a resistência de adesão célula-célula a um esforço mecânico, as células foram submetidas à força de cisalhamento, passando-os através de uma ponta de pipeta de 200 uL de 10 vezes. adesão célula-célula independente de cálcio foi também medida sob tensão mecânica relativamente suave [28]. Resumidamente, após a lavagem com solução salina de Puck (KCl 5 mM, NaCl 140 mM, NaHCO3 a 8 mM, pH 7,4), a suspensão de célula única (1 × 10

5 células /ml) foi incubada em 5% de CO

2 a 37 ° C durante a noite com agitação a 80 rpm num agitador orbital. As células foram fotografadas antes ou depois de esforço mecânico. adesividade célula-célula após a tensão de corte foi quantificada como i) a percentagem de células agregadas e /ou ii) a área coberta por agregados. Com base na contagem de células individuais, a percentagem de células agregadas foi calculada usando a fórmula% de agregação = [1- (número de células individuais /número de células totais) x 100]. A área da superfície coberta pelos agregados foi medida usando o software ImageJ para retratar o grau de agregação de células. agregado de células é definido como um aglomerado de células contendo quatro ou mais células.

Ensaios de Migração Celular

ensaio de cicatrização de feridas foi realizada como descrito em nosso estudo anterior [29]. Resumidamente, as células foram semeadas em poços individuais de uma placa de cultura de 24 poços. Quando as células atingiram a confluência, uma monocamada de células foi tratado primeiro com 10 ug /ml de mitomicina C, durante 30 min para bloquear a mitose e, assim, permitir a análise de migração celular na ausência de proliferação de células. Em seguida, a monocamada de células foi ferido com um estéril, 200- ponta ul pipeta. Os detritos de células e meio foram removidos e reabastecido por 2 ml de meio fresco. As células foram fotografadas por microscopia de contraste de fase a cada 24 h após ferindo. Para avaliar a “fechamento da ferida”, cinco áreas ao longo da ferida foram escolhidos aleatoriamente para calcular a largura média para cada poço. As fotografias foram tiradas em diferentes pontos de tempo por um microscópio Olympus contraste de fase invertida.

ensaio de migração de células Transwell foi realizada como descrito no nosso estudo anterior [30]. Resumidamente, o tamanho de poro de 8 um, 24 poços inserções Transwell (BD Bioscience, Bedford, MA) foram pré-revestidos com 10 ng /ml de laminina 111 ou fibronectina sobre o lado inferior dos elementos de encaixe, a 4 ° C durante a noite e bloqueado com 0,1% albumina de soro de bovino inactivado por calor (BSA) a 37 ° C durante 1 h. Um total de 2 x 10

4 células em MEMD isento de soro contendo BSA a 0,1% inactivado pelo calor, num volume de 300 ul foi adicionada à câmara superior, e 500 de DMEM ul contendo 1% de FBS foram adicionados à câmara inferior . As células em transwells foram incubadas durante 24 h a 37 ° C. As restantes células na superfície superior das inserções foram removidas por limpeza com uma mecha de algodão, e as células que transmigrou através dos poros foram fixadas e coradas com Diff-Quik Stain Kit (Dade Behring, Inc., Newark, DE). A migração foi quantificada por contagem das células na superfície inferior do inserto.

Análises Estatísticas

Todas as experiências foram realizadas, pelo menos, quatro vezes. Os dados são apresentados como média ± DP. A análise estatística foi realizada pelo estudante de

t

-teste, e

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

O Silêncio dos CO. -029 expressão em células de cancro do cólon HT29

Para determinar os papéis mecanicistas de tetraspanina CO-029 na progressão tumoral, foi estabelecido um transdutante estável em células de adenocarcinoma de cólon humano HT29 [31], em que CO-029 expressão era derrubado por shRNA. Os efeitos de silenciamento sobre a expressão da proteína celular total e a superfície de células CO-029 foram avaliadas por meio de Western blot e citometria de fluxo, respectivamente (Figura 1). Comparado com o transdutante expressando controlo ou nonsilencing (NS) shRNA, o transdutante expressando CO-029 shRNA (KD) exibiu uma redução substancial das emissões de CO-029 a expressão na superfície celular (Figura 1A), variando de cerca de 60% a 90%, dependendo do estado de confluência de células em cada experiência individual, e uma grande perda do total das proteínas celulares CO-029 (Figura 1B), tipicamente cerca de 90%. O silêncio resultante do CO-029 shRNA foi específico para o CO-029, porque a expressão de muitas outras proteínas de superfície, especialmente outros membros da superfamília tetraspanina, não foi reduzida (veja a seguir).

O CO-029 shRNA e nonsilencing shRNA foram expressos de forma estável em células HT29. (A) análise de citometria de fluxo de CO-029 a expressão na superfície de células HT29 que foram transfectadas com nonsilencing (NE) ou construções CO-029 shRNA (KD). O controle negativo mAb foi IgG murino, e CO-029 mAb foi NS1116. A intensidade média de fluorescência (IMF) de CO-029 em células KD foi 62% menor em comparação com células que sobre NS. (B) Análise de Western blot de CO-029 proteínas em células NS e KD HT29. KD células exibido um 90% de redução em proteínas CO-029. β-actina:. controlo de carga

O Silêncio dos CO-029 Expressão prejudicada migração de células HT29

O primeiro avaliou o efeito do CO-029 silenciamento sobre a migração de células cancerosas. Para comparar a capacidade migratória celular de NS e Kd transdutantes, realizamos ensaio curando 1) enrolado para analisar a migração celular colectiva, isto é, a migração de células dependentes de adesão célula-célula, e 2) ensaio de migração Transwell para analisar a migração celular solitária, isto é, célula-célula migração celular independente de aderência. Nas experiências de cicatrização de feridas, a taxa de repovoamento ou processo de cicatrização da ferida monocamada foi marcadamente reduzida em células transductantes CO-029 kD, e essa redução durou vários dias (Figura 2A e Figura S1A). A cicatrização de feridas não foi reduzida resultou da proliferação celular mais lenta das células KD, porque as experiências foram realizadas na presença de mitomicina. A diminuição da capacidade das células KD na migração das células também pode ser observada no ensaio de migração Transwell. A migração celular através do filtro de membrana com poros para proteínas da matriz extracelular tal como laminina e fibronectina 111 foi significativamente diminuída mediante o silenciamento de expressão CO-029 (Figura 2B e Figura S1B). Estes resultados indicam que o silêncio do CO-029 atenua a capacidade geral de migração de células e que a expressão do CO-029 é necessária para a migração celular forte ou robusta.

(A) ensaio de cicatrização de feridas. Em comparação com células NS, o fechamento da ferida foi diminuída de modo significativo nas células de KD em 72 horas após a criação de feridas em monocamadas de células confluentes. ensaio de migração (B) Transwell. As células KD exibida motilidade deficiente em Transwell experiências de migração. Os dados são apresentados como média ± SD, n = 4. *

P

. 0,05

Além de migração de células na matriz 2-dimensional, invasão celular é uma importante parâmetro para medir a motilidade celular através de 3-dimensional microambiente (3D) para as células cancerosas invasivas e metastáticas. invasividade celular foi medida pela capacidade das células HT29 transductantes para invadir através de Matrigel, uma matriz 3D semelhante à membrana basal, ou gel de colagénio do tipo I, uma matriz 3D semelhante à do tecido conjuntivo. Não foi encontrada nenhuma invasão significativa de ambos os grupos de células HT29-KD através de qualquer um desses ambientes matriz 3D (dados não mostrados), sugerindo que as células HT29 não são invasivas, pelo menos neste ensaio de invasão e sob o

In vitro

condição de teste.

CO-029 Regulado célula-matriz e adesão célula-célula

tumor de células-matriz e célula-célula aderências são considerados como sendo os principais eventos que regulam a cascata metastática [ ,,,0],32] – [34]. Para avaliar o efeito da co-029 silenciamento na adesão célula-matriz, que analisado e comparado a aderência de células-matriz de transdutantes KD e NS sobre laminina e fibronectina. Como mostrado na Figura 3A, HT29-NS e -kd células exibido diferentes capacidades de adesão. As células apresentaram maior adesividade KD das proteínas da matriz extracelular laminina e laminina 111 332, sugerindo que o CO-029 impede a adesão celular em membrana basal, que é a matriz ambiente enriquecido em lamininas. A adesão celular em fibronectina, no entanto, exibiram nenhuma diferença entre células NS e KD (Figura 3A). Examinámos também a adesão de células em hialuronano, um grande proteoglicano de ambiente extracelular e o ligando de CD44, por causa da diminuição da expressão de CD44 na superfície das células HT29-KD. No entanto, as células HT29 não apareceu a aderir a hialuronano, embora um protocolo estabelecido foi seguido para este ensaio [35].

(A), a adesão célula-matriz. Aderência sobre laminina 111, 332 laminina, fibronectina e de HT29-NS e -kd células foi testada após incubação a 37

° C em 5% de CO

2 durante 1 h. A adesão das células de KD em laminina e laminina 111 332 foi significativamente aumentada em comparação com células NS (

P = .042

na laminina e 111 .048 = 332 de laminina). (B) total adesão célula-célula. a agregação de células foi medida no Ca

++ – contendo meio após um período relativamente forte força mecânica foi aplicada. (C) Ca

++ – adesão célula-célula independente. agregação de células foi medida no Ca

++ – mídia livre depois que as forças mecânicas relativamente fortes ou suaves foram aplicadas, respectivamente. A agregação de células NS e KD após tensão de corte foram quantificados conforme descrito em Materiais e Métodos.

P

valores são 0,03 para as células agregadas na presença de Ca

++, 0.001 para a área de agregados na presença de Ca

++, e 0,0004 para o stress leve na ausência de Ca

++. Imagens de agregados de células após o tratamento shear-stress foram obtidas por microscopia de contraste de fase. Todos os dados são projectadas como média ± SEM (n = 4). *

P Art 0,05, **

P

. 0,01

Para avaliar o efeito do CO-029 silenciamento na adesão célula-célula , foi realizado ensaio de agregação de células. Em primeiro lugar, examinamos a agregação de células na presença de Ca

++ [28], o que reflecte a adesividade total de célula-célula, incluindo a aderência célula-célula caderina-dependente e independente de. Silenciamento CO-029 resultou num aumento da capacidade para formar os agregados de células que são resistentes a tensão mecânica relativamente forte, em comparação com células NS (Figura 3B). Em seguida, examinámos a agregação célula-célula na ausência de Ca

++, que reflecte a adesividade célula-célula independente-caderina, tal como a via mediada por proteínas IgSF. Ca

++ – adesão célula-célula independente mostrou nenhuma diferença depois de relativamente forte estresse mecânico foi aplicado, mas foi regulada negativamente em células KD depois de força mecânica relativamente leve foi aplicado (Figura 3B). Em células HT29, Ca

++ – adesão celular dependente faz uma contribuição importante para a total adesão célula-célula, com base na comparação entre a magnitude do Ca

++ – agregados dependentes e independentes de após forte mecânica stress tratamento (Figura 3B). Juntos, co-029 confins total e Ca

++ -. Adesão celular dependente

CO-029 Silenciando Altered superfície celular Expression Perfil de Moléculas de Adesão

As mudanças na superfície expressão de tetraspanins, integrinas e proteínas de adesão celular estão envolvidos em progressão tumoral e metástase [17], [36] – [42]. Para determinar o mecanismo através do qual CO-029 regula célula-célula e aderências -matrix, medimos e comparados os níveis de expressão de proteínas de adesão celular na superfície de HT29-NS e -kd células. Para proteínas de adesão célula-matriz, receptor de laminina integrina receptor α3 e fibronectina integrina α5 foram upregulated após silenciar CO-029. β1 integrinas, β4, α1, α2, e α6 permaneceu inalterada, enquanto que o receptor de hialuronano de CD44 foi significativamente regulada negativamente na superfície celular (Figura 4A). Para determinar se CO-029 silenciamento afeta a ativação da integrina, medimos e compararam os níveis de steady state de integrinas b1 ativos em HT29-NS e -kd células com citometria de fluxo, utilizando β1 AG89 mAb integrina. A integrina β1 mAb AG89 reconhece apenas as integrinas b1 em estado ativo [43]. Embora o nível de integrinas b1 activas foi aumentada significativamente na superfície celular de células HT29-kD (Figura 4B histograma da esquerda), manteve-se inalterado após ter sido calibrado com o nível do total das integrinas b1 na superfície celular (Figura 4B histograma direita). Para moléculas de adesão célula-célula, o nível das proteínas de E-caderina não foi alterada na superfície celular (Figura 4C). Também examinamos outras moléculas de adesão célula-célula relacionados com o CO-029 e /ou tetraspanins como EpCAM, MelCAM e EWI2, que participam Ca

++ – adesão célula-célula independente e alguns dos quais pertencem a IgSF . Apenas MelCAM foi marcadamente regulada negativamente na superfície celular (Figura 4C). Tetraspanins CD9, CD63, CD81, CD82, CD151 e não exibiram nenhuma alteração significativa na superfície da célula em presença de co-029 silenciamento (Figura 4D).

Os níveis de expressão de proteínas de adesão célula-matriz (A), β1 activa integrinas (B), proteínas de adesão célula-célula (C), e tetraspanins (D) na superfície de células HT29-NS e -kd transfectantes foram medidos por citometria de fluxo. Os níveis relativos destas proteínas em células kD e células NS são apresentados como histogramas (média ± DP, n = 4~8). *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. Em (B), depois normalizada por os correspondentes níveis relativos de integrina β1 totais, os níveis de integrina β1 activo em relação a células NS são apresentados no histograma no lado direito.

CO-029 e o formação da adesão focal, de fibras de stress, e aderentes junção

Para melhor avaliar o efeito da co-029 silenciamento sobre a adesão celular, examinámos adesão focal e aderente junção das células HT29 transfectantes por coloração i) vinculina, uma marcador de adesão focal, e ii) de e-caderina e β-catenina, marcadores de junção aderentes, respectivamente. Descobrimos que CO-029 silenciamento resultou em formação reduzida de adesão focal, tal como mostrado na Figura 5A. Enquanto isso, a formação de fibras de tensão perto da superfície basal de células HT29-KD também se tornou menos resistente comparado com o de células HT29-NS (Figura 5A). Em contraste, CO-029 silenciamento parece não ter nenhum efeito perturbador na formação da junção aderentes, com base em E-caderina e coloração β-catenina (Figura 5B). A malha de actina cortical ao longo da superfície lateral ou junção aderentes exibiram nenhuma diferença significativa entre NS e células transfectantes kD (dados não apresentados).

HT29 transfectantes foram plaqueadas em lamelas de vidro e cultivadas em meio completo, durante 2 dias (para vinculina e F-actina de coloração, a) ou até confluência (para e-caderina e coloração β-catenina, B). As células foram fixadas, permeabilizadas e incubadas com mAbs primários, a 4 ° C durante a noite, seguido por Alex Fluor 594 conjugado com coloração Ab secundário. F-actina foi corado por Alex Fluor phalloidin 594 conjugado. As imagens foram capturadas com microscopia confocal. Bar = 20 mm.

O efeito da co-029 silenciamento sobre a formação de microdomínio tetraspanina enriquecido (TEM)

Desde CO-029 associados com tetraspanins como CD9 e CD151 e integrinas de ligação a laminina [11], examinámos o efeito do CO-029 silenciamento sobre a estabilidade de MET. As associações de CD151 com de ligação a laminina integrinas α3β1, α6β1 e α6β4 manteve-se estável sob uma condição de lise rigorosas, isto é, 1% de Triton X100 a lise celular mediada, enquanto que as associações de CD151 com outros tetraspanins manteve-se estável em apenas uma lise relativamente suave condição, a lise celular ou seja, 1% de Brij-97 mediada por [3]. CO-029 silenciamento não afetou os perfis de imunoprecipitação de CD151 sob qualquer condição de lise (Figura 6A). Mais integrinas de ligação da laminina foram co-precipitadas com CD151 sob a condição de lise NP40 1% em cima do CO-029 silenciamento. Ambos CD151 e CD9 associada com CO-029 sob a condição de Brij 97 1% de lise, como revelado pelos perfis de imunoprecipitação CD151 e CD9, enquanto tais associações foram rompidas sob uma condição% de lise Triton X-100, como esperado. Sob o Brij 97 condição de lise 1%, CO-029 imunoprecipitados revelou também associação CD9-CO-029, mas não CD151-CO-029 associação devido a menos biotinilação de CD151 e co-migração de CD151 com CO-029 (Figura 6A).

células (A) A superfície biotinilado HT29-NS e transfectantes -kd foram lisadas com tampões detergentes indicados. Tetraspanins CD9, CD151, e CO-029 foram imunoprecipitadas a partir dos lisados, separados por SDS-PAGE e detectados por quimioluminescência aumentada. Os níveis de proteínas de p-actina em lisados ​​foram analisados ​​por Western blot e serviu como controle de entrada de lisado. (B) Os níveis de expressão de integrina não ligada α3β1-CD151, CD151 totais, homoclustered CD9, e CD9 totais na superfície de células transfectantes -kd HT29-NS, e foram medidos pelo mAb TS151r, 5C11, C9BB, e Mab7, respectivamente, usando citometria de fluxo. Os níveis relativos de CD151 e CD9 em células KD às células NS são apresentados como histogramas (média ± SD, n = 3~5).

Algumas das proteínas CD151 no ligamento superfície celular integrina α3β1 em uma forma interacção proteína-proteína directa [3]. Foram analisados ​​o nível de integrina proteínas CD151 α3β1-desacoplado ou “livre”, que são reconhecidos por CD151 mAb TS151r [23]. Na superfície da célula, nem o nível de CD151 livre nem o nível total de CD151-normalizado livre CD151 foi alterada mediante CO-029 silenciamento (Figura 6B). Do mesmo modo, as proteínas CD9 na superfície da célula ou são homoclustered ou associado com ETM [21]. Descobrimos que nem o nível de CD9 homoclustered nem o nível total CD9 normalizada de CD9 homoclustered foi alterada pela CO-029 silenciamento (Figura 6B). Juntas, estas observações sugerem que o CO-029 não é necessária para a interação de CD151 e CD9 com ETMs.

Discussão

Tetraspanins regular a progressão de tumores e metástases. Mas os mecanismos permanecem largamente desconhecidos. Ao nível celular, tetraspanins modular a adesão celular, migração, proliferação e de fusão. A adesividade e motilidade de células tumorais do tumor determinar parcialmente potencial metastático. Assim, ao nível celular, provavelmente tetraspanins regular a metástase tumoral, através da modulação das capacidades de células tumorais para aderir e se movem. Ao nível molecular, tetraspanins associado com integrinas, proteínas IgSF, factores de crescimento e seus receptores, proteases, e proteínas de sinalização intracelulares para formar MET [44] – [47]. Assim, ao nível molecular, tetraspanins regular a progressão do tumor e metástases, provavelmente, alterando as funções das proteínas associadas [48] – [51].

A expressão de tetraspanina CO-029 é tipicamente ligada ao mau prognóstico de cancros do sistema digestivo [12], [16], [18], [46], [52], [53], CO-029 é regulada positivamente após a progressão de colo-rectal, fígado, pancreático, e cancros esofágicos [11], [ ,,,0],46], [54], e o aumento da expressão de moléculas co-029 promove o fígado ou pulmão metástases destes cancros [17], [52], [53], [55]. migração de células tumorais e invasão por metástases são indispensáveis. O movimento das células tumorais está envolvido em pelo menos duas fases na cascata metástase [52]. A primeira fase é que as células tumorais migram para longe do tumor primário e invadir o sistema circulatório; a segunda fase é que as células tumorais migram para fora dos vasos sanguíneos e nos tecidos alvo. O movimento célula reduzida em presença de co-029 indica que o silenciamento CO-029 é necessária para a migração eficiente e invasão de células de cancro colorrectal e sugere que a co-029 provavelmente promove ambas as fases da metástase de tumores.

CO-029 aparece para promover o movimento de células, alterando célula-matriz e aderências -cell. Está bem estabelecido que a célula-célula e adesão -matrix determina directamente a motilidade celular. Por exemplo, a perda ou diminuição da expressão e /ou actividade de E-caderina nas células tumorais conduz à expedição de células tumorais a partir de massa de tumor primária [56].