Abstract

Fundo e Propósito

Embora gene da modificação das células T para expressar o receptor relacionado com o tumor específica do antigénio de células T (TCR) ou receptor do antigénio quimérico (RCA) tem promessa clinicamente provado, continua a existir espaço para melhorar a eficácia clínica de dirigido re-t -cell terapia adoptiva antitumoral base. A fim de alcançar respostas clínicas mais objetivos usando ex vivo expandido células T tumor-responsiva, as células T infundidas precisa mostrar a infiltração localizada adequada para o tumor.

Metodologia /Principais Achados

Humano células de cancro do pulmão de várias expressar um antigénio de tumor, de Wilms ‘tumor gene de produto 1 (WT1), e uma quimiocina inflamatória, CCL2. No entanto, CCR2, o receptor relevante para CCL2, raramente é expresso em linfócitos T activados. A HLA-A2402

+ linha de células de cancro do pulmão humano, LK79, que expressa quantidades elevadas de ambos

CCL2

e

WT1

mRNA, foi empregado como um alvo.

+ células T CD8 normais foram retroviralmente-gene modificado para expressar tanto o CCR2 e HLA-A * 2402-restrito e WT1

TCR específico do nonapéptido 235-243 como um efector. funcionalidade anti-tumoral mediada por estas células efectoras contra células LK79 foi avaliada tanto in vitro como in vivo. Finalmente, o impacto de CCL2 em WT1 epitopo de TCR que responde a sinalização mediada pelas células efectoras foi estudada. CCR2 foi introduzido funcionalmente validado utilizando células Jurkat de genes modificados e humano CD3

+ células T tanto in vitro como in vivo. -Gene modificado CD3 dupla

células T + demonstrado com sucesso tanto o tráfico de tumor CCL2-trópicos e reactividade citocida contra células LK79 in vitro e in vivo. CCL2 aumentada do epitopo de resposta de sinalização TCR WT1 mostrado pela produção de luciferase relevante em células de Jurkat /MA de genes modificados duplos para expressar luciferase e específico para WT1 TCR, e CCL2 também dependente da dose aumentada WT1 produção epitopo-responsivo IFN-γ e expressão CD107a mediada por estes + células T duplo gene-modifiedCD3

.

Conclusão /Significado

Introdução do eixo CCL2 /CCR2 potencializadas com sucesso na reatividade câncer anti-lung vivo mediada por CD8

+ células T duplo gene modificado para expressar WT1 específicos TCR e CCR2, não só através do tráfico CCL2-trópico do tumor, mas também-CCL2 reforçada WT1-responsividade

Citation:. Asai H, Fujiwara H, An J , Ochi t, Miyazaki Y, Nagai K, et al. (2013) Introduziu-Co CCR2 Funcional Potencializa In Vivo Anti-Lung Cancer Funcionalidade mediada por células T-gene modificado duas vezes para expressar WT1-Specific Receptor T-Cell. PLoS ONE 8 (2): e56820. doi: 10.1371 /journal.pone.0056820

editor: Nupur Gangopadhyay, da Universidade de Pittsburgh, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de setembro de 2012; Aceito: 14 de janeiro de 2013; Publicação: 18 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Asai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão para HF e meu, e um Grant-in-Aid para Pesquisa do Câncer do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar para MY. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores exceto SO, JM e HS declararam que nenhum interesse competindo existe. SO e JM é funcionário da Takara Bio, Inc .. HS é fornecido com o financiamento da investigação da Takara Bio, Inc .. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Apesar do recente progresso terapêutico, a sobrevida global dos pacientes com câncer de pulmão avançado continua a ser pobre [1], e, portanto, a exploração de novas terapias continua a ser um objectivo desejável. Os resultados de ensaios clínicos de terapia adoptiva anti-tumoral utilizando células T tumor-responsivo vivo-expandidas ex, principalmente linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) T, para o tratamento de melanoma avançado demonstraram uma resposta clínica impressionante. Por outro lado, existem alguns inconvenientes, tais como a complexidade dos procedimentos e a dificuldade de manutenção da qualidade terapêutica de células T de longo prazo-cultivadas [2]. Recentes avanços técnicos que envolvem modificações de genes para introduzir receptores tumorais responsivas em células T terapêuticos – tais como o receptor do tumor específico de antigénio de célula T (TCR) e do receptor de antigénio quimérico (CAR) -, em grande parte ter ultrapassar estas desvantagens [3] – [5 ]. No entanto, como a gama de tumores apropriadamente responsivas ainda é limitada, propusemos algumas novas opções, tais como HLA-A * 2402-restritos específicos para WT1 TCR [6] e HLA-A * 0201-restrito de quinase Aurora A (AURKA) espec�ico TCR [7], para o tratamento de leucemias humanas. Um outro avanço técnico propusemos é um novo sistema de TCR vector que proporciona simultaneamente shRNAs para genes α /p de TCR endógenos (siTCR vector) [8], reduzindo assim a formação de TCR mispaired, o risco potencial de GVHD aguda letal [9].

WT1 é um antigénio tumoral bem conhecido expressa em graus diferentes pelas células de câncer de pulmão humanos [10], e de expressão WT1 foi mostrado clinicamente para ter valor prognóstico em pacientes com câncer de pulmão [11]. Usando um modelo de xenoenxerto do rato, que tenham sido explorada anteriormente o cancro do pulmão potencial anti-terapêutico de uma linha de células ex vivo expandido citotóxica clonal T (CTL) [12], TAK-1, que reconhece especificamente o WT1

235-243 nonâmero epítopo no contexto de HLA-a * 2402 [13].

por outro lado, a infiltração insuficiente de células T terapêuticos em locais de tumor localizado é um constrangimento para o sucesso do tratamento [14]. A fim de aumentar a actividade de tráfico de tumor de células T infundidas terapêuticos, a sua capacidade de resposta a quimiocinas adequadas produzidas pelas células tumorais ou células imunitárias infiltrados com tumor é necessária. Primeiro por Kershaw et al. [15], uma série de estudos pré-clínicos com base neste conceito foram conduzidos [16] – [19]. No entanto, a questão principal das quais par receptor de quimiocina-quimiocinas deve ser escolhido para aplicação clínica ainda precisa ser resolvida. No presente estudo, a fim de analisar as potenciais vantagens de co-introdução de um eixo receptor de quimioquina-quimioquina para antitumoral imunoterapia adoptiva, foram empregados como um modelo geneticamente redireccionada de células T dirigidas de WT1 para o tratamento de cancro do pulmão humano.

neste estudo, descobrimos que quimiocinas CC 2 (CCL2) foi produzido para graus variáveis ​​de linhas celulares de cancro de pulmão humano, e que LK79, a HLA-a * 2402

+ cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) linha de células com superexpressão

WT1

mRNA, produzido quantidades muito elevadas de CCL2. LK79 foi morto por CD8

+ T-células de genes modificados para expressar o TCR específico para WT1 proveniente de TAK-1. Por outro lado, CCR2, o receptor específico para CCL2, quase não foi expressa nestas transfectantes. Tomados em conjunto, os dados sugerem que, a fim de demonstrar a nossa prova-de-conceito, seria sensato para empregar o eixo CCR2-CCL2 no cenário de células T redirecionadas segmentação WT1 e câncer de pulmão. Porque o tratamento de Quimioterapia continua a ser um desafio [20], consideramos que o uso de LK79, uma linha de células SCLC, como um alvo, pode abrir uma nova avenida de terapia para a SCLC.

No presente estudo, examinados em detalhe a funcionalidade anti-cancro do pulmão mediada por CD8 duplamente transfectada

+ células T para expressar TCR específico para WT1 e CCR2 contra LK79 células, tanto in vitro como in vivo. Com base em nossas observações, discutimos a aplicabilidade clínica desta estratégia para uma imunoterapia adoptiva contra o câncer de pulmão humano.

Materiais e Métodos

1. Ética Declaração

A aprovação para este estudo foi obtido a partir do Institutional Review Board do Hospital Universitário de Ehime. consentimento informado por escrito foi dado por todos os voluntários saudáveis ​​de acordo com a Declaração de Helsinki. Todos os experimentos in vivo rato foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais Universidade Ehime.

2. Células

As células Jurkat (ATCC) e linhas celulares de cancro do pulmão humanas positivas tanto para HLA-A * 2402 ambos foram empregados

+, mRNA WT1, ou. Este último LC99A incluído (origem carcinoma de células grandes) [21], LK79 (carcinoma de células pequenas) [21], RERF-LC-A1 (carcinoma de células escamosas) [21] e LC11-18 (adenocarcinoma) [22]. PC-9 (adenocarcinoma) [21] foi positiva para HLA-A * 2402

+ mas negativa para WT1 ARNm, SQ-1 (carcinoma de células escamosas) [21], LC65A (carcinoma de células pequenas) [21], QG56 (carcinoma de células escamosas) [21], LK87 (adenocarcinoma) [21], e 1-87 (adenocarcinoma) [21] foram negativos para HLA-a * 2402. Todas estas linhas celulares de cancro de pulmão previamente publicados foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Akio Hiraki (Okayama University Graduate School, Okayama, Japão), e cultivados como relatado anteriormente [12]. A linha celular Jurkat /MA (gentilmente cedido pelo Prof. Erik Hooijberg, Vrije Universiteit Medisch Centrum, Amsterdão, Países Baixos) é um subclone de células de Jurkat, previamente estabelecido pelo Prof. Erik Hooijberg e colegas que carece de expressão endógena de TCR e estavelmente expressa tanto a humanos gene de CD8a (

hCD8α

) e um

construção

gene NFAT-luciferase para a detecção de sinalização através de TCRs recentemente introduzidas [23]. O

HLA-A * 2402-

gene transduzido linha celular C1R (C1R-A24) também foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de vitela e 0,5 mg /ml de higromicina B (Invitrogen). As linhas celulares B-linfoblastóides (B-LCLS) foram criadas através de transformação de linfócitos B do sangue periférico com vírus de Epstein-Barr. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de voluntários saudáveis ​​foram isolados e armazenados em azoto líquido até à sua utilização.

3. Ratos

NOD /scid /yc

nulos seis semanas de idade (NOG) camundongos fêmeas foram adquiridos no Instituto Central de Animais Experimentais [24] e mantidos em biotério institucional na Universidade de Ehime.

4. A citometria de fluxo

marcadores de superfície de transfectantes ou células T não modificadas por genes foram marcadas com anti-CD8, anti-CD4, anti-CD3 e anti-CD45 mAb (BD Biosciences), anti-CD25 e anti- CD69 mAb (BioLegend), mAb anti-Vβ5.1 (Beckman Coulter), mAb anti-CCR2 (R D Systems), e HLA-A * 2402 /WT1

235-243 tetrâmero-PE ou HLA-A * 2402 /Env do HIV-1

584-592 tetrâmero-PE, como um controlo negativo. A citometria de fluxo foi realizada utilizando um fluxo Gallios citômetro (Coulter) e análise de dados foi realizada por meio de fluxo Jo Versão 7.2.2 software (TreeStar).

5. WT1-siTCR vector retroviral e CCR2 vector retroviral

O HLA-A * 2402-restrito e específico WT1-235-243

TCR-α (Vα20 /J33 /Ca) e TCR-β (Vβ5. 1 /J2.1 /Cβ2) genes, que se originou a partir de TAK-1 [13], foram clonados no vector retroviral nosso novo siTCR (vector de WT1-siTCR), então transduzido para as células T utilizando este vector como descrito anteriormente [6], [8]. O ADNc de comprimento completo do humano

CCR2

gene (1083 pb) (NM_001123396.1) foi clonado e codão otimizado (GeneArt), em seguida, inserido no vector de pRetroX-IRES-DsRed Express (Clontech). vectores retrovirais ecotrópico foram obtidos por co-transfecção transitória com outros componentes (Takara Bio) para a linha celular HEK293; Subsequentemente, os vectores retrovirais pseudotipados-GaLV foram obtidos por transfecção sequencial destes vectores para a linha celular PG13 (Takara Bio).

6. Transdução do

TCR

e

CCR2

genes

células Jurkat /MA e células T do doador saudáveis ​​foram gene modificado para expressar WT1 específicos TCR e CCR2 como descrito anteriormente [ ,,,0],6]. Resumidamente, no dia 1, 1 × 10

6 células T por poço em GT-T503 (Takara Bio) com 5% de soro humano, 0,2% de albumina humana, 50 U /mL de recombinante humano IL-2 (R D Systems ), 10 ng /mL de recombinante humano IL-15 (PeproTec Inc.) e 100 ng /mL de recombinante humano IL-21 (Shenandoah Biotechnology Inc.) foram adicionados a uma placa de cultura de 24 poços pré-tratadas com o Acm anti-CD3 humano ( BioLegend). As células de Jurkat /MA foram cultivadas em IMDM com FCS a 8% e 50 mg /ml de higromicina B. No dia 3, as células T cultivadas ou de células de Jurkat /MA foram transferidas para uma placa revestida com RetroNectin-24 poços, centrifugou-se a 2000 pré-carregado-retrovírus ×

g

durante 2 horas e lavadas com PBS. As células foram, em seguida, aplicada novamente para outra placa de 24 poços pré-tratada de forma semelhante para a segunda transdução. O WT1-si

TCR-

e

CCR2

-transduced células T foram estimuladas semanalmente com mitomicina-C (MMC) (Kyowa Hakko) tenha sido tratada com e heteróclita WT1

235-243 peptídeo (CYTWNQMNL) -pulsed HLA-A * 2402-positivos LCLS. Em algumas experiências, CD8

+ células T transfectadas para expressar WT1-específica de TCR foram isolados utilizando anticorpos anti-FITC-Vβ5.1 mAb (Beckman Coulter) e anti-FITC conjugados esferas imunomagnéticas (Miltenyi Biotec), e

CCR2

transfectantes também foram isolados utilizando anticorpos anti-CCR2-PE mAb (R D Systems). esferas imunomagnéticas e anti-PE-conjugados (Miltenyi Biotec)

7. Avaliação das quimiocinas produzidas por linhas celulares de cancro do pulmão humano

Todos os iniciadores para quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) usado para a avaliação de 12 quimiocinas seleccionados produzidos por 10 linhas celulares de cancro do pulmão humano estão listados na Tabela 1. resumidamente, ARN total foi extraído de cada linha celular com um Kit RNeasy Mini (Qiagen) e o ADNc foi sintetizado. qRT-PCR para mRNA de quimiocina foi realizada utilizando um kit de QuantiTect Syber verde de PCR (Qiagen) tal como descrito anteriormente [7]. hipoxantina humana 1 (

hHPRT1

) mRNA (NM_000194) foi utilizado como um controlo interno. As condições de PCR foram 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 15 min, 50 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min, 95 ° C durante 15 s e depois 60 ° C durante 1 min. Estas amostras foram analisadas utilizando um ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). A expressão de ARNm de cada quimioquina foi corrigido por referência à do

hHPRT1

ARNm, e a quantidade relativa de ARNm de cada quimioquina foi calculada pela comparativa

método ôc t. CCL2 proteína produzida por cada linha celular foi avaliada utilizando um kit de ELISA (R D Systems). Estreptavidina-HRP foi utilizado para o desenvolvimento da cor, e luminointensity foi medido utilizando IMMUNO-MINI (NJ-2300; Microtec).

8. produção de luciferase WT1-responsive mediada por células /MA Jurkat duplamente transfectadas

Para medir o impacto da ligadura CCL2 para CCR2 em WT1 sinalização de TCR epitopo-responsive co-introduzida, a linha de células /MA Jurkat, que é desprovido de TCR endógena, e expressa de forma estável

hCD8α

e um

gene

repórter NFAT-luciferase (Jurkat /MA /CD8a /luc) foi empregado. Resumidamente, o WT1-si

TCR

e

CCR2

genes foram retrovirally traduzidas em mA /CD8a células Jurkat //luc, como descrito anteriormente [7]. Jurkat /MA /CD8a /luc células de genes modificados duplos, duplos positivos para Vβ5.1 e CCR2, foram isolados, expandidos e sujeitos a análise funcional. Dois milhões de duplo-transfectadas Jurkat /MA /CD8a /células luc foram co-incubadas com 1 x 10

6 células C1R-A24 tratadas com MMC com ou sem péptido WT1 carregado (20 uM) como um estimulador de várias concentrações de humano CCL2 recombinante (Peprotech) durante 12 horas a uma razão de 2:01 effector:target. Single-transfectadas Jurkat /MA /CD8a /luc células que expressam apenas TCR específico para WT1 foram usadas como controlo. Subsequentemente, estas células foram lisadas e sujeitas a ensaio de luciferase utilizando um Kit de PicaGene-Dual-SeaPansy (TOYO inki). A actividade de luciferase foi medida utilizando uma Lumicounter 700 (Microtec cognição).

9.

51Cr-release ensaio

Para determinar a atividade citotóxica mediada pelo

WT1-siTCR

-transduzidas gene CD8

+ células T, foram realizados

ensaios de 51Cr de libertação padrão tal como descrito anteriormente [25]. Resumidamente, 10

4 células alvo não pulsados ​​ou pulsadas com péptido foram marcadas com

51Cr (Na

2CrO

4: MP Bio Japão) e incubadas em várias proporções com células efectoras em 200 uL de meio de cultura em placas de 96 poços de fundo redondo. Para o ensaio de inibição, as células foram cultivadas na presença de quer um mAb quadro de classe I anti-HLA (W6 /32; ATCC), ou um controlo de anti-HLA-DR mAb (L243; ATCC). Após 5 horas de incubação com células efectoras, a 100 ul de sobrenadante foram recolhidos de cada poço. A percentagem de lise específica foi calculada como:. (Libertação experimental cpm cpm espontânea release) /(libertação máxima cpm espontânea cpm release) x 100 (%)

10. IFN-γ ensaio de secreção

quinhentos mil células duplamente transfectadas normais periféricos CD8

+ T que expressam tanto WT1 específicos de TCR e CCR2 foram co-incubadas com 1 × 10

5 WT1 peptídeo-pulsada (1? M) ou não pulsados ​​células C1R-A24 durante 24 horas em várias concentrações de CCL2. IFN-γ no sobrenadante da cultura foi medida de modo análogo utilizando um kit de ELISA (R D Systems).

11. CD107a ensaio

expressão CD107a mediada por CD8 duplamente transfectada

+ células T em resposta à estimulação com péptido WT1, foi analisada como descrito anteriormente [26]. Resumidamente, 1 x 10

5 células C1R-A24 foram semeadas numa placa de 96 poços de fundo redondo e incubadas com ou sem péptido WT1 durante 2 horas em várias concentrações de CCL2. Em seguida, 2 × 10

5 destes duplamente transfectada CD8

+ T células foram semeadas em cada poço com conjugado com FITC CD107a mAb (BioLegend), e incubou-se durante 3 horas. As células foram, em seguida, adicionalmente marcado com anti-CD3, anti-CD8 mAb (BD Biosciences) e conjugado com PE HLA-A * 2402 /WT1

235-243 tetrâmero, e submetido a análise citométrica de fluxo.

12. experimentos Transwell

validação funcional de CCR2 transdução foi realizada in vitro empregando experimentos transpo�. Resumidamente, 2 × 10

5 /poço

CCR2

células Jurkat -transfected foram colocados no poço superior, e 500 uL de RPMI 1640 com meio de cultura de FCS a 10% contendo várias concentrações de CCL2 foi adicionado à cavidades de fundo de um 3-de poro de tamanho de 24 poços Transwell placa (Coster). Após 4 horas de incubação, as células no poço inferior foram contadas utilizando o método de exclusão de corante azul de tripano. Todas as experiências foram realizadas em triplicado e independentemente três vezes. Quando as linhas de células de cancro do pulmão humanas foram inoculadas em poços de fundo, Transwell experiências foram conduzidas de forma semelhante depois de 24 horas de pré-incubação. Uma experiência de bloqueio, foi realizada utilizando formiga-de CCR2 mAb (R D Systems). Finalmente, tanto o tráfico de tumor e atividades citocidas mediada pela dupla modificado com o gene CD8

células + T foram examinados no mesmo experimento transpoço. Resumidamente, usando um 3-de poro de tamanho de 6 poços Transwell placa, as células foram semeadas em LK79 o fundo do poço com 10

6 /poço e incubou-se durante 24 horas. células T +

CD8, em seguida, dê um duplo-transfectadas foram carregados no bem superior a 2 × 10

6 /poço. específico para WT1

TCR

single-transfectadas CD8

+ T células foram usadas como controlo. Após 12 horas de incubação, cada sobrenadante em cavidades de fundo foi colhido. Após centrifugação a 1200 rpm durante 5 minutos para remoção de células residuais, 100 ul de cada sobrenadante foi submetido a ensaio ELISA (Roche) de lactato desidrogenase (LDH) de ter vazado a partir das células LK79 interrompidos por células T efectoras específico para WT1 migraram. As experiências foram realizadas em triplicado. Uma vez que as células efetoras retroviral

CCR2

vector de expressão de gene entregue simultaneamente uma proteína fluorescente de cor vermelha (DS-Red), double-transfectadas tendo migrado para o bem inferior também foram detectados por microscopia confocal (A-1R, Nikon , Japão).

13. In vivo WT1 independente de antigénio migração

Em um modelo de xenoenxerto de rato, actividade tráfico tumor dependente de CCL2 mediada pela

CCR2

e

luciferase

CD3 transfectadas duas vezes o normal

+ células T foi avaliada utilizando o ensaio de imagem de bioluminescência. Resumidamente, 1 x 10

7 LK79 células foram inoculadas por via subcutânea na parede abdominal de ratos NOG 1 9 semanas de idade Gy-irradiadas (n = 6). Uma coorte (n = 3) receberam administração intravenosa de único

luciferase

-transfected CD3 humano

+ T células (5 × 10

6 células /ratinho) como um controle, eo outro grupo ( N = 3) recebeu duas vezes transfectadas CD3

+ células T no dia 0. em seguida todos os ratinhos receberam administrações intraperitoneais em série de 500 UI de IL-2 humana recombinante (Roche) nos dias 0, 2, 4, e 6. aquisição em série de fótons luciferase contagens utilizando luciferina (Promega Corporation) foi realizada nos dias 1, 3, 5 e 7 usando Aequoria (Hamamatsu Photonics, Japão), e analisados ​​utilizando software AQUACOSMOS (Hamamatsu Photonics).

14. Na atividade tumor-supressora vivo mediada por células T efetoras duplamente transfectadas infundidos em um modelo terapêutico do mouse

Para experiências de transferência adotiva terapêuticas, preparamos

luciferase

-transfected LK79 células (LK79 /luc) CCL2 cuja produção foi igual à das células parentais LK79. Todos os ratos NOG 9 semanas de idade (n = 18) foram de 1 Gy-irradiada e, em seguida, inoculados subcutaneamente com 5 x 10

6 LK79 /luc células na parede abdominal no dia 0. Estes ratinhos foram divididos em três grupos: i) aquelas administradas por via intravenosa 5 x 10

6 OKT-3 /IL-2 activada CD8

+ T em células sem qualquer modificação genética (n = 6), ii) aqueles tratados com 5 × 10

6 específico para WT1 única

TCR

-transfected CD8

+ células T de um dador idêntico (n = 6), e iii) aqueles tratados com 5 × 10

6 duplamente transfectada CD8

+ células T também do mesmo dador (n = 6). Os ratos em cada grupo receberam a mesma terapia celular três vezes por semana no total, (nos dias 4, 11, e 18). aquisição de série de contagens de fótons luciferase para células LK79 /luc inoculados foi realizado. As contagens de fotões em relação ao que no primeiro dia de terapia celular, o que indica a carga de massa do tumor residual, foram calculadas, em cada ratinho.

15. A análise estatística

O emparelhado

t

teste foi utilizado para avaliar as diferenças entre dois grupos, e um one-way análise fatorial de variância seguida do teste post-hoc de Tukey foi utilizado para comparações entre três grupos; diferenças no

p

. 0,05 foram considerados significativos

Resultados de

1. A produção de várias quantidades de CCL2 por linhas celulares de cancro do pulmão humano, e da expressão rara do receptor CCR2 correspondente em células T activadas com OKT-3 e IL-2

Os perfis dos 12 mRNAs de quimiocina produzido por expressão escolhidos cada uma das linhas celulares de cancro do pulmão humano avaliadas por qRT-PCR estão resumidas na Tabela 2. Tal como mostrado na Figura 1A, várias quantidades de proteína CCL2 foram produzidos em todas as linhas celulares de cancro de pulmão avaliada, entre os quais LK79, uma linha de células SCLC , nomeadamente produzida grandes quantidades de CCL2. O receptor correspondente, CCR2, raramente era expresso na superfície de ambas as células T em repouso ou activadas utilizando os OKT-3 /IL-2 (n = 5). As células T ativadas foram fechado com positividade CD69. Um exemplo representativo entre 5 casos é mostrado na Figura 1B. Os níveis de expressão para células activadas e em repouso foram: CD8, 0,83 ± 0,72% e 0,75 ± 0,51%, e CD4, 0,66 ± 0,45% e 0,5 ± 0,26% (média ± SD), respectivamente. Além disso, qRT-PCR revelou que os níveis de expressão de

CCR2

mRNA em células T ativadas e repouso (n = 5) não diferiu em ambos CD4

+ ou CD8

+ T células (dados não mostrado). Por outro lado, efectoras CD8

+ células T duplamente transfectada para expressar HLA-A * 2402-restrito candidatos com sucesso morto linhas celulares de cancro do pulmão humano WT1

235-243 específica de TCR-e, um HLA-A * 2402-restrito forma (Fig. 1C e 1D). Tomados em conjunto, os dados sugerem que a escolha do eixo CCR2-CCL2 e o emparelhamento de CTL compreendendo células efectoras gene modificado para expressar-WT1 específica de TCR com células alvo LK79 que eram sensíveis à actividade citocida mediada pelos CTL transfectadas era razoavelmente apropriado para demonstrar a prova-de-conceito deste estudo. Por conseguinte, estes efetoras duplamente transfectada CD8

+ T células emparelhado com células-alvo LK79 foram empregados nos experimentos posteriores.

ensaio (A) ELISA revelou que 10 linhas de células de câncer de pulmão humanos examinados produziu várias quantidades de CCL2 no sobrenadante da cultura. As barras de erro representam SDs. (B) De modo semelhante a transdução do específico para WT1

TCR

gene, CD69-positivas CD8

+ e CD4

+ células T activadas utilizando IL-2 e OKT-3 raramente exibidos na superfície celular CCR2. Um exemplo representativo de 5 casos é mostrado. (C) CD8

+ T células modificadas para expressar o gene de HLA-A * 2402-restrito e WT1

235-243 nonâmero específica de TCR-exibida com sucesso a actividade citocida contra as células de linha celular de cancro do pulmão em um HLA-A * maneira 2402-restrito, conforme determinado pelo ensaio de libertação de padrão

51Cr. As barras de erro representam SDs. MFI indica a intensidade de fluorescência média, N.D. indica menos de detectável. (D) Tal actividade anti-cancro do pulmão (comparada LK79 e LC99A) foi inibida por anti-HLA de classe I quadro mAb (clone de W6 /32), mas não por anti-HLA-DR mAb (clone L243), de novo ilustrando que a actividade tumoricida mediada por TCR específico para WT1 foi introduzido de HLA de classe I de restrição. As barras de erro representam SDs. (E) Tetrâmero ensaio mostraram que as células efectoras utilizadas nestas experiências foram positivos para WT1 /HLA-A * 2402-tetrâmero. HIV /HLA-A * 2402 tetrâmero foi utilizado como controle negativo.

2. validação funcional de CCR2 introduzido

Em primeiro lugar, validação funcional de CCR2 introduzido foi realizado utilizando

CCR2

-transfected células Jurkat (Jurkat /CCR2) em experimentos transpo�. Jurkat /CCR2, mas não parentais células Jurkat, exibido com sucesso a actividade de migração mediada por CCL2 de uma forma dependente da dose. A Figura 2 mostra o número de células que migram em relação ao que, a uma concentração CCL2 de 12,5 ng /mL. células de Jurkat /CCR2 exibida de forma semelhante actividade de migração em relação a células LK79, LK87, LC11-18, LC65A LC99A e semeadas em poços de fundo de acordo com o nível de CCL2 produzido por cada linha de células (Fig. 1A). Finalmente esta quimiotaxia mediada por células Jurkat /CCR2 no sentido LK79 foi completamente inibida por mAb anti-CCR2 (Fig. 2B). Em seguida, usando um modelo do rato NOG xenoenxerto, tumor antígeno-independente no tráfico de tumor in vivo mediada por

CCR2

e

luciferase

+ células T CD3 normais duplamente transfectadas foi examinada usando imagem de bioluminescência . Um dia após a infusão intravenosa, estas células marcadas com luciferase-CCR2 expressando CD3

+ T começou a acumular-se no local de células LK79 inoculadas na parede abdominal anterior, enquanto

+ células T CD3 luciferase marcado com falta de CCR2 eram disperso por todo o corpo durante o período de observação (Fig. 2C). Em seguida, a validação da função do transfectadas duas vezes o normal CD8

+ células T para expressar ambos específicos para WT1 TCR e CCR2 foi realizada. Primeiro, avaliamos se a co-introdução de CCR2 prejudicou a atividade citocida específico para WT1 contra o cancro do pulmão células efetoras mediadas por duplamente transfectada CD8

+ células T. Como mostrado na Figura 3A e 3B, WT1 péptido-responsivo actividade citocida e actividade anti-cancro do pulmão contra o HLA-A * 2402

+ LK79 células (mas não tão contra HLA-A * 2402

– LK87 células como negativo controlo) mediada por estas células efectoras, sendo duplo positivo para Vβ5.1 e CCR2 (Fig. 3C), não foi comprometida em relação ao que mediada pela específico para WT1

TCR CD8 single-transfectadas

+ células T (Fig. 1C). Em seguida, a funcionalidade antitumoral combinada contra LK79 células mediado por duplamente transfectada CD8

células T +, que compreende tanto o aumento da atividade de tráfico tumor e atividade citocida WT1 específicos de, foi examinada usando uma versão modificada transpoço experimento. Estes duplamente transfectada CD8

+ T células (n = 3), mas não WT1-Si

TCR

single-transfectadas CD8

+ células T (n = 3), no poço superior eficientemente migraram para o fundo do poço, onde LK79 células tinham sido semeadas e pré-incubou-se durante 24 horas. Ambos duplo e WT1-si

TCR

células efetoras single-transfectadas carregados nas cavidades superiores foram igualmente 90-92% positivo para Vβ5.1, e 70-72% das duplas transfectantes expressa CCR2 (dados não mostrado). Consequentemente, significativamente (

p Art 0,05) mais células LK79 foram destruídos por migraram duplamente transfectada CD8

+ T células que por WT1-si

TCR

single-transfectantes, representado por níveis elevados de LDH nos sobrenadantes de cultura (Fig. 4a). No final destas experiências Transwell, análise de citometria de fluxo revelou que 3,4 vezes mais células efectoras Vβ5.1-positivos permaneceu no fundo do poço tratado com dupla-transfectadas CD8

+ células T 7,91 ± 0,51 (10 ×

4 ) para duplos transfectantes, e 2,35 ± 0,13 (10 ×

4) para transfectantes individuais, respectivamente), que suportam os resultados do ensaio de LDH. O exame microscópico confirmaram um maior grau de destruição das células LK79 no fundo do poço após o tratamento com células duplamente transfectadas efectoras, do que com as células individuais-transfectadas. Além disso, o exame microscópico confocal demonstrou células que expressam CCR2 migrados vermelho-rotulados efectoras no fundo bem somente após o tratamento com células efectoras de genes modificados duplos. Um exemplo representativo entre três experiências é mostrado na Figura 4B.

(A)

CCR2

-transduced células Jurkat, mas não as células de Jurkat parental, indicadas Transwell-CCL2 quimiotaxia dependente de dose. O número de células que migram são mostradas em relação ao que, a uma concentração CCL2 de 12,5 ng /mL. As barras de erro representam SDs. (B) Similarmente, os números de migrar

CCR2

células Jurkat -transduced para cada linha celular de cancro são mostrados. A migração de

CCR2

células Jurkat -transduced foi obviamente inibida por mAb anti-CCR2, sugerindo que o número de células que migram era dependente do nível de CCL2 produzido por cada linha de células (na Fig. 1A) e mediadas pelo CCR2 introduzido em células Jurkat. As barras de erro representam SDs. (C) à base de CCL2 antígeno-independente no tráfico de tumor in vivo para as células LK79 inoculados mediadas pela

CCR2

-transfected CD3 +

T foi demonstrado com sucesso em um modelo de xenoenxerto do mouse alvo.

+ células infusão intravenosa marcado com luciferase CD3 T que expressam CCR2 (CD3 /CCR2 /luc) (inferior), mas não aqueles que não possuem CCR2 (CD3 /luc) (superior), começou a migrar para as células LK79 imediatamente no dia 1 após infusão, e a sua migração alvo foi mantida durante todo o período de observação.

(a) usando o padrão

ensaio de libertação de 51Cr, estas células duplamente transfectadas efectoras suficientemente lisadas 1 uM WT1 carregadas com péptido, mas não descarregada, as células C1R-A24 que expressavam HLA-A * 2402. razão E /T indica rácio effector:target. barra de erro indica SDs. (B) As células duplamente transfectadas efectoras também suficientemente lisadas HLA-A * 2402

+ LK79 células, mas não células que não possuem a LK87 HLA-A * 2402 molécula utilizada como um controlo negativo. células (C) duplamente transfectadas CD8

+ T CCR2 expresso com sucesso tanto da superfície celular e Vβ5.1, o componente de linha germinal da cadeia TCR β específico para WT1. [15].