Abstract

Fundo

A metilação de ilhas CpG de ADN do genoma e resíduos de lisina de histona H3 e H4 caudas regula a transcrição do gene. A inibição da síntese de poliamina por ornitina descarboxilase antizyme-1 (OAZ) na linha celular de cancro humano por via oral resultou na acumulação de descarboxilado

S- adenosilmetionina

(dcSAM), que actua como um inibidor competitivo das reacções de metilação. Nós antecipamos que a acumulação de reações de metilação prejudicada dcSAM e resultou em hipometilação do DNA e histonas caudas genoma.

Metodologia /Principais Achados

estado de metilação global do DNA e lisina resíduos genoma de histona H3 e H4 caudas foram ensaiadas por metilação pelo método Isoschizomers (Miami) e western blotting, respectivamente, na presença ou ausência de expressão OAZ. A expressão ectópica de OAZ mediada hipometilação de ilhas de CpG de ADN e histona H3 genoma lisina 9 dimetilação (H3K9me2). nível de proteína de DNA metiltransferase 3B (DNMT3B) e histona H3K9me metiltransferase específica G9a foram regulados negativamente em OAZ transfectante.

Conclusões /Significado

OAZ induzida hipometilação de ilhas CpG de ADN do genoma global e H3K9me2 por DNMT3B-down regulação e nível de proteína G9a. A hipometilação de ilhas CpG de ADN do genoma e histona H3K9me2 é um mecanismo potente de indução dos genes relacionados com a supressão do tumor e DNA dupla vertente de reparação ruptura

Citation:. Yamamoto D, Shima K, Matsuo K, Nishioka T, Chen CY, Hu Gf, et ai. (2010) Ornitina descarboxilase Antizyme Induz hipometilação do DNA do genoma e histona H3 lisina 9 dimetilação (H3K9me2) em Oral Linha de células cancerosas humanas. PLoS ONE 5 (9): e12554. doi: 10.1371 /journal.pone.0012554

editor: Shuang-yong Xu, New England Biolabs, Inc, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de maio de 2010; Aceito: 31 de julho de 2010; Publicação: 03 de setembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Yamamoto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

financiamento:. Institutos Nacionais da Saúde (National Cancer Institute) Research Grant RO1-CA10044 para Takanori Tsuji. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ornitina descarboxilase (ODC; EC4.1.1.17), é a primeira e a enzima chave para a biossíntese da poliamina, catalisando a partir de L-ornitina a putrescina limitante da velocidade [1] e está implicada na proliferação e diferenciação celular [2 ]. Ornitina descarboxilase antizyme subfamília é constituída por três membros antizyme relacionados e a molécula inibidora da ornitina descarboxilase antizyme-1 (OAZ) foi descoberto e identificado como uma ornitina descarboxilase (ODC), estimulando a degradação da proteína ODC [3], [4]. OAZ é conhecido por se ligar várias proteínas e medeiam a degradação ou a estabilização das proteínas alvo. Estas proteínas incluem ODC [5], inibidor antizyme [6], a ciclina D1 [7], [8] e de E2 de HPV16 [9]. Como mostrado na Fig. 1, a inibição da actividade da ODC e a síntese de poliamina subsequente por OAZ [10] ou composto químico, α-dif luorometilornitina (DFMO) [5] resultou na acumulação de dcSAM. dcSAM serve como um doador de aminopropilo para a síntese de poliaminas, mas actua como um inibidor competitivo da S-adenosilmetionina, virtualmente em todas as reacções de metilação, incluindo ADN, ARN, proteínas e lípidos [5], [11]. A expressão ectópica de OAZ em células cancerosas por via oral de hamster induzida hipometilação global, e transactivado os genes relacionados com a supressão do tumor e diferenciação epitelial [10]. Posteriormente, o perfil dos genes induzidos ou regulados positivamente em células cancerosas orais humanos por OAZ, e descobriu a indução de genes relacionados ao DNA dupla vertente de reparação pausa por um mecanismo de junção de final não homóloga [10].

ODC é uma enzima chave da síntese de poliamina, catalisando a partir de L-ornitina a putrescina. OAZ é uma molécula inibidora da actividade da ODC por mediar a degradação de proteína ODC. SAM serve como um doador de metilo em reacções de metilação, bem como precursor da produção dcSAM. dcSAM é um doador de aminopropilo de biosíntese de poliaminas, mas também actua como um inibidor competitivo da SAM virtualmente em todas as reacções de metilação. A inibição da actividade ODC conduz à depleção de poliaminas e acumulação dcSAM, que inibe reações de metilação.

metilação do DNA de ilhas CpG e modificação das histonas, particularmente acetilação e metilação de resíduos de lisina de caudas das histonas estão fortemente correlacionados para regular expressão genetica. Acetilação de histona está geralmente correlacionada com a activação da transcrição, mas histona metilação regula a activação da transcrição ou da repressão, dependendo do local de lisina metilação [12]. Histona lisina metilação ocorre em seis resíduos de lisina das caudas de histonas H3 (K4, K9, K27, K36, K79) e H4 (K20) [13], [14]. Cada uma destas lisinas pode ser mono-, di- ou trimetilada [13]. A metilação de H3K4, H3K36 e H3K79 são principalmente correlacionada com a activação da transcrição enquanto que a metilação de H3K9, H3K27 H4K20 e ocorre principalmente em associação com o silenciamento transcricional [15], [16]. A relação de interdependência entre a metilação do DNA e metilação de histonas é um dos temas de interesse na regulação do gene. metilação H3K9 e metilação do DNA estão estreitamente associados na heterocromatina e transcricionalmente reprimida regiões eucromáticos. evidências crescentes revelou que o DNA metilação da citosina co-existe com metilação H3K9 repressiva porque metiltransferases de DNA, proteínas de ligação metil-CpG (MECP2), e protein1 heterocromatina (HP1) recrutar H3K9 metiltransferase específica para metilato resíduos histona lisina [17] – [19]. Este mecanismo é invertida em alguns sistemas [20]. H3K9 metilação é um pré-requisito para metilação do DNA [21] – [24]. Nossa hipótese é que a acumulação de dcSAM por expressão OAZ ectópica leva a hipometilação do DNA do genoma e caudas das histonas e da hipometilação do DNA do genoma e caudas das histonas up-regula ou transactiva os genes envolvidos no DNA dupla vertente de reparação pausa. Os dados genômicos servir como uma base para entender a inter-relação entre o fator de transcrição e os caminhos de cromatina base. No presente estudo, nós analisamos e verificado OAZ mediada hipometilação global DNA do genoma e histona H3 e H4 caudas.

Resultados

actividade ODC

proteína OAZ promove degradação da ornitina descarboxilase (ODC) proteína e redução da atividade da enzima ODC. Para analisar se a proteína OAZ transcrita e traduzida a partir do transfectante OAZ (UM1-pMT /CB6

+ HuFSAZ-WT) é uma proteína biologicamente activa, ensaio de actividade da enzima ODC foi realizada como previamente descrito [10]. A atividade de ODC no transfectante OAZ com ZnSO

4 tratamento exibiram redução da atividade da enzima ODC (1629,0 ± 61,7 /picomoles CO

2 por hora por miligrama de proteína) por 72,6% comparando com o do transfectante simulada vetor (um- 1pMT /CB6

+) tratados com ZnSO

4 (5930,0 ± 110,7 /picomoles CO

2 por hora por miligrama de proteína) (p 0,05). A atividade de ODC no transfectante OAZ sem ZnSO

4 tratamento diminuiu (4944.1 ± 414,6 /picomoles CO

2 por hora por miligrama de proteína) de 30,3% comparando com o do transfectante vector simulado sem ZnSO

4 tratamento (7084,7 ± 284,1 /picomoles de CO

2 por hora por miligrama de proteína) (Fig. 2). Isto é provavelmente devido à fuga de expressão do gene induzida pela quantidade vestigial de Zn

2+ suplementado no meio de cultura. A redução da actividade da ODC no transfectante OAZ confirmou que a proteína induzida por OAZ ZnSO

4 tratamento foi proteína biologicamente funcional.

a actividade da ODC (picomoles de CO

2 por hora por miligrama de proteína) do parental UM1, o transfectante vector simulada e OAZ transfectante com e sem ZnSO

4 tratamento foi medido. quantificação foi realizada em triplicado. valores de actividade da ODC corrigidos foram obtidos através da subtracção do valor do ensaio em branco. atividade ODC de OAZ transfectante sem ZnSO

4 tratamento foi suprimida porque traços de ZnSO vazamento

4 em meio de cultura causada da expressão do gene OAZ.

nível intracelular de poliaminas e metabolitos

Nós antecipamos que a redução da atividade enzimática ODC levou ao esgotamento do pool de poliaminas e da alteração subsequente do nível intracelular de metabolitos de poliaminas. Foram quantificados intracelular ODC, poliaminas e metabolitos nivelar por análise de HPLC como anteriormente descrito [5]. A expressão ectópica de OAZ regulada para baixo nível de proteína ODC de 51ng /10

6 células para 8,4 ng /10

6 células. Como previsto, os níveis de poliamina drasticamente diminuída como resultado da supressão da actividade da ODC. nível putrescina diminuiu de 9 ng /10

6 células a 1,3 ng /10

6 células. nível espermidina diminuiu de 15,1 ng /10

6 células a 0,2 ng /10

6 células. nível espermina diminuiu de 72,8 ng /10

6 células a 1,0 ng /10

6 células (Fig. 3A). S-adenosilmetionina (SAM), que é um doador de metilo em todas as reacções de metilação, foi muito constante ao longo das experiências. A quantidade intracelular de SAM foi de 17,8 ng /10

6 células no transfectante OAZ e 14,3 ng /10

6 células no transfectante vector simulada. O nível intracelular de dcSAM no transfectante controle simulada vector foi de 1,22 ng /10

6 células, mas aumentou drasticamente para 87,9 ng /10

6 células do transfectante OAZ. O nível intracelular de S-adenosylhomocystein (HAS) também aumentou de 0,66 ng /10

6 células para 3,76 ng /10

6 células (Fig. 3b).

piscina poliamina foi esgotada (A ) mas dcSAM e SAH, que eram potenciais inibidores de reacções de metilação, aumentou (B) no transfectante OAZ tratada com ZnSO

4. nível celular da SAM foi constante ao longo dos experimentos (B).

estado de metilação de DNA do genoma

Como já publicado, expressão ectópica de OAZ na hamster queratinócitos orais malignos induzidos hipometilação mundial de sítios CCGG do genoma de ADN [10]. No presente estudo, examinamos se o mesmo hipometilação foi induzida pela OAZ humana na linha celular de cancro oral humana. O nível de citosinas metiladas em locais CCGG foi quantificada medindo a radioactividade nos dois pontos principais, 5 ‘[

32P] dCMP e 5′ [

32P] dm

5CMP por contagem de cintilação líquida. O resultado da quantificação é mostrado na Fig. 4 em percentagem do dm

5CMP. A transf OAZ com e sem ZnSO tratamento

4 exibiu que 26,0% e 40,6% das sequências CCGG foram metilado, respectivamente. As células UM1 dos pais com e sem ZnSO

4 de tratamento, bem como a transf simulada vector com e sem ZnSO

4 tratamento exibiram 48,7% e 50,2% e 40,4% e 40,9% da citosina interna foi metilado, respectivamente. Este resultado indica expressão ectópica de OAZ está associada com desmetilação do DNA do genoma na linha de células de câncer de boca humana. O ADN genómico do transfectante OAZ é de cerca de 60% menos do que metilado que o transfectante de vector simulado.

nível de metilação global de 5′-metil-CMP (dm5’dCMP) e 5’dCMP no ADN do genoma células UM1 parentais, vetor de simulação e OAZ transfectante foi medida por contagem de cintilação.

32 P-rotulados dm

5CMP e CMP foram produzidos por clivagem dos respectivos DNAs genômicos com as enzimas de restrição

Msp

I e sua isoesquisômero sensível à metilação

Hpa

II e que eram separados numa cromatografia em camada fina.

estado de metilação da histona H3 e H4 caudas

estado de metilação dos resíduos de lisina da histona H3 e H4 caudas ligações a formação de eucromatina transacional ou transrepressive heterocromatina dependendo do local de metilação. Esgotamento de piscina poliamina por OAZ levou à acumulação de dcSAM, que atua inibidor tão competitivo da SAM em reações de metilação. Nós antecipamos acumulação de dcSAM mediada hipometilação global resíduos de lisina de histona H3 e H4 caudas. Como a primeira abordagem de triagem para explorar uma ligação potencial entre acumulação de dcSAM e alteração do estado de histonas metilação global, foram analisadas as mudanças globais no estado de metilação de H3 e H4 histne por western blot. Foram utilizados anticorpos contra Dezasseis mono-, di- e tri-metilação de resíduos de lisina específicas de histona H3 e H4. Pudemos observar uma diminuição significativa no nível global das histonas H3 Lys-9 dimetilação (H3K9me2), H3K27me1, H3K27me2, um H3K27me3 de 41,6, 14,3, 16,4 e 17,5%, respectivamente, no transfectante OAZ (Fig. 5A e B). A intensidade do sinal de histona H3 foi constante entre todas as amostras carregadas. Em contraste, outros doze anticorpos para histonas H3 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3, H3K9me1, H3K9me3, H3K36me1, H3K36me2, H3K36me3, H3K79me2) e H4 (H4K20me1, H4K20me2, H4K20me3) não apresentaram qualquer diferença significativa entre o transfectante OAZ e o mock vector transfectante (Fig. 5A e B). Di-metilação da histona H3K9 é uma marca de heterocromatina constitutiva e da repressão do gene. Hipometilação do H3K9me2 representa uma mudança de estado da cromatina de heterocromatina para euchromatin, o que também significa que a atividade transcricional de genes muda de estado repressivo para estado ativo. Esta desmetilação de H3K9me2 por OAZ especula activação dos genes relacionados à diferenciação [10] e DNA dupla vertente de reparação ruptura [25].

hipometilação significativa de H3K9me2 foi mostrado no transfectante OAZ tratado com ZnSO

4 . estado de metilação de outros resíduos de lisina da histona H3 e H4 caudas não foi alterada. Histona H3 e H4 proteínas (17 kDa e 10 kDa, respectivamente) também foi transferido na mesma membrana após a decapagem a monitorizar a mesma quantidade de carga de proteína em cada pista. Mostramos única H3K9, H3K27 e H4K20 resultados porque metilação desses histona caudas funciona como repressor transcricional (A). O valor denota a intensidade relativa das bandas de proteína histona metilados dos tranfectants Oaz para que os transfectantes de vetor simuladas depois de ser normalizado para as bandas PAN H3 e H4. Intensidade do controle (transfectante vector simulado sem ZnSO

4 tratamento) foi considerado como 100 e outros sinais foram expressos em valor relativo (B).

O nível de expressão de DNMTs e G9a

Em primeiro lugar, examinou se OAZ alterou o nível de expressão de mRNA de DNMTs e G9a por qRT-PCR. RT-PCR convencional foi realizada antes de qRT-PCR para confirmar que o conjunto de iniciadores foi capaz de amplificar único fragmento amplificado. Nós confirmaram estes iniciadores de PCR poderia ampliar banda única crocante após o 35 ciclo de reação de PCR (dados não mostrados). Os resultados subsequentes qRT-PCR revelou que a expressão OAZ ou ZnSO

4 tratamento não afectou o nível de DNMT1, 3A, 3B e ARNm G9a (p 0,01) de expressão (Fig. 6). OAZ mediada por hipometilação de DNA global de genoma e histona H3K9me2. DNMTs 1, 3A, 3B e /BPL complexo histona methyltrasferase G9a estão envolvidos na metilação do DNA do genoma e histona H3K9me2, respectivamente. Nossa hipótese é que hipometilação do caudas das histonas foi um dos alvos pleiotrópicos de hipometilação dcSAM mediada, e todas as lisinas metilados de caudas das histonas foram hypomethylated mas na verdade apenas H3K9me2 foi hypomethylated. Este resultado inesperado nos levou a examinar o nível de proteína de DNMTs e G9a. A metilação do H3K9 de mamífero é catalisada por G9a /BPL complexo histona metiltransferase. As análises Western blot revelaram o nível de proteína de DNMT3B (Fig. 7) e G9a (Fig. 8) foi significativamente regulada para baixo, mas o nível de proteína de DNMT1 3A e não foi alterada no transfectante OAZ. Este resultado indica que hipometilação global DNA do genoma e caudas das histonas é causada por não só por um efeito pleiotrópico de dcSAM mas maneira específica trabalha para hypomethylate DNA do genoma e histonas caudas.

O nível de expressão destes mRNA não foi alterada por OAZ. O resultado de PCR foi normalizado utilizando o sinal de beta-actina. Sinal do controlo (transfectante vector simulado sem ZnSO

4 de tratamento) foi considerada como 100 e outros sinais foram expressas como valor relativo.

Os extractos nucleares foram coradas imunologicamente com anticorpos anti-DNMTs. nível de proteína de DNMT1 (183 kDa) e DNMT3A (101 kDa) era constante, mas o nível de proteína de DNMT3B (110 kDa) estava significativamente diminuída no transfectante OAZ tratada com ZnSO

4. As bandas de Fain apareceu na DNMT3A e borrões são DNMT3B isoformas de DNMT3A e 3B. Oct-1 (89 kDa) foi utilizado para monitorizar a mesma quantidade de carga de proteína em cada pista.

Os extractos nucleares foram coradas imunologicamente com o anticorpo anti-G9a. A expressão da proteína G9a (140 kDa) foi diminuída no transfectante OAZ tratado com ZnSO

4.

atividade da enzima DNMT

Usamos poli (dl-dC) poli ( dl-dC) como um substrato para o ensaio de actividade de enzima DNMT. actividade da enzima DNMT foi determinada medindo a incorporação de rótulo em poli (dl-dC) -poli (dl-dC) substrato. Metil poli (dl-dC) -poli (dl-dC) produção foi suprimida por ~ 65% no transfectante OAZ com ZnSO

4 de tratamento em comparação com os do transfectante de controlo e o transfectante OAZ sem ZnSO

4 tratamento ( P 0,01) (Figura 9).. Este resultado revelou que a diminuição da proteína DNMT3B suprimida a parte da actividade total DNMT e essa diminuição da atividade DNMT está correlacionada com a regulação negativa da proteína DNMT3B por OAZ.

ensaio total atividade DNMT foi realizada. DNMT actividade foi reduzida em ~ 65% no transfectante OAZ tratada com ZnSO

4. Este resultado está correlacionada com o resultado western blot de DNMT3B.

Discussão

Nós relataram que a expressão ectópica de OAZ em células cancerosas orais hamster resultou em hipometilação global DNA do genoma [10 ] e induzido ou up-regulada a expressão dos genes relacionados ao DNA dupla vertente de reparação ruptura nas células cancerosas orais humanos [25]. metilação aberrante de ilhas de CpG dentro da região do promotor inactiva a transcrição de genes [26] – [28]. As modificações covalentes de caudas das histonas também desempenham papéis importantes na transcrição, replicação de DNA, reparação quebra do ADN e condensação da cromatina na mitose [29]. Entre estas modificações de histonas, metilação e acetilação de histonas caudas estão envolvidos na regulação da transcrição de genes [30], [31]. No presente estudo, examinou-se o estado de metilação global das ADN lisina e resíduos de genoma de caudas das histonas em células de cancro oral humano, na ausência ou presença da expressão OAZ. A inibição da síntese de poliamina por OAZ acumulada nível anormalmente elevado de dcSAM, que actua como um inibidor competitivo de

S- adenosilmetionina

virtualmente em todas as reacções de metilação. Nós previmos acumulação de dcSAM hipometilação induzida de resíduos de cistina de ilhas CpG e marcas de metilação alterados de resíduos de lisina de caudas das histonas. resíduos de citosina de sites CCGG no DNA do genoma foram globalmente hypomethylated como previsto, mas apenas H3K9me2 foi hypomethylated entre os resíduos de lisina methylable de caudas das histonas. Estes resultados levaram-nos a examinar o nível de proteína de metiltransferases de DNA (DNMTs) e G9a metiltransferase H3K9me2 específicas do. Nossos resultados Western blot exibiu nível de proteína de DNMT3B e G9a foi regulada para baixo nos transfectantes OAZ. padrões de metilação do DNA são estabelecidos e mantidos pela coordenação das metiltransferases de DNA, DNMT1, DNMT3A e DNMT3B. DNMT1 persegue manutenção do padrão de metilação seguinte replicação do DNA, enquanto DNMT3A e DNMT3B são os principais responsáveis ​​de novo metilação [32] e manutenção de metilação em certas regiões do DNA do genoma durante a embriogênese e desenvolvimento [33]. depleção DNMT3B em linhas celulares de cancro humano, a expressão do gene silenciado reactivada-metilação, mas não induziu a desmetilação global por satélite ou juxtacentromeric [34]. Esgotamento de DNMT3B por OAZ pode promover a desmetilação DNA específica de sequência e induzido ou up-regulada a expressão de genes relacionados ao reparo de quebra de DNA, mas o acúmulo de dcSAM também contribuiu para aleatório, desmetilação DNA global.

G9a histona metiltransferase , que metila exclusivamente histona H3K9, também é um grande jogador de silenciamento de genes [35] e essencial para a embriogênese cedo para regular a expressão gênica de desenvolvimento [36]. A metilação de H3K9me2 mediada por G9a altera a estrutura da cromatina de eucromatina relaxado a heterocromatina compacto e reprime um número de expressão do gene [36] – [38]. A metilação de H3K9 tem sido conhecida por associar-se com a hipermetilação do promotor de ilhas de CpG em células cancerosas [39], [40]. A metilação do DNA e H3K9 metilação firmemente cooperar para regular a expressão do gene. H3K9 metilação é um pré-requisito para a metilação de ADN [21] – [23] e metilação H3K9 é necessário para a metilação de ADN [22], [23]. G9a metilação de ADN mediada não exige a sua actividade catalítica [41], sugerindo que podem ter funções adicionais em dirigir a metilação do DNA, tais como o recrutamento de DNMTs [42]. G9a proteína se liga a DNMT1 e conduz ao DNA aumentada e histona metilação [43]. G9a proteína também recruta e liga-se a proteínas e dnmt3a DNMT3B através da sua anquirina (ANK) domínio [44], e localiza-los para os sítios de replicação do ADN. H3K9me2 desempenha um papel igualmente importante na silenciamento de genes em eucromatina e subsequente metilação do DNA de novo de genes de linha embrionárias e germinais durante o desenvolvimento normal [41], e é necessário para a manutenção da metilação do DNA em retrotransposões endógeno, loci impressas, e outros genes em diferenciada células [45]. Li et ai e Deng et al relataram a inibição de metilação de ADN do genoma global com 5-Aza-2′-desoxicitidina (5-Aza-CdR) diminuiu a expressão da proteína de DNMT1 DNMT3B e [46], [47]. Wozniak et al relataram que o tratamento com 5-Aza-CdR hypomethylated H3K9me2 global em células de cancro da mama humano por nível de proteína G9a-regulação para baixo [48]. Estes dados sugerem que a desmetilação de ADN pode ser um sinal que dirige a desmetilação de H3K9 durante a replicação do ADN.

É um resultado estranho que a acumulação de dcSAM não alterar o estado de metilação de resíduos de lisina de caudas das histonas do que outros porque H3K9me2 inibição de metilação por dcSAM parece um efeito pleiotrópico. Os fatores de transcrição também têm efeitos pleiotrópicos, mas sua atividade é estreitamente regulada por elementos cis e trans-acting para regular a expressão do gene em tecido-, stage- desenvolvimento e forma específica da doença. Acreditamos que a inibição de metilação por dcSAM não é modo pleiotrópico mas também é regulado pela cis-actuantes e tras elementos adicionais para os locais alvo específicos de genes e as caudas das histonas. O mecanismo molecular preciso subjacente à diminuição da regulação de proteínas DNMT3B e G9A por OAZ permanece indefinida. Propomos um mecanismo molecular potente que a proteína OAZ se ligar directa ou indirectamente a DNMT3B e /ou proteínas G9A e promove a sua degradação. OAZ proteína tem sido conhecido por se ligar várias proteínas e promove a sua degradação [7] – [9], [49] – [51]. A corrente de nosso resultado ressalta a complexa relação de metilação de histonas e suscetibilidade a metilação do DNA. Essas evidências sugerem que a expressão de genes relacionados ao reparo do DNA [25] podem ser ativados por desmetilação de ilhas CpG e H3K9me2 dentro das regiões reguladoras.

Materiais e Métodos

cultura celular

linhagem humana por via oral célula cancerosa, UM1 [52] eo OAZ transfectante de zinco-inducible (TEM /CB6

+ HuFSAZ-peso) e do transfectante simulada vetor (UM1-pMT /CB6

+) foram cultivadas como previamente descrito [25]. A expressão do gene OAZ da PMT /CB6

+ HuFSAZ-wt foi induzida por 100 M ZnSO

4 tratamento e as amostras de proteínas foram colhidas após uma semana ZnSO

4 tratamento.

ensaio de actividade de ODC

Para verificar se a proteína OAZ traduzido a partir do transfectante OAZ era biologicamente activa da proteína nas células U1, a actividade enzimática da ODC foi ensaiada como previamente descrito [10]. Resumidamente, a actividade ODC foi quantificada a liberação de [

14C] CO

2 durante a conversão ODC-catalisada de L-ornitina a putrescina. A mistura de reacção continha 50 ul de ligado de células preparadas a partir do transfectante OAZ e o transfectante simulada vector com e sem ZnSO

4 de tratamento, 75 ul de mM de glicil-glicina 100 (pH 7,2), 0,2 mM de fosfato de piridoxal, ditiotreitol 4 mM , 0,4 mM L-ornitina, e 0,25 uCi [

14 C] L-ornitina. As reacções foram realizadas a 37 ° C durante 2 h e terminada por aquecimento a 85 ° C durante 5 min. [

14C] CO

2 foi preso com filtro de papel Whatman 3 mm manchado engenho 10 ul de 10% w /v de KOH e quantificado por contador de cintilação. Os ensaios foram realizados em triplicado. A amostra de controlo era o branco contendo tampão de lise, em lugar do sobrenadante. valores de atividade de ODC corrigidos foram obtidos subtraindo valores para em branco e demonstrados como picomoles CO

2 por hora por miligrama de proteína. A análise estatística foi realizada por análise de variância Um fator.

HPLC análise

quantidade intracelular de ODC, poliaminas, SAM, dcSAM e HAS (S-adenosylhomecysteine) foi quantificada por análise de HPLC de fase reversa . Os lisados ​​de células inteiras a partir do transfectante OAZ eo transfectat simulada vector com e sem ZnSO

4 de tratamento foram preparadas em ácido perclórico 0,2 M. Os lisados ​​celulares foram centrifugados a 13000 X g durante 10 min e os sobrenadantes foram sujeitos a análise por HPLC de fase reversa numa coluna Supercosil LC-18-DB (4,6 × 250 mm, 5 um de tamanho de poro) equilibrada com 0,2% de trietilamina-fosfórico ácido (pH 4,0). A eluição foi realizada com 20 min de gradiente linear de 0-10% de acetonitrilo. As aliquotas foram sujeitas a separação cromatográfica. Os padrões de ODC, poliaminas, a SAM e HAS foram adquiridos da Sigma-Aldrich. O padrão para dcSAM era uma simpática oferta do Dr. Keijiro Samejima da Universidade Josai no Japão.

análise de Western blot das caudas metil-histona

Padrão de metilação de cada caudas das histonas foi verificada por western blot . As amostras Protin para análises de Western blot de caudas de histona foram preparados por adição directa de 500 ul de tampão de amostra SDS de Laemmli em 100 milímetros placa de cultura e as células foram colhidas por desfazer-se com um polícia de borracha. As células colhidas foram fervidas durante 15 minutos em tampão de amostra e centrifugou-se a 16000 x g durante 30 minutos. A quantidade de proteína foi estimada pelo número de células da cultura replicado. As proteínas extraídas equivalentes a 1 × 10

5-5 × 10

5 células foram carregadas e separadas em gel de SDS-PAGE 15%, transferidos para uma membrana de PVDF, bloqueados com leite a 5% em tampão de TBS-T e apagados com cada anticorpo na diluição recomendada pelos fabricantes. Os sinais foram desenvolvidos com SuperSignal® West Pico Substrato quimioluminescente de Pierce e autografado no filme. Para eliminar o potencial artefato causado pelo zinco, repetimos os mesmos experimentos usando os tarsnfectants-hOAZ PCI-neo (PCI-neo-hOAZ-UM1). Os anticorpos utilizados neste estudo foram adquiridos a partir de Upstate Biotechnology. Os anticorpos e os seus números de catálogo estão; H3 pan-histona (07-690), H4 pan-histona (05-858), H3K4me1 (07-436), H3K4me2 (07-030), H3K4me3 (07-473), H3K9me1 (07-450), H3K9me2 ( 07-441), H3K9me3 (07-442), H3K27me1 (07-448), H3K27me2 (07-452), H3K27me3 (05-851), H3K36me1 (05-800), H3K36me2 (07-369), H3K36me3 (05 -801), H3K79me2 (05-835), H4K20me1 (05-735), H4K20me2 (07-367), H4K20me3 (07-463). Os anticorpos secundários utilizados foram de cabra marcado com HRP de IgG anti-ratinho (PerkinElmer, NEF822001EA) e IgG anti-coelho de cabra marcado com HRP (PerkinElmer, NEF812001EA). A intensidade de cada banda foi medida e analisados ​​utilizando o software ImageJ fornecida pelo NIH (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

quantitativo em tempo real ensaio de PCR de DNMTs e G9a

O nível de expressão de ARNm DNMTs e G9a quantitativa foi quantificada por PCR em tempo real (qRT-PCR). O ARN total foi isolado a partir da OAZ e os transfectantes vector de simulação, utilizando o reagente TRIzol ® (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Os iniciadores de PCR foram desenhados utilizando a versão 7.2 do software MacVector com base nas sequências de ADNc que foram transferidas a partir do banco de dados do NCBI. As reacções de qRT-PCR foram realizadas utilizando um LightCycler FastStart LightCycler com ADN mestre SYBR Green I kit. A amplificação do ADNc da amostra foi monitorizada com o corante de ligação a ADN fluorescente SYBR Green em combinação com um sistema de detecção de sequência ABI 5700. β-actina foi utilizado como um controlo para a normalização endógena. As sequências de iniciador de PCR, temperaturas de recozimento ideais e tamanhos amplicon estão listadas na Tabela 1. A análise estatística foi realizada por análise de variância Um fator.

análise Western blot de DNMTs e proteínas G9A

o extracto nuclear foi preparado a partir do OAZ e os transfectantes vetor simulados utilizando NE-PER® Citoplasmáticas de extracção Reagentes (Thermo Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante e nucleares. Cinquenta ug de extracto nuclear de cada amostra foi carregada e separados em gel de SDS-PAGE a 5% e a proteína foi transferida para uma membrana de PVDF. A subsequente transferência de Western foi realizada como descrito acima. Os anticorpos utilizados para este estudo foram um anticorpo policlonal de coelho anti-humano DNMT1 (Abcam, ab19905, 1:500), um anticorpo anti-ratinho DNMT3A-coelho policlonal (Abcam, ab23565, 1:200), um anticorpo policlonal de coelho anti-murganho anticorpo DNMT3B (Abcam, ab16049, 1:300) e um anticorpo policlonal de coelho G9a anti-humano (Upstate Biotechnology, 07-551,1:1,000). A quantidade igual de carregamento de amostras foi monitorada e confirmada pelo Oct-1signal usando um anticorpo policlonal de coelho Oct-1 anti-humano (Santa Cruz Biotechnology, Inc., SC-232, 1:1,000).

enzima DNMT ensaio

a actividade da enzima DNMT actividade foi determinada pelo método de Belinsky et ai com modificações de menor importância [53]. O lisado celular foi preparada em tampão de lise por congelação-descongelação, três vezes e centrifugou-se para remover os detritos celulares. O lisado celular contendo 20 ug de proteína (125 ul) foi misturado com 125 ul de mistura reaccional (Tris HCl 20 mM, pH = 7,4, 25% de glicerol, EDTA 5 mM, DTT 1 mM, 5 ^ Ci [metil-3H] -S-adenosil -L-metionina, 4? g de poli [dl-dC] poli [dl-dC], 25 ug de BSA) e incubou-se durante 2 h a 37 ° C. As reacções foram paradas e o DNA foi extraído com fenol: método de extracção chrolform. A solução aquosa foi suplementado com 0,1 N de NaOH e incubado durante 2 horas a 50 ° C. A mistura de reacção foi neutralizada com HCl 1N. O DNA foi precipitado com TCA a 20% e preso no filtro G /C. A radioactividade foi contada com um contador de cintilação.