Abstract
Vários estudos destacam o papel dos marcadores inflamatórios na trombose, bem como no câncer. No entanto, o seu papel combinados em trombose associada ao cancro venosa profunda (TVP) e os mecanismos moleculares envolvidos na sua fisiopatologia, necessita ser mais investigado. No presente estudo, a proteína C-reactiva, a interleucina-6 (IL-6), Factor de Necrose Tumoral-α (TNF-α), interleucina-1 (IL-1β), metaloproteases-9 da matriz (MMP-9), vascular factor de crescimento endotelial (VEGF), factor de tecido (TF), e o fibrinogénio solúvel de selectina P, foram analisados no plasma e em amostras de monócitos a partir de 385 doentes com cancro, dos quais 64 foram concomitantemente afectadas por TVP (+). Todos estes marcadores eram mais elevados em doentes com cancro TVP + do que naqueles DVT-. Assim, aumento significativo da actividade NF-kB foi observada em pacientes com câncer TVP + do que DVT-. Observou-se correlação significativa entre os dados obtidos em amostras de plasma e de monócitos. inibição de NF-kB foi associada a níveis reduzidos de todas as moléculas em ambos TVP cancro + e DVT-. Para demonstrar ainda mais o envolvimento da activação do NF-kB por as moléculas acima mencionadas, que tratada de monócitos derivada de dadores saudáveis com um conjunto de soros de doentes de cancro com e sem TVP. Esse conjunto de experimentos sugerem ainda mais o papel significativo desempenhado por algumas moléculas, regulados por NF-kB, e detectado em pacientes com câncer com TVP. Os nossos dados suportam a noção de que o NF-kB pode ser considerada como um alvo terapêutico para doentes com cancro, especialmente aqueles complicada por TVP. O tratamento com inibidores de NF-kB pode representar uma possível estratégia para prevenir ou reduzir o risco de TVP em pacientes com câncer
Citation:. Malaponte G, Signorelli SS, Bevelacqua V, Polesel J, Taborelli M, Guarneri C, et ai. (2015) níveis aumentados de marcadores NF-kB-Dependentes em Câncer-Associated Trombose Venosa Profunda. PLoS ONE 10 (7): e0132496. doi: 10.1371 /journal.pone.0132496
editor: Yves St-Pierre, INRS, Canadá |
Recebido: 14 Março, 2015; Aceito: 15 de junho de 2015; Publicação: 20 de julho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Malaponte et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
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financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O risco relativo de desenvolver trombose venosa profunda (TVP) é de aproximadamente sete vezes maior em pacientes com câncer [1,2] sugerindo uma correlação bidirecional entre trombose e inflamação no cancro. A quimioterapia é um dos factores de risco mais importantes para o aumento do risco de trombose venosa profunda [3,4]. Trombose e câncer estão ligados por inúmeros mecanismos fisiopatológicos que são geralmente relacionados com a resposta do hospedeiro ao câncer. Estes mecanismos incluem a activação dos sistemas de coagulação e fibrinolítico, reacção de fase aguda, inflamação, produção de citocinas e [5]. A activação sistémica de coagulação que ocorre em malignidade é bem conhecido e foi descrito sob o nome de síndrome de Trousseau [6,7]. inflamação sistêmica é um estímulo pró-trombótico potente levando a um aumento da regulação de fatores pró-coagulantes, baixo regulação dos anticoagulantes e inibição da atividade fibrinolítica [8,9]. A inflamação crônica é muitas vezes associado com aumento do risco de câncer [10,11]. Rudolf Virchow demonstrou a presença de leucócitos nos tumores e sugeriu que os tumores surgem em locais de inflamação crónica e que os mediadores inflamatórios, por reforçar a proliferação celular, pode servir como promotores de tumores [12]. As células inflamatórias, citocinas em tumores malignos afectam o microambiente do estroma, sugerindo que a inflamação e cancro podem ser interligados através do processo angiogénico [13-15]. Durante a inflamação, angiogénese coincide frequentemente com a infiltração de células inflamatórias tais como neutrófilos, monócitos /macrófagos, que secretam citoquinas e factores de crescimento [13,16,17]. Mostrou-se que vários mediadores têm um papel crítico na inflamação, cancro e trombose, tais como proteína C-reactiva, a interleucina-6 (IL-6) e factor de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β ) (marcadores de inflamação), metaloproteases-9 da matriz (MMP-9), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) (angiogénese reflectindo), factor de tecido (TF) e fibrinogénio (marcadores da coagulação) e P-selectina solúvel (marcação de activação de plaquetas) . As citocinas inflamatórias-regulam vários factores angiogénicos, tais como VEGF e MMP-9, em células endoteliais vasculares, células de cancro, e monócitos /macrófagos [18-35]. Monócitos participar nos processos patológicos da inflamação e trombose através da sua capacidade de sintetizar TF e expressando P-selectina após estimulação [36-38]. factor tecidular (TF), o que é o iniciador celular primário da coagulação do sangue, contribui para os processos patológicos relacionados com o tumor, tais como o estado de hipercoagulabilidade, crescimento tumoral, angiogénese, metástase e [39-40]. Curiosamente, todas estas moléculas são regulados por NF-kB [41,42]. Este é um factor de transcrição indutível controlada pelas cascatas de sinal. NF-kB controla um certo número de genes envolvidos nas respostas inflamatórias, a progressão do ciclo celular, inibição da apoptose e da adesão celular, promovendo assim a angiogénese tumoral, carcinogénese e progressão do cancro. Prevenção e tratamento da TVP em pacientes com câncer pode afetar significativamente o tratamento do paciente, prognóstico e qualidade de vida. Por conseguinte, existe uma necessidade de identificar novos marcadores bio-molecular que podem reconhecer doentes com cancro com elevado risco de trombose venosa profunda. Apesar de vários estudos investigaram o papel de diferentes bio-marcadores e /ou citocinas no cancro e /ou trombose, há estudos anteriores analisaram completamente estes marcadores NF-kB regulamentados, que por sua vez se auto-regular NF-kB em pacientes com câncer, com e sem trombose. A identificação destes marcadores podem reconhecer NF-kB como um alvo atractivo para a intervenção terapêutica.
No presente estudo uma fracção de marcadores de NF-kB-regulados foram medidos no sangue periférico de pacientes com cancro com e sem TVP . Além disso, os efeitos de dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHMEQ), um inibidor de NF-kB [43,44], foram avaliados para demonstrar o papel directo dos marcadores de NF-kB-regulados no desenvolvimento de trombose entre os pacientes com cancro. Além disso, a identificação de marcadores biomoleculares de TVP em pacientes com câncer pode apoiar a importância da tromboprofilaxia farmacológica.
Métodos
População do estudo
amostras de sangue periférico de três grupos de indivíduos foram recolhidos nos últimos 10 anos no Departamento de Bio-Medical Sciences, Universidade de Catania, Catania, Itália. Estes grupos foram: 64 pacientes com câncer e concomitante TVP (trombose venosa profunda +) (idade média de 64 ± 10 anos); 321 pacientes com câncer sem história de trombose venosa profunda (DVT-) (idade média de 62 ± 9 anos); 100 controles saudáveis (com idade média de 61 ± 12 anos), pareados por sexo e idade (Tabela 1). Os pacientes foram diagnosticados como afectada pela TVP com base no nenhuma compressão de uma veia profunda dos membros inferiores por sonda Doppler e /ou a pela presença da ecogenicidade para um profundo veias dos membros inferiores. pacientes TVP foram recrutados no momento da ocorrência de TVP. Amostras de sangue periférico destes pacientes foram obtidas antes da assunção de qualquer droga antitrombótica específica. Informações detalhadas sobre o estudo foram dados aos pacientes. Todos os pacientes deram consentimento informado por escrito antes da inscrição. Nosso estudo foi aprovado pela Universidade de Catania comitê de ética. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os princípios enunciados na Declaração de Helsinki. Todos os indivíduos neste manuscrito ter dado consentimento informado por escrito (conforme descrito no formulário de consentimento PLOS) para participar neste estudo. Foram excluídos os pacientes tratados com fármacos anti-inflamatórios, estatinas e compostos anti-cancerígenos, tais como, bevacizubam, talidomida, lenalidomida e /ou terapia de radiação. Outros critérios de exclusão foram: IMC 35 kg /m
2, depressão sistêmica grave, diabetes, dislipidemias, hipertensão, doenças inflamatórias crônicas, insuficiência cardíaca em estágio diferente, insuficiência renal leve ou grave (creatinina ≥ 2,0 mg /dl), pancitopenia e intervenção cirúrgica mais recente ( ≤ 3 meses). Amostras de sangue venoso foram colhidas, pelo menos, após 3 meses do último tratamento antineoplásico tanto para pacientes com câncer TVP + e DVT-
Abreviaturas:. TVP, trombose venosa profunda; IMC, índice de massa corporal.
procedimentos de recolha de sangue e de laboratório
O sangue foi coletado de cada paciente e controles saudáveis desenhados para tubos de coleta de sangue isentos de pirogénios com e sem aditivos. plasma pobre em plaquetas citrado foi feita utilizando dois passos de centrifugação: 5 min a 4000 r.p.m. e 10 min a 11000 r.p.m. Múltiplas alíquotas de soro e de plasma foram armazenadas a -80 ° C. As amostras de sangue foram utilizadas para as seguintes análises: 1) PRC, fibrinogénio, IL-6, TNF-α, IL-1β, MMP-9, VEGF, antigénio TF e os níveis plasmáticos de P-selectina; 2) monócitos isolamento. os níveis de fibrinogênio plasma e de alta sensibilidade proteína C-reativa foram medidos com técnicas padrão usadas no Laboratório Central do Hospital Universitário de Catania. IL-6, TNF-α, IL-1β, MMP-9, VEGF e SP-selectina foram medidos por ensaios de imunoabsorção ligados a enzima (ELISA, R D Systems Europe, Abingdon, Oxfordshire, Reino Unido). nível de antigénio TF no plasma foi medido por ELISA, utilizando um kit disponível comercialmente, IMUBIND (American Diagnostica Inc., Stamford, CT). Todos os procedimentos de ensaio foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante. amostras de controlo foram analisadas simultaneamente em cada placa para cada marcador.
Reagentes
Ficoll Histopaque 1077, RPMI 1640, solução de penicilina-estreptomicina, L-glutamina, soro fetal bovin (FBS), fosfato solução salina -buffered (PBS), Percoll, lipopolissacarídeo (LPS) a partir de
Escherichia coli serotipo 0128
: B12, MTT (brometo de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5- ; azul de tiazolilo) e dimetilsulfóxido (DMSO) foram adquiridos da Sigma Chemical (St. Louis, MO, EUA). meio de Iscove e Polimixina B da Gibco, Life Technologies Inc (Milão, Itália).
DHMEQ (dehydroxymethylepoxyquinomicin), sintetizada como anteriormente descrito, [43] foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma concentração de 10 ug /ml e armazenadas a 20 ° C. Esta solução de reserva foi diluída em meio de cultura a uma concentração final de 0,1%. Agentes. DHMEQ foi gentilmente cedido pelo Dr. Kazuo Umezawa, Departamento de Química Aplicada, Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Keio, Yokohama, Japão.
Isolamento de monócitos humanos
células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isolados a partir de sangue citrado de pacientes do cancro TVP + e DVT- e controlos saudáveis por Ficoll-Paque. Para o isolamento de monócitos, as PBMC foram colocados por 2 horas em placa de cultura, e as células não aderentes foram removidas com três mudanças de PBS quente. monócitos puras foram então seleccionadas positivamente por microesferas anti-CD14 magnéticos revestidos por (mini MACS coluna de separação; Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante. pureza de monócitos era 98%, conforme avaliado por citometria de fluxo (dados não apresentados). As células foram reunidas e ressuspensas numa concentração final de 1×10
6 células /ml num meio de congelação consistindo de 30% de plasma autólogo, com citrato de 60% e de Iscove 10% de DMSO. Em seguida, as células foram congelados em aliquotas de 1 ml em criotubos estéreis (Greiner, Alemanha), utilizando um padrão controlado procedimento de congelação e então armazenados em azoto líquido.
Tratamento e cultura de monócitos humanos
Após descongelar à temperatura ambiente, os monócitos criopreservados tinha uma viabilidade de 85%, como mostrado por exclusão de azul de tripano. Os monócitos humanos foram analisados quanto à activação de NF-kB, para a produção de citocinas e para ensaio de actividade de TF (ver texto seguinte). Resumidamente, os monócitos (5 x10
5 /ml) foram colhidas, lavadas, e semeadas em poços em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, L-glutamina inactivado pelo calor (2 mM), penicilina (100 UI /mL), estreptomicina (100 ug /mL), e pré-tratado com DHMEQ (10 ug /ml) durante 2 horas e, após o que foram incubadas durante 24 horas. Em seguida, os sobrenadantes de cultura de células foram recolhidos para quantificação do nível de proteína de citocina por um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). a contaminação com endotoxinas das culturas celulares foi rotineiramente excluídos com o ensaio de amebócitos de Limulus lisado cromogénica (Sigma). Além disso, em todas as culturas de células 10 ug /ml de sulfato de polimixina B foi adicionado para neutralizar qualquer potencial de contaminação por LPS.
ELISA para a subunidade p65 de NF-kB activo
Para a medição da activação de NF-kB subunidade p65 , extractos nucleares foram preparados a partir de 5×10
5 monócitos pré-tratados e não com DHMEQ (10 ug /ml) durante 2 h e, após o que estimuladas com 100 ng de LPS /ml durante o período de tempo desejado, utilizando um Kit de extracto nuclear ( Motivo activo, Rixensart, Bélgica), de acordo com o protocolo do fabricante. Os níveis de concentrações de p65 nucleares foram determinados por um ensaio ELISA sensível (trans-AM, motivo Activo, Rixensart, Bélgica).
A detecção da actividade de TF em monócitos através de um ensaio cromogénico
em lisados celulares a actividade do TF foi medida pelo kit de actichrome1 actividade TF (American Diagnostic, Pfungstadt, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Em breve. As amostras foram coincubated com fator VII e Spectrozyme fVIIa. TF-FVIIa cliva complexos Spectrozyme fVIIa como um substrato cromogénico específico altamente libertando um paranitroanilin-cromóforo com uma alteração específica de absorção a 405 nm. Os resultados são expressos em picomoles por litro (PM) de atividade peptidil de TF lipidada clivagem do FVIIa spectrozyme.
activação dependente de soro de citocinas e NF-kB em monócitos
Os monócitos (5×10
5) a partir de 25 dadores saudáveis foram cultivadas durante 20 horas em meio (RPMI 1640) suplementado com soro a 40% a partir de 64 doentes com cancro da TVP + e 257 DVT- com os mais elevados níveis de citocinas no plasma (≥ 75
percentil) ou 40% de soro de 100 doadores saudáveis com os valores mais baixos de citocinas (≤ 25
percentil). Para o processamento do soro, 80μl de soro de cada paciente cancro TVP + e DVT- e a partir de cada dador saudável foi adicionado ao meio de cultura de monócitos imediatamente após a descongelação. As células foram tratadas com DHMEQ (10 ug /mL) durante 2 h, e depois do qual estimuladas com 100 ng /mL de LPS durante o período de tempo desejado. O tratamento de monócitos com LPS foi utilizada como controlo positivo. Nas experiências foi adicionado LPS polimixina B não. Após a incubação, os sobrenadantes de cultura de células também foram recolhidos para quantificação do nível de proteína de citocinas e a activação de NF-kB por meio de ELISA.
Ensaio MTT
Efeitos de DHMEQ sobre a viabilidade das células foram ensaiados pela 3- ( -2,5-difenil brometo de tetrassódio (MTT) método de [45] 4,5-dimetiltiazol-2-il). Os monócitos (3×10
5) foram semeadas em placas de 96 poços durante 48 horas para DHMEQ citostático. As diluições em série de DHMEQ (a 2 ug /mL, 5 ug /ml, 10 ug /mL) foram gerados e adicionados às células. Após incubação com DHMEQ ou DMSO nas concentrações indicadas e os pontos de tempo. As células tratadas por uma solução de MTT (1mg /mL) durante 4 horas foram medidos por um leitor de microplacas (Bio-Rad, Richmond, CA) a um comprimento de onda de referência de 630 nm e um comprimento de onda de teste de 570 nm. A viabilidade celular foi expressa em percentagem das amostras de controlo tratadas com DMSO.
A análise estatística
Para variáveis contínuas, diferença de média entre os grupos de estudo foi avaliada através da análise de variância (ANOVA, no caso de três grupos) ou t-teste (dois grupos). Para as variáveis discretas, a diferença de distribuição entre os grupos de estudo foi avaliada através do teste χ
2 de teste. A correlação entre as variáveis contínuas foi avaliada através do coeficiente de correlação Spearman
r
.
Resultados
As características basais dos controles saudáveis e pacientes com câncer com e sem TVP são apresentados na Tabela foram observadas 1. Não houve diferenças significativas entre os grupos em relação à idade, sexo, tabagismo, índice de massa corporal. A frequência dos cancros localizados foi semelhante entre pacientes com câncer com e sem TVP, bem como a distribuição de tipo de câncer /site (Tabela 1).
níveis de biomarcador plasmáticos de inflamação, angiogênese e coagulação em pacientes com câncer TVP + e DVT-
níveis plasmáticos médios de diferentes biomarcadores, incluindo os de inflamação, angiogênese e coagulação, analisados no grupo controle e em pacientes com câncer com e sem TVP são relatados na Tabela 2. em comparação com o grupo controle, plasma maior níveis de CRP, fibrinogénio, IL-6, TNF-α, IL-1β, MMP-9, foram observadas de VEGF, antigénio TF, e sP-selectina em doentes com cancro com e sem TVP (P 0,01). Como esperado, a concentração de todos os marcadores no TVP + grupo foi significativamente mais elevada do que em DVT- (p 0,01) com a única excepção do fibrinogénio (p = 0,35). A correlação de todos os marcadores de uns com os outros são referidos em (S1 Tabela). correlações positivas (| R | 0,45) entre CRP, IL-6, TNF-a, IL-1, MMP-9, VEGF, e antigénio TF foram encontrados em ambos os grupos de pacientes de cancro, enquanto que o fibrinogénio correlacionou-se apenas em TVP + grupo. Nenhuma correlação entre os marcadores foram observados em controlos saudáveis (S1 tabela)
Abreviaturas:. TVP, trombose venosa profunda; IL-6, interleucina-6; α TNF, fator de necrose tumoral-α; IL-1β, interleucina-1β; CRP, proteína C-reativa; MMP-9, da metaloproteinase da matriz-9; VEGF, factor de crescimento endotelial vascular; TF, factor de tecido; P-selectina solúvel (sP-selectina). diferenças significativas entre os marcadores inflamatórios, angiogénicos e de coagulação eram evidentes em pacientes com câncer com e sem TVP comparados com controles com incrementos adicionais em pacientes com câncer de TVP. valor P são dadas por meio de análise de variância (teste ANOVA, no caso dos três grupos) ou t-teste (dois grupos).
As citocinas e secreção de MMP-9 em monócitos humanos
a secreção destes marcadores analisados em monócitos sobrenadante mostrou tendência similar à observada no plasma. A produção espontânea de citoquinas, tais como IL-6, TNF-α, IL-1β e VEGF foram significativamente mais elevados em ambos os grupos de pacientes de cancro com e sem TVP do que os de controlos saudáveis (p 0,0001) (Fig 1). Em comparação com DVT- doentes com cancro, TVP + apresentaram um aumento das mudanças de dobragem de 1,28 (95% CI: 1,20-1,37; p 0,0001), 1,34 (95% CI: 1,23-1,46; p 0,0001), 1,41 (95% CI: 1,30-1,54; p 0,0001), e 1,61 (95% CI: 1,45-1,78; p 0,0001) para a IL-6, TNF-α, IL-1β, e VEGF, respectivamente. Além de citocinas, também MMP-9, a actividade de produção e TF foram maiores nos pacientes DVT + cancerosas do que naqueles DVT- e nos controles saudáveis (média ± DP, 103 ± 23, 73 ± 24, 8,8 ± 4, para a MMP-9 e significa ± SD, 35,6 ± 6,4, 28 ± 5, 3,3 ± 0,7 para a actividade TF, respectivamente). Como esperado, uma forte correlação entre os níveis de IL-6, TNF-α, IL-1β, VEGF, MMP-9 e TF no plasma de doentes com cancro TVP + e DVT- e aqueles que são introduzidos a partir de monócitos dos mesmos pacientes foram observados (Tabela 3 ).
Os níveis de IL-6, TNF-α, IL-1β, e VEGF foram medidos em sobrenadantes de monócitos purificados a partir de doentes com cancro com e sem TVP por um ensaio de imunossorvente ligado a enzima sensível (ELISA). Os resultados são apresentados como a média ± DP.
TVP, a trombose venosa profunda. A forte correlação positiva entre as citocinas plasmáticas, marcadores angiogênicos e de coagulação e secreção
in vitro
dos mesmos marcadores em dois grupos de pacientes com câncer com e sem TVP.
Efeito da DHMEQ sobre a atividade subunidade p65 NF-kB em monócitos
a ativação da subunidade p65 NF-kB em monócitos não estimulados, de pacientes com câncer TVP + e DVT- e do controle saudável, foi analisado por um ensaio sensível ELISA. Este ensaio tem a vantagem de ser 10 vezes mais sensível do que o ensaio de desvio de mobilidade electroforese (EMSA) e permite uma maior flexibilidade na etapa experimental. Como mostrado na Figura 2, a actividade de NF-kB subunidade p65 em monócitos variaram em todos os grupos analisados. Maior atividade subunidade p65 NF-kB foi observada em pacientes com câncer TVP + e DVT- do que nos controles saudáveis (p 0,0001). Diferenças significativas de actividade de p65 de NF-kB também foram detectadas entre os doentes com cancro TVP + e DVT- (p 0,0001). Já foi demonstrado que o NF-kB regula a várias moléculas, incluindo aqueles analisados no presente estudo [41,42]. Consequentemente, todos estes marcadores positivamente correlacionada com a actividade de NF-kB (Tabela 4). A identificação destes marcadores podem reconhecer NF-kB como um alvo atractivo para a intervenção terapêutica. Portanto, nós pensamos para inibir NF-kB por DHMEQ, um conhecido inibidor de NF-kB [46,47]. O efeito de DHMEQ, na dose de 10 ug /mL, sobre a inibição da actividade da subunidade p65 de NF-kB em monócitos a partir dos dois grupos de pacientes com cancro, foi explorada (Figura 2). As experiências de controlo com DMSO foram incluídos (Figura 2). Notavelmente, DHMEQ não foi eficaz em monócitos a partir de controlos saudáveis em doses diferentes e de tempo (S1 figura). Embora, DHMQ causou a redução da viabilidade das células derivadas de monócitos de pacientes com cancro TVP + e DVT-, este efeito não foi observado em monócitos a partir de controlos saudáveis (Fig S2).
A subunidade p65 de NF-kB activado foi significativamente maior em pacientes com câncer TVP + e DVT- do que nos controles saudáveis (P 0,0001). (Teste ANOVA). subunidade p65 de NF-kB foi significativamente mais elevada em doentes com cancro TVP + do que naqueles DVT- (P 0,001) (teste t). Para examinar os efeitos de DHMEQ, monócitos foram tratadas com 10 ug /mL DHMEQ. Como experiências de controlo, foi utilizado DMSO em vez de DHMEQ. Os monócitos de pacientes com cancro TVP + foram mais sensíveis às DHMEQ do que os de DVT-. Curiosamente, nenhum efeito de DHMEQ houve em monócitos saudáveis. Os resultados são apresentados como médias ± DP. OD, densidade óptica; TVP, trombose venosa profunda; DMSO, sulfóxido de dimetil; . DHEMQ, dehydroxymethylepoxyquinomicin
Abreviaturas: DVT, trombose venosa profunda. Uma correlação positiva foi encontrada entre a atividade subunidade p65 NF-kB e todas as moléculas em pacientes com câncer com e sem TVP. foi usada Spearman análise Posto de correlação.
Efeito da LPS e DHMEQ on nuclear p65 fator-kB em monócitos
Como mostrado na Figura 3, o tratamento de monócitos com LPS a 100 ng /ml fortemente activada de NF-kB p65 de 46%, 73% e 35% em relação ao valor de base em comparação com células não estimuladas em doentes com cancro TVP +, DVT- e nos controles saudáveis, respectivamente (p 0,0001). A pré-incubação com DHMEQ, antes da estimulação com LPS, reduziu fortemente a actividade da subunidade p65 de NF-kB de 4,5 vezes, 3 vezes e 3,2 vezes na TVP cancro + e DVT- e em controlos saudáveis (p 0,0001), respectivamente, em comparação com LPS sozinho. Para reforçar as nossas conclusões sobre NF-kBp65 down-regulação por DHMEQ em monócitos LPS-ativados, a quantidade de atividade subunidade p65 NF-kB em extractos nucleares a partir dos mesmos experimentos foram posteriormente medidos por ELISA. Como esperado, o tratamento com DHMEQ estimulada por LPS em monócitos induziu o decréscimo da actividade de NF-kB entre os três grupos analisados (Fig 3).
Os extractos nucleares foram preparados a partir de monócitos, pré-tratadas e não com DHMEQ (10 ug /mL) durante 2 h e, após o que estimuladas com LPS 100 ng /ml durante 24 horas, utilizando um Kit de extracto nuclear. A estimulação dos monócitos com LPS a 100 ng /mL induz aumento un significativa do nível nuclear da proteína p65 de NF-kB em todos os grupos ou doentes com cancro TVP +, DVT- e nos controles saudáveis, em comparação com células não estimuladas, (P 0,0001). subunidade p65 de NF-kB foi significativamente mais elevada em doentes com cancro TVP + do que naqueles DVT- (P 0,0001) (teste t). TVP, trombose venosa profunda.
Efeitos de DHMEQ sobre a liberação de marcadores por monócitos
tratamento DHMEQ foi usado para avaliar se o NF-kB está diretamente associada com a libertação de todos os marcadores, detectada acima, a partir de monócitos de pacientes com câncer TVP + e DVT-. A Figura 4 mostra que o tratamento com DHMQ diminui drasticamente os níveis de IL-6, TNF-alfa, IL-1 beta e VEGF em ambos os grupos de doentes de cancro, em comparação com células não tratadas. Tendência semelhante foi observada para a MMP-9 e TF. Em contraste, não foram observadas diferenças no grupo de controlo em que constitutiva de ativação NF-kB estava ausente.
Os monócitos foram tratadas ou não com 10 mg /mL DHMEQ, após o qual as quantidades de interleucinas (IL) -6 , factor de necrose tumoral alfa (TNF-α), IL-1β e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) segregados foram medidos por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Os monócitos foram incubados durante 24 h. O tratamento com DHMEQ induz a diminuição de todas as moléculas em ambos os grupos de pacientes de cancro com e sem TVP em comparação com células não tratadas (P 0,0001), (t-teste). Os resultados são apresentados como médias ± DP. TVP, trombose venosa profunda;
activação dependente de soro de NF-kB em monócitos saudáveis
Como mostrado na Figura 5, a incubação de monócitos saudáveis com soros reunidos, derivado do cancro pacientes TVP + ou DVT- com os valores mais elevados de citocinas, induzida por um aumento significativo da activação do NF-kB em comparação com soros combinados, derivados dos controlos saudáveis com os valores mais baixos de citocinas, os mesmos (p 0,0001). Além disso, uma maior activação de NF-kB foi observada em monócitos estimulados por soros derivada de doentes com cancro da TVP + comparada com a estimulada pelo soro derivado de DVT- (p 0,001) (Figura 5). A fim de excluir ainda mais a possibilidade de que alguma contaminação por LPS pode contribuir para a activação de NF-kB, 10 ug /ml de sulfato de polimixina B foi adicionada a todas as culturas de células para neutralizar qualquer potencial de contaminação por LPS. Em vez disso, como controlo positivo da activação do NF-kB, o LPS foi considerada. Estimulada por LPS culturas induzidas uma maior actividade de NF-kB estatisticamente significativa em comparação com culturas de cancro derivadas de soros estimulados com (p 0,001), enquanto que não houve diferença significativa foi evidente entre as culturas estimuladas por LPS e cancerosas TVP sera- culturas estimuladas derivados. Nas experiências foi adicionado LPS polimixina B não. A activação do NF-kB, estimuladas com os soros provenientes de pacientes com cancro com e sem TVP ou LPS, foi parcialmente bloqueado por DHMEQ (10 ug /ml), quando adicionados em ambas as culturas e as culturas estimuladas com LPS.
monócitos a partir de 25 controlos saudáveis foram avaliados quanto à activação do NF-kB depois de terem sido cultivadas durante 20 horas em meio suplementado com soro, quer de 40% a partir de três grupos. Os monócitos (5×10
5) a partir de 25 dadores saudáveis foram cultivadas durante 20 horas em meio (RPMI 1640) suplementado com soro quer 40% derivada a partir de 64 doentes com cancro da TVP + e 257 DVT- com os mais elevados níveis de citocinas no plasma ( percentil 75 ) ou 40% de soro derivado de 100 dadores saudáveis com os valores de citocinas mais baixas ( percentil 25). A incubação de monócitos saudáveis com mistura de soros derivada de doentes com cancro da TVP + (sCADVT +) ou DVT- (sCADVT-) induziu um aumento significativo da actividade de NF-kB em comparação com aquele derivado a partir de controlos saudáveis (HM) após o tratamento com soros de controlos saudáveis ( SH) (P 0,0001). Uma maior do NF-kB activação subunidade p65 foi observada em monócitos estimulados por soros de doentes com cancro da TVP + em comparação com que a estimulada por soro derivado de DVT- (P 0,001) (teste t). Sem NF-kB ativação subunidade p65 foi observada em monócitos estimulados com soro derivado de controles saudáveis.
activação dependente do soro da produção de citocinas em monócitos saudáveis
Além de NF-kB actividade, exploramos a activação de citocinas em monócitos saudáveis tratados com mistura de soros obtida a partir de doentes com cancro da TVP + e DVT- e de controlos saudáveis. níveis médios mais elevados de IL-6, TNF-a, IL-1, VEGF, MMP-9 e TF foram segregadas a partir de monócitos saudáveis tratados com os soros derivada de doentes com cancro da TVP em comparação com os de DVT- (p 0,01). No monócitos contrário, saudáveis tratados com soros de controlos saudáveis, não mostrou nenhum efeito significativo (Tabela 5). Quando os monócitos saudáveis foram incubadas com soros derivados de doentes com e sem TVP na presença de DHMEQ, a produção de citocinas fortemente diminuído em comparação com células não tratadas (p 0,0001). (Tabela 6)
HM, monócitos indivíduos saudáveis; sh, soros de indivíduos saudáveis; LPS, lipopolissacarídeo; sCaDVT-, soro de pacientes com câncer sem trombose venosa profunda; sCADVT +, soro de pacientes com câncer e trombose venosa profunda; IL-6, interleucina-6; TNF- α, factor de necrose tumoral alfa; IL-1β, interleucina-1 beta; VEGF, factor de crescimento endotelial vascular; MMP-9, da metaloproteinase da matriz-9; TF, o factor de tecido. Todos os valores de p foram calculados por Wilcoxon Matched-Pairs Signed-Rank Teste
HM, monócitos de indivíduos saudáveis.; sh, soros de indivíduos saudáveis; LPS, lipopolissacarídeo; sCaDVT-, soro de pacientes com câncer sem trombose venosa profunda; sCADVT +, soro de pacientes com câncer e trombose venosa profunda; IL-6, interleucina-6; TNF- α, factor de necrose tumoral alfa; IL-1β, interleucina-1 beta; VEGF, factor de crescimento endotelial vascular; MMP-9, da metaloproteinase da matriz-9; TF, o factor de tecido. Todos os valores de p foram calculados por Wilcoxon Matched-Pairs Signed-Rank teste.
As experiências de controlo, realizados com LPS, indicou que um importante reforço notável de toda a produção de marcadores, em comparação com aqueles estimulados com os soros derivados a partir de doentes com cancro DVT- (p 0,0001). Como esperado, não foram observadas diferenças significativas na produção de todos os marcadores de entre o grupo de monócitos saudáveis tratadas com LPS e tratados com o que soros derivados de doentes com cancro da TVP + (S2 tabela).
Discussão
pacientes com câncer podem ter complicações, incluindo trombose, hemorragia e coagulação intravascular disseminada. A identificação de novos alvos terapêuticos em doentes oncológicos com risco elevado de TVP pode incentivar novos estudos de protecção para melhorar a gestão desses pacientes. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que analisa múltiplos marcadores NF-kB-dependentes em pacientes com câncer com e sem TVP.
Além disso, a secreção de proteínas também foi testado, a fim de descobrir se as mudanças no Os níveis plasmáticos de citocinas foram associadas a alterações na produção de citocinas. Como esperado, os níveis plasmáticos de marcadores analisados foram regulados positivamente nos doentes com cancro com e sem TVP em comparação com controlos saudáveis, embora fossem estatisticamente maior na TVP +, com excepção do fibrinogénio que foi semelhante em ambos os grupos. As citocinas medidos nas nossas experiências são em grande parte envolvida na regulação positiva de reacções inflamatórias e, portanto, em numerosas doenças malignas. Quando se investigaram a secreção da proteína, a mesma tendência de plasma também foi observada em monócitos de pacientes.