Abstract
fator ativador de plaquetas (PAF) tem sido associado com edema agudo e respostas inflamatórias. FAP actua por ligação a um receptor específico acoplado a proteína G (PAF-R,
Ptafr
). No entanto, o papel de activação crónica PAF-R em respostas inflamatórias sustentada tem sido largamente ignorado. Recentemente, demonstramos que camundongos sem o PAF-R (
Ptafr viajantes – /- ratos) apresentam aumento tumorigênese cutânea em resposta a um protocolo de carcinogênese química de dois estágios.
Ptafr
– /- ratos também apresentaram maior inflamação crônica em resposta à aplicação de éster de forbol. No presente estudo, nós demonstramos que a aplicação tópica do mimético de PAF não hidrolisável (carbamoil-PAF (CPAF)), exerce uma, dependente da dose, e a resposta do edema de curta duração potente em ratinhos WT, mas não
Ptafr Restaurant – /- ratos ou camundongos deficientes em c-
Kit
(c-
Kit
camundongos W-sh /W-sh). Usando um modelo de inflamação da orelha, a co-administração de tratamento tópico CPAF resultou numa diminuição paradoxal em ambas as alterações da espessura da orelha agudos associados com uma única aplicação de PMA, bem como a inflamação associada com aplicações sustentada PMA repetitivas crónicas. Além disso, os ratinhos tratados por via tópica com CPAF também exibiram uma redução significativa na carcinogénese química. A capacidade de CPAF para suprimir alterações inflamatórias agudas e crónicas, em resposta ao pedido (s) PMA foi PAF-R dependente, como CPAF não teve efeito sobre a inflamação basal ou induzida por PMA, em
Ptafr Network – /- ratos. Além disso, c-
Kit
parece ser necessária para os efeitos anti-inflamatórios do CPAF, como CPAF não teve nenhum efeito observável no c-
Kit
W-sh W-sh /ratos. Estes dados fornecem evidências adicionais de que a ativação PAF-R exerce efeitos imunomoduladores complexos em um modelo de inflamação crônica que é relevante para o desenvolvimento neoplásico
Citation:. Sahu RP, Rezania S, Ocana JA, DaSilva-Arnold SC, Bradish JR, Richey JD, et ai. (2014) aplicação tópica de uma aguda PAF Receptor Agonist Suprime forbol Ester-induzido e inflamação crónica e tem câncer quimiopreventivo Atividade no mouse pele. PLoS ONE 9 (11): e111608. doi: 10.1371 /journal.pone.0111608
Autor: Paul Proost, da Universidade de Leuven, Instituto Rega, Bélgica
Recebido: 11 de fevereiro de 2014; Aceito: 02 de outubro de 2014; Publicação: 06 de novembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Sahu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (www.nih.gov) (R01 HL062996, R21 ES017497 e R21 ES020965), a Administração de veteranos (www.research.va.gov/funding)(VA Mérito 510BX000853), eo Prevent Cancer Foundation (www.preventcancer.org). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
factor de activação de plaquetas (glicerofosfocolina 1-alquil-2-acetil, PAF) é uma molécula de lípido bioactivo produzido por mecanismos tanto enzimáticos e não enzimáticos [1]. a produção não-enzimática de PAF é dependente da modificação mediada por radicais livres de o ácido gordo sn-2 poliinsaturados de glycerophosphocholines a formar-se o PAF e outros glycerophosphocholines oxidadas (ox-GPCS) que exibem a capacidade para activar o receptor de PAF [1] – [5]. A actividade biológica do PAF é mediada pela ligação a um receptor de proteína G acoplado único (PAF-R) que é expresso numa grande variedade de células, incluindo queratinócitos [1], [6], [7]. Uma vez produzido, o PAF induz uma variedade de efeitos fisiológicos e patológicos que desempenham um papel na inflamação aguda, a cicatrização de feridas e angiogénese. No entanto, o PAF é talvez melhor conhecido por seus efeitos pró-inflamatórios que mediam a reação sistêmica a choque, reacções alérgicas e anafilaxia [1]. Nesta função, as acções do PAF está pensado para ser mediada pela sua capacidade para estimular a vasodilatação e a permeabilidade vascular, agregação de plaquetas, broncoconstrição, e alterações na função de leucócitos [1]. Estes efeitos sobre leucócitos incluem a capacidade do PAF para estimular a activação de mastócitos e de migração [8] – [10], mononuclear e fagocitose neutrofílica [11] -. [13], e M2 polarização de macrófagos [14]
Embora seja evidente que o PAF actua para promover efeitos inflamatórios agudos, particularmente aqueles associados com anafilaxia e choque, evidência mais recente sugere que o PAF pode desempenhar um papel mais complexo na função imune. a produção de PAF através de vias enzimáticas oxidantes e parece desempenhar um papel nas respostas de queratinócitos a agentes genotóxicos, tais como raios ultravioleta B, fumo de cigarro ou agentes quimioterapêuticos [3], [15] – [18]. Estudos sobre os mecanismos de ultravioleta B (UVB) induzida por imunossupressão sistémica demonstraram um requisito para a activação de PAF-R [3], [10], [19], [20]. Esta imunossupressão sistémica induzida por UVB é caracterizada por uma supressão específica do antigénio de células T-respostas mediadas pelo sistema imunitário adaptativo [21], [22]. Além disso, demonstramos recentemente que
Ptafr
– /- ratos exibem um aumento na carcinogénese química cutânea que está associado com um aumento correspondente éster de forbol (PMA) induzida por inflamação cutânea [7]. Estes dados sugerem que a activação de PAF-R pode também ser importante na regulação do sistema imune inato. No entanto, os mediadores celulares a jusante desta atividade imunomoduladora são desconhecidos.
O c-
Kit
gene codifica uma tirosina cinase receptor que se liga ao ligando, factor de células estaminais (SCF), e é importante em [23]. O c-
Kit
W-sh
(faixa) mutação é uma inversão de um segmento Mbp 3.1 que perturba a região promotora do c-
Kit
gene [23]. Camundongos homozigotos para o c-
Kit
W-sh
mutação apresentam uma profunda perda de mastócitos, mas também a falta de melanócitos e células intersticiais de Cajal [23], [24]. Assim, c-Kit
W-sh ratos /W-sh representam uma ferramenta comum para avaliar a função dos mastócitos. Os mastócitos são células derivadas da medula óssea do tecido residente, que, como PAF, são mediadores bem conhecidos de reacções alérgicas e anafiláticas [25]. Os mastócitos estão estrategicamente localizadas nos espaços subepiteliais e submucosas propensas a insultos ambientais e infecciosas [25]. Além disso, a capacidade do PAF para promover respostas anafiláticas é dependente da activação de mastócitos [8]. PAF é também um activador conhecido e agente quimiotático para mastócitos [9]. Em adição ao seu papel na promoção da roda e os clarões de reacção associada a reacções de hipersensibilidade do tipo I, mastócitos, também foram exibidas para suprimir a inflamação crónica, bem como as respostas imunitárias adaptativas [26] – [31]. De particular importância, os mastócitos actuar para limitar modelos murinos de hipersensibilidade de contacto e inflamação crónica induzida por UVB [32]. Além disso, o papel do PAF-R na imunossupressão induzida por UVB tem demonstrado resultar de migração PAF-R-dependentes de mastócitos para o nódulo linfático, em que eles exercem um efeito dependente -10-imunossupressora interleucina (IL) [ ,,,0],10].
Embora recentemente forneceram provas de que PAF tem efeitos anti-inflamatórios na promoção do tumor induzido por PMA crónica [7], é possível que os efeitos da perda de linha germinal da PAF-R pode ser devido a alterações embrionárias ou pós-natais compensatórias no desenvolvimento da pele [7]. Assim, uma demonstração de que o PAF-R de tratamento agonista resulta na supressão de carcinogénese induzida por PMA de DMBA /e inflamação proporcionaria mais apoio à ideia de que o PAF-R tem efeitos anti-neoplásicos e imunomoduladores importantes. Os nossos estudos actuais analisar o papel do PAF-R na inflamação induzida por PMA aumenta o nosso relatório anterior e revela um papel imunomodulador complexo para a sinalização de R-FAP. Além disso, os nossos resultados usando c-
Kit
W-sh /W-sh
ratos demonstram um papel para
células possivelmente mastro nos efeitos imunomoduladores do PAF c-Kit Comprar e.
Métodos
h3> declaração
os protocolos foram aprovados pela Comissão de Ética de Experimentação animal da Escola Indiana University of Medicine (Institutional animal Care e do Comitê Use (IACUC) .. (número de protocolo: 3841 e 10639) Cada tentativa foi feita para minimizar o sofrimento dos animais
Reagentes e produtos químicos
forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) foi adquirido a Promega, Madison, WI. 7,12-dimetilbenz (a) antraceno (DMBA) foi obtido a partir de Acros Organics, Fair Lawn, NJ. Carbamil-PAF foi obtido a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Animais
Ptafr
knockout (
Ptafr viajantes – /-) no fundo C57BL /6 foram originalmente obtidas do Dr. Satoshi Ishii (Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Faculdade de Medicina , Universidade de Tóquio), obtida como previamente descrito [33]. Idade (8-12 semanas) -matched
Ptafr
+ /+ C57BL /6 (WT) foram utilizados como controle (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). SKH-1 machos albinos sem pêlo, foram obtidos de Charles Rivers (Wilmington, MA). Ratos contendo o W-faixa (W-sh) mutação de inversão na região promotora do
c-kit
gene (
Kit
W-sh
) foram obtidos dos Laboratórios Jackson no fundo C57BL /6 (B6.Cg-
Kit
W-sh
/HNihrJaeBsmGlliJ). Os ratos foram alojados em condições específicas isentos de agentes patogénicos na Escola de Medicina da Universidade de Indiana.
medições da espessura da orelha
A orelha esquerda de cada rato foi tratado com 20 l de CPAF (0,1, 0,3, ou 1 mM em acetona). A orelha direita foi tratada com 20 ul de veículo (acetona) sozinho. Para tratamentos de PMA, a orelha esquerda foi tratado com 10 ug de PMA em 20 ul de acetona, e a orelha direita foi tratado com veículo (VEH) sozinho, 3 vezes por semana (setas) durante 16 dias. Para tratamentos de PMA e CPAF, os ratinhos foram tratados com PMA em primeiro lugar, em seguida, 20 uL de 0,3 mM CPAF (em acetona) foi adicionado imediatamente após o tratamento com PMA. A espessura da orelha foi medida nos pontos de tempo indicados após o tratamento usando uma pressão constante espessura analógico medidor (Peacock Modelo G, 0,4 N).
medições da espessura da epiderme
orelhas de rato foram tratados por 18 dias, três vezes semanalmente com veículo, CPAF (6 nmol), PMA ou PMA e CPAF foram fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE), e coradas com hematoxilina eosina (H E). A espessura da epiderme foi medida através da medição da espessura da epiderme 10 vezes em 5 x 200 consecutivos campos, começando na extremidade distai da orelha e movendo-se proximalmente para o próximo campo adjacente. A espessura da epiderme foi quantificada utilizando um retículo ocular calibrado com um micrómetro de plataforma. Todas as lâminas eram cegos antes da medição.
estudos Tumorigênese
Por duas fases estudos de carcinogênese química, a pele dorsal de SKH-1 camundongos sem pêlo foram tratados com uma vez com DMBA, seguidos por tratamentos repetidos com o PMA como previamente descrito [7]. Para a contagem do tumor, tumores apenas duráveis 1 mm de maior diâmetro foram contados. Após 25 semanas de tratamento com PMA, os ratinhos foram sacrificados e o tamanho do tumor (tamanho de maior dimensão) foi medida para cada tumor. secções tumorais FFPE de WT e
Ptafr viajantes – /- ratos foram coradas com H E e do tipo de tumor (papiloma e microinvasivo SCC (MISCC)) foi avaliada em forma cega por um dermatopatologistas placa-certificado, como anteriormente descrito [34]. Para a atividade MPO, áreas livres de tumor de pele tratada foram removidos e os níveis de atividade de MPO foram avaliadas como descrito anteriormente [35].
inflamação induzida por PMA na epiderme dorsal
A pele volta da fêmea WT ou
Ptafr
– /- ratos foi rapada, sob anestesia e foi então tratada com PMA ou veículo três vezes por semana durante 18 dias, como descrito acima. Imediatamente após cada aplicação de PMA, os ratinhos foram tratados com o veículo ou 100 uL de 0,3 mM CPAF (em acetona). No dia 18, os ratos foram sacrificados e a epiderme dorsal tratados foi excisada para medições de espessura da pele, como descrito anteriormente [35].
mastócitos contando
Os mastócitos foram coradas com azul de toluidina em secções desparafinadas FFPE como descrito [36]. Quatro imagens 200x por biópsia foram capturados sequencialmente ao longo do comprimento da seção usando um 80i Nikon Eclipse. software Nikon Elements Pesquisa Básica Análise de Imagem (v. 4.13) foi utilizado para contar os mastócitos e medir a área de dérmica de interesse. A área e celulares contagens totais foram, então, em média [(mastócitos /mm
2) x10
-5]. Dado que a contagem de células mastro diferem em diferentes locais do corpo em ratos, a contagem de células mastro foram realizados em ambos os ouvidos e dorsal (costas) epiderme.
A análise estatística
A significância estatística foi avaliada por Prism 5.0 software (Graph Pad software, San Diego CA) e de significância foi definido como
p
. 0,05
resultados
CPAF é topicamente activo e resulta em uma dose aumento transiente dependente da espessura da orelha, que é dependente de mastócitos
num estudo anterior [7] e na figura 1A, mostra-se que uma única aplicação tópica de doses crescentes de agonista de PAF-R não-hidrolizável, CPAF, resulta num aumento dependente da dose na espessura da orelha duas horas após a aplicação. Na Fig 1B, um estudo de curso de tempo demonstra que as mudanças da espessura da orelha induzido por CPAF ocorrer rapidamente, com aumentos significativos na espessura da orelha observado por 1 hora após a aplicação e a espessura da orelha de pico foi observada em 2 horas. Importante, após uma única aplicação de CPAF as alterações na espessura da orelha foram transitórios e diminuiu para perto da linha de base por 8 horas após a aplicação. A natureza rápida e transiente da resposta sugere fortemente que as alterações na permeabilidade vascular que conduzem à formação de edema são em grande parte responsáveis pelas alterações na espessura da orelha. Isto é consistente com a capacidade conhecida de PAF para induzir vasodilatação e permeabilidade vascular [37]. Para descartar PAF-R efeitos independentes [38], os ratos com perda da linha germinativa do gene
Ptafr
(
Ptafr viajantes – /- ratos) foram também tratados com CPAF. Em todas as doses estudadas, a aplicação tópica CPAF não conseguiram induzir uma reacção inflamatória em
Ptafr
– /- murganhos (Figuras 1A B), verificar a especificidade do efeito farmacológico
. 1A
.
Topical CPAF dose-dependente induz respostas inflamatórias rápidas medidas pela medida da espessura da orelha
Uma orelha do WT e
Ptafr
. (- /-) Foram tratados com uma das três doses de CPAF (20 ul de uma solução de 0,1, 0,3, e 1,0 mm para uma dose de tratamento total de 2, 6, ou 20 nmol CPAF por orelha). A orelha contralateral foi tratado com acetona por si só (VEH). A espessura da orelha foi medida antes do tratamento e 2 horas após o tratamento. Depois os valores de espessura da orelha pré-tratamento foram subtraídos, a média e SEM foram representados graficamente (n = 4 para 20 nmol e n = 8 para 2 6 nmol CPAF VEH tratada orelhas de rato).
1B
.
tratamento CPAF tópica induz um aumento rápido, mas transiente na inflamação tal como medido por alterações da espessura da orelha
Uma orelha de tipo selvagem (WT) e
Ptafr
. (- /-) Ratos foi tratado com 20 ul de CPAF (20 nmoles de uma solução 0,1 mM em acetona) e 20 ul de acetona (VEH) foi aplicada ao ouvido contralateral. A espessura da orelha foi medida imediatamente antes da aplicação do reagente e a 1, 2, 4, e 8 horas após a aplicação. Os resultados representam a média e SEM (n = 4 ratos) depois subtraindo a espessura da orelha de pré-tratamento. CPAF induziu um aumento significativo na espessura da orelha em ratinhos WT em relação ao WT + VEH tratada orelhas. *,
p Art 0,05; **,
p Art 0,01; ***;
p Art 0,001; 2 caudas
t
-teste.
Finalmente, a capacidade de CPAF para induzir reações edema rápidos tem sido associada ao mastro de ativação celular [8], [9]. Nós, portanto, determinar se a capacidade de CPAF para induzir uma reacção edema cedo às 2 horas pode ser bloqueada em ratos sem mastócitos (c-Kit
camundongos W-sh /W-sh). Na Figura 2 verifica-se que os mastócitos são, de facto necessário para o aumento precoce na espessura das orelhas mediada pela aplicação CPAF.
WT e c-Kit
W-sh ratos /W-sh foram tratados com veículo ( VEH) sozinho em uma orelha, e 20 ml de CPAF mM 0,3 (6 nmol) na orelha contralateral. A espessura da orelha foi medida antes e 2 horas após a aplicação do reagente. Após a subtração da espessura da orelha no tempo 0, a média e SEM foram plotados (n = 5 para ratinhos WT, n = 4 para Kit
camundongos W-sh /W-sh). *,
p Art 0,05; 2 caudas
t
-teste.
Topical CPAF protege contra a carcinogênese química cutânea
Os estudos na Fig 1 demonstram que CPAF exibe actividade farmacológica dependente da dose específica após a aplicação tópica. A utilização de uma abordagem de entrega tópica evita também as toxicidades potenciais associadas com tratamento com o agonista de PAF-R sistémica [37]. Além disso, o PAF-R é propenso ao fenómeno de ligando induzida por sub-regulação e dessensibilização [1], [39]; esta função reguladora é característico dos receptores acoplados à proteína G e pode levar a uma perda paradoxal da activação do receptor pelo ligando de ligação subsequente [1], [40]. Assim, dado que os estudos de carcinogénese iria exigir a aplicação repetitiva de longo prazo de CPAF, utilizou-se a concentração de 0,3 mM de CPAF que induziu um aumento intermediário, mas significativo nas medições de espessura das orelhas (Figura 1A). Para estes estudos, CPAF foi aplicado imediatamente após a aplicação DMBA ou PMA para a duração do estudo
De acordo com nosso estudo anterior que demonstrou que
Ptafr Restaurant -. /- Ratos apresentam aumento DMBA /PMA formação do tumor induzido por, na Figura 3A mostra-se que o tratamento tópico de CPAF resultou numa redução significativa da carga tumoral induzido por PMA de DMBA /. tratamento CPAF também demonstrou um efeito protector modesto, mas significativo sobre a incidência de tumores (Fig 3B). Além disso, enquanto
Ptafr
– /- ratos exibiram um aumento significativo na frequência de tumores maiores [7], os ratinhos tratados com CPAF tópica exibiram um aumento significativo em tamanhos menores do tumor (Fig 3C). Além disso, anteriormente demonstrado que
Ptafr viajantes – /- ratos apresentam um aumento da SCC formação em relação aos animais WT [7]. No entanto, no presente estudo, não foram observados CCEs francas e ratinhos tratados por via tópica não exibiram uma mudança significativa na proporção de grau 1-3 papilomas ou CCEs microinvasivos (Figura S1 S1 no ficheiro). Finalmente, as áreas livres de tumor da pele tratada com CPAF exibiram uma marcada redução na inflamação induzida por PMA de DMBA /, tal como avaliado usando mieloperoxidase (MPO actividade), um marcador de infiltrados de células granulocíticas (Fig 3D) [41]. Isto é consistente com nossos resultados anteriores em
– /-
camundongos, que apresentaram um aumento da atividade da MPO seguinte crônicas, repetitivos tratamentos PMA [7]
3A.. O tratamento tópico com CPAF suprime a multiplicidade de tumores induzida por PMA DMBA /.
SKH-1 ratos foram tratados uma vez com DMBA +/- CPAF, em seguida, com PMA ou PMA + CPAF durante 25 semanas. tumores duráveis foram contados em uma base semanal. a multiplicidade de tumores (número médio de tumores por rato foi representada graficamente em cada semana Os resultados representam a média e SEM para n = 19-20 ratos /grupo
p Art .. 0,05 por semanas 9-12,14-25;
p Art 0,01 para a semana 13;. Mann-Whitney U
3B tópica CPAF atrasou a incidência de tumores em ratinhos tratados com DMBA /PMA
a percentagem de ratos restantes tumor livre através da Internet.. 25 semanas de estudo tumorigénese química foram representadas graficamente utilizando uma curva de sobrevivência. o tratamento com CPAF resultou numa alteração significativa na incidência do tumor, com um tempo médio até ocorrência primeiro tumor de 8 semanas para DMBA /PMA tratadas e as 9 semanas de DMBA /PMA + CPAF ratinhos tratados *,
p
. 0,05;.. Log-rank (Mantel-Cox) Teste
3C
Topical CPAF tratamento resulta em um menor número de tumores grandes ( ≥3 mm de diâmetro maior) após 25 semanas de tratamento.
distribuição do tamanho do tumor foi plotados como o número de tumores em cada distribuição de tamanhos para cada grupo de tratamento. o exame histopatológico não mostraram nenhuma diferença significativa nas taxas de formação de papiloma e SCC entre os grupos de tratamento (não mostrados). ***,
teste exato p = 0,0001
de Fisher.
3D
.
atividade da MPO induzida por PMA DMBA /é suprimida por CPAF.
Após os ratos foram sacrificados seguinte 25 semanas de tratamento DMBA /PMA +/- CPAF, áreas livres de tumor de pele foram excisadas e atividade da MPO foi avaliada em tecido lisados. Após normalização para a proteína total, actividade de MPO foi representada graficamente como a média e SEM (n = 5-9 ratinhos por grupo). **,
p Art 0,05; ***,
p Art 0,001; 2 caudas
t
-teste.
tratamento CPAF tópica suprime a inflamação induzida por aplicações repetidas de o promotor de tumor PMA
No nosso relatório anterior [7], mostrámos que uma primeira aplicação de PMA induziu um aumento significativo da espessura da orelha em ratinhos WT 2 dias após a aplicação. Uma segunda aplicação de PMA resultaram num aumento adicional na espessura da orelha que parcialmente resolvido. Depois disso, as aplicações subsequentes PMA não conseguiu obter aumentos adicionais na espessura da orelha. Em contraste, foi observado um aumento significativo e persistente na espessura das orelhas durante os 18 dias de tratamentos de PMA (fase inflamatória crónica prolongada). Tal como no nosso estudo anterior, a perda da PAF-R resultou num embotamento da espessura da orelha pico observado após a segunda aplicação de PMA, mas um nível mais elevado de inflamação crónica prolongada depois continuou três vezes aplicações semanais PMA (Figura S2 no ficheiro S1 e [ ,,,0],7]). Estudámos, portanto, se a administração tópica CPAF teria o efeito oposto e suprimir a inflamação crônica sustentada induzida pelo tratamento PMA. Na figura 4A mostra-se que a aplicação de CPAF tópica imediatamente após cada aplicação de resultados PMA, em uma redução significativa tanto na resposta inflamatória pico observado no dia 4, bem como uma redução da resposta inflamatória sustentada que foi observado ao longo do período de aplicação de PMA (18 dias). Curiosamente, nestes pontos de tempo posteriores, CPAF não teve qualquer efeito na medida da espessura da orelha em ratinhos WT não tratadas com PMA, sugerindo que tópica CPAF é ineficaz na indução de uma resposta inflamatória sustentada significativa na dose testada (0,3 mM). Finalmente, ao lado demonstrado que o efeito da CPAF era totalmente dependente da PAF-R, como CPAF e aplicações Veh mostrou medições da espessura da orelha quase idênticas em todos os pontos de tempo após a aplicação PMA para
Ptafr – /-
ratos ( Fig 4B). Enquanto CPAF bloqueou significativamente a espessura da orelha induzida por PMA em ratinhos WT (Fig 4A), esta resposta foi completamente perdido em
Ptafr viajantes – /- ratos tratados com PMA (Fig 4B). Finalmente, na Figura 4C, que mostram que a capacidade de CPAF para suprimir alterações da espessura da pele induzido por PMA não era dependente do local anatómico. CPAF suprimiu significativamente os aumentos induzidos pelo PMA em dorsal volta espessura da pele após 18 dias de tratamento três vezes por semana.
4A. tratamento CPAF tópica suprime mudanças induzidas por PMA em espessura da orelha em ratinhos WT.
CPAF (6 nmoles) sozinho ou PMA +/- CPAF foram aplicados em orelhas de rato WT três vezes por semana durante 18 dias. as medições da espessura da pele foram tomadas no tempo 0 e imediatamente antes de cada aplicação de reagente. Após subtracção da espessura da orelha tempo 0, alterações da espessura da orelha foram representados graficamente como a média e SEM (n = 4-5 ratinhos por grupo). PMA em relação ao PMA + CPAF (
a), PMA + CPAF relação ao CPAF (
b); *,
p Art 0,05; **,
p Art 0,01; ***,
p Art 0,001; 2 caudas
t
-teste.
4B. tratamento CPAF tópica é ineficaz em alterar alterações de espessura da orelha induzida por PMA em Ptafr – /- ratos. Ptafr viajantes – /- ratos foram tratados e avaliados como em 4A acima. Para efeitos de comparação, os dados para o tratamento com PMA + CPAF em ratinhos WT está incluído. (Média e SEM; N = 4-5 ratinhos por grupo). ratinhos WT tratados com PMA + CPAF exibem uma diminuição significativa no ouvido medições de espessura em relação ao
Ptafr viajantes – /- ratos tratados com PMA + CPAF (*,
p Art 0,05; **,
p Art 0,01; ***,
p Art 0,001; 2 caudas
t
-teste).
4C. tratamento CPAF tópica suprime induzido por PMA de pele de espessura aumenta em epiderme dorsais seguintes 18 dias de tratamento. Os
epiderme dorsais dos ratinhos SKH-1 foi tratado com veículo três vezes por semana, CPAF, PMA, ou PMA + CPAF. Doses de PMA e foram CPAF o mesmo que o utilizado para os estudos de tumorigénese na FIG 3. ***,
P
0,05 em relação à pele tratadas com PMA; 2 caudas
t
-test (n = 3 por grupo).
A seguir, determinou as alterações histopatológicas na pele da orelha que resultam de múltiplas aplicações PMA com ou sem tratamentos CPAF. Vários aplicativos PMA a pele do rato são conhecidas para induzir a hiperplasia epidérmica e leucócitos infiltração [42], [43]. Na figura 5A-I, que mostram que múltiplas aplicações PMA para WT orelhas de rato resulta em um claro aumento na espessura da orelha acompanhada pela expansão dérmica, infiltração de leucócitos e hiperplasia epidérmica. Por outro lado, o co-tratamento de ratinhos com WT orelhas CPAF resultou numa redução de leucócitos induzido por PMA infiltra enquanto
Ptafr
– /- ratos exibiram um aumento acentuado da espessura da orelha, a expansão dérmica, infiltrados de células inflamatórias, e epidérmica hiperplasia (Fig 5A-H). Em relação a ratinhos WT,
Ptafr
– /- ratos exibiram um aumento acentuado na infiltrados granulocítica seguintes tratamentos crónicos com PMA (Figura 5 e Figura S3 em S1 do ficheiro). Além disso, o tratamento CPAF suprimiu os infiltrados inflamatórios induzidos PMA observados no WT, mas não
Ptafr
– /- ratos. Estes dados estão de acordo com a nossa demonstração estudo anterior que
Ptafr viajantes – /- ratos apresentam um aumento acentuado na atividade da MPO após o tratamento PMA [7], bem como os nossos dados na Fig 3D que mostra que CPAF suprime tratamento actividade de MPO em DMBA /PMA ratinhos tratados. Uma vez que os neutrófilos são mostrados a desempenhar um papel importante na fotocarcinogénese da pele do rato [35], esta redução na infiltração granulocítica poderia desempenhar um papel importante nos efeitos antitumorais observados do tratamento tópico CPAF na carcinogénese química (Fig 3A B). Dado que o grau de inflamação crónica é normalmente associada com hiperplasia epidérmica, é pouco surpreendente que, embora o tratamento CPAF suprimida PMA induzida por inflamação granulocítica em ratinhos WT, tratamento CPAF não alterou hiperplasia epidérmica induzida por PMA em qualquer WT ou
Ptafr – /- ratos
(Fig 5I)
5A Restaurant -.
H. infiltrados inflamatórios estão aumentados em Ptafr – /- ratos tratados com PMA, enquanto CPAF suprime células inflamatórias se infiltra na PMA tratados ratinhos WT
Depois de tratar WT e
Ptafr Restaurant -. /- orelhas de rato por 18 dias com VEH , CPAF, PMA, ou PMA + CPAF como descrito na Fig 4, os ratinhos foram sacrificados e as orelhas excisado para fixação em formalina, embebidos em parafina e hematoxilina eosina (H E) de coloração. Microfotografias tiradas com ampliação de 400x são mostrados.
5I. espessura epidérmica induzida por PMA é aumentada em Ptafr – /- ratos, enquanto CPAF tem nenhum efeito sobre a espessura epidérmica induzida por PMA em qualquer WT ou Ptafr – /-.
ratinhos espessura epidérmica foi medida em WT e
Ptafr
– /- ratos tratados durante 18 dias com VEH, CPAF, PMA, e PMA + CPAF como descrito na Figura 4A B. A espessura da epiderme em milímetros, é expressa em a média e SEM para 3-4 orelhas por grupo experimental. Significativamente diferente do controlo WT VEH (
a), significativamente diferente do
Ptafr viajantes – /- Controle VEH (
b). *,
p Art 0,05; **,
p Art 0,01; ***,
p Art 0,001; 2 caudas
t
-teste.
PAF exerce complexos efeitos sobre a resposta inflamatória inicial para aplicação PMA
O promotor pró-inflamatória tumor PMA é conhecido por induzir uma reacção edema rápida em orelhas de rato [42], [43]. Isto é seguido por um aumento gradual na infiltração de leucócitos tal como medido pela actividade N-acetilglucosaminidase (NAF) que atinge o pico a cerca de 24 horas [42], [43] MPO e /ou. Dado que o PAF é um mediador lipídico vasoativas potente que promove reações edema rápidas [37], o próximo analisou como CPAF afetaria alterações inflamatórias início após a primeira aplicação PMA no WT e
Ptafr
– /- ratos. Como pode ser visto na Fig 6A, o tratamento com PMA induz um rápido aumento da espessura da orelha, que foi observado pela primeira vez duas horas após a aplicação. alterações de espessura da orelha atingiu um pico de cerca de 24 a 48 horas. Em contraste,
Ptafr
– /- ratos exibiram uma redução nas mudanças iniciais espessura da orelha observou a 2 8 horas, sugerindo que as respostas do edema induzido por PMA foram PAF-dependente. Foi portanto surpreendente verificar que os ratos WT tratados com CPAF imediatamente após a aplicação de PMA também exibiu uma perda de aproximadamente 50% da espessura da orelha alterações precoce induzido por PMA observadas em 2 horas (Fig 6B). Isto sugere um papel complexo para a PAF-R na regulação mudanças edema vasoativas iniciais em resposta a PMA
Para todos os estudos nas figuras 6, WT e
Ptafr.
– /- Ratos foram tratados com VEH, PMA, CPAF (6 nmol) ou PMA + CPAF como descrito na Figura 4A B. medições de espessura das orelhas foram feitas imediatamente antes da aplicação do reagente, bem como nos pontos de tempo indicado até 48 horas.
6A. Ptafr – /- ratos apresentam uma redução aumenta a espessura da orelha precoces e tardios após uma única aplicação de PMA parcelas espessura
orelha por WT e
Ptafr Restaurant -. /- Ratinhos tratados com e sem PMA são mostrados. mudanças estatisticamente significativas estão marcadas para animais WT tratados com PMA em relação ao
Ptafr
– /- ratos tratados com PMA. Os resultados representam a média e SEM de espessura da orelha depois subtraindo a espessura da orelha no tempo 0 (n = 4-12 ratinhos por grupo). *,
p Art 0,05; **,
p Art 0,01;
t
-teste.
6B. A co-administração de blocos tópicas CPAF aumentos na espessura da orelha induzida por PMA em todos os pontos de tempo (2-48 horas)
PMA induzida por alterações da espessura da orelha foi avaliado em WT ou
Ptafr
-. /- Ratinhos tratados com PMA ou PMA + CPAF. Depois de se subtrair a espessura da orelha nos tempos 0, a capacidade de CPAF para suprimir alterações da espessura da orelha induzido por PMA foi calculada como uma percentagem de inibição do aumento de espessura da orelha induzido por PMA. CPAF tratamento resultou numa inibição significativa de alterações da espessura da orelha induzido por PMA em todos os pontos de tempo (P 0,01-0,05;% de inibição significativamente diferente de qualquer inibição, Wilcoxon Signed Rank Test). tratamento CPAF não teve efeito significativo sobre a orelha alterações de espessura induzidas por PMA em
Ptafr viajantes – /- ratos (Uma análise da amostra, Wilcoxon Signed Rank Test). A percentagem de inibição de alterações induzidas por PMA espessura da orelha por CPAF em ratinhos WT foi também significativamente diferente do que a observada em
Ptafr
– /- ratos (*,
P
0,05; ** ,
p Art 0,01;
t
-teste)
Embora os dados acima sugere um papel complexo para a PAF-R na regulação PMA- inicial.