Abstract

Os mecanismos específicos como as células de câncer de pulmão que abrigam o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) mutações ativadoras pode sobreviver tratamento com inibidores da quinase EGFR-tirosina (TKI), até que finalmente adquirir o tratamento de resistência a mutações genéticas não são claras. A diversidade fenotípica das células cancerosas causadas por alterações genéticas ou epigenéticas (intratumorais heterogeneidade) confere falha do tratamento e pode promover a evolução do tumor através da seleção darwiniana. Recentemente, encontramos DDX3X como a proteína que foi preferencialmente expresso em melanoma murino com células-tronco do câncer (CSC) -como fenótipos por análise proteômica. Neste estudo, foram transfectadas PC9, células de cancro do pulmão humano abrigando EGFR exon19 eliminação, com o ADNc que codifica DDX3X e descobriram que DDX3X, uma helicase de ARN dependente de ATP, induzidas fenótipos CSC-like e a transição epitelial-mesenquimal (EMT) acompanhadas com perda de sensibilidade ao EGFR-TKI. DDX3X expressão foi associada com a regulação positiva de Sox2 e aumento das células cancerosas que exibem fenótipos CSC-semelhantes, tais como a proliferação independente de ancoragem, forte expressão de CD44, e aldeído desidrogenase (ALDH). A EMT com a mudança de E-caderina para N-caderina foi também facilitada pela DDX3X. De qualquer fosforilação de EGFR-ligando independente ou induzida pelo ligando foi inibida em células de cancro do pulmão que expressaram fortemente DDX3X. A falta de dependência do sinal de EGFR resultou em resistência a EGFR-TKI. Além disso, encontramos uma pequena subpopulação não aderente que expressa fortemente DDX3X acompanhado por as mesmas propriedades semelhantes a células-tronco e da EMT em células PC9 parentais. A subpopulação única carecido de sinalização de EGFR e foi altamente resistente ao EGFR-TKI. Em conclusão, nossos dados indicam que DDX3X pode desempenhar um papel crítico para a indução diversidade fenotípica, e que o tratamento visando DDX3X pode superar a resistência primária para EGFR-TKI resultante da intratumoral heterogeneidade

Citation:. Nozaki K, Kagamu H, Shoji S, Igarashi N, Ohtsubo, A, Okajima M, et al. (2014) DDX3X Induz primário Resistência EGFR-TKI Baseado em intratumoral Heterogeneidade em células de câncer de pulmão com mutações de activação de EGFR. PLoS ONE 9 (10): e111019. doi: 10.1371 /journal.pone.0111019

editor: Pier Giorgio Petronini, Universidade de Parma, Itália |

Recebido: 10 de março de 2014; Aceito: 26 de setembro de 2014; Publicação: 24 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Nozaki et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid para a Investigação Científica do Ministério da Educação, Ciência e Cultura do Japão (# 20590915, 23591141 #, # 24591157, # 26293196), e por fundos para pesquisa da Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Competindo interesses:. Este estudo foi financiado em parte por Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de partilha

sinal de Introdução

Tratamentos segmentação dependência causada por mutação motorista oncogênico levaram a resultados sem precedentes no cenário clínico. O uso do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) inibidores da quinase tirosina (TKI) melhorou significativamente a sobrevida livre de progressão em pacientes com câncer de pulmão albergando mutações ativadoras do EGFR; No entanto, ainda é difícil alcançar uma cura para o cancro do pulmão, particularmente em pacientes com doença avançada [1], [2]. A diversidade fenotípica das células cancerosas é baseado em ambos os fatores e os resultados genéticos e não genéticos na sobrevivência de células resistentes ao tratamento. Com efeito, a resistência adquirida mais reflecte a selecção de células cancerosas que albergam alterações genéticas que conferem resistência estocásticos. No entanto, os mecanismos pelos quais as células cancerígenas sobrevivem até a aquisição de mutações adicionais não são claras. Sharma et ai. demonstraram que uma pequena subpopulação de células reversivelmente drogas tolerantes existido em todas as células de cancro examinadas e que as células tolerantes a droga se comportaram como células-mãe, dando origem a células resistentes a drogas com mutações adicionais [3].

INOPERANTE /H (Asp-Glu-Ala-Asp /Sua) caixa de polipéptido 3, ligada a X (DDX3X) é um membro da família de DEAD-box das helicases de RNA dependentes de ATP e é localizado no cromossoma X [4]. helicases DEAD-box têm múltiplas funções, incluindo a emenda do RNA, exportação mRNA, a regulação da transcrição e tradução, decadência RNA, biogênese do ribossomo, e regulação miRNA [5], [6]. Assim, DDX3X se pensa estar envolvida na regulação da expressão do gene epigenético. A nossa análise do proteoma anterior identificou DDX3X como uma proteína purificada preferencialmente expressa em células CD133

+ B16 células de melanoma, que possuía células estaminais cancro (CSC) -como propriedades [7], [8]. Embora DDX3X foi originalmente relatado para suprimir o crescimento do tumor através da modulação

p21

WAF /cip1

expressão do gene [9], DDX3X tem também sido mostrado para ser directamente correlacionada com a oncogénese [10], [11]. Recentemente, todo-exome sequenciamento identificados DDX3X como um alvo de mutações no gene motorista que medeiam patogênico sinalização β-catenina em meduloblastoma, o que apoia a teoria CSC [12] – [16].

Neste estudo, procuramos para investigar o papel de DDX3X em conferir resistência ao EGFR-TKI em células de cancro de pulmão. Nossos dados sugerem que DDX3X pode representar um novo alvo terapêutico para superar intratumoral heterogeneidade em pacientes com câncer de pulmão albergando mutações de activação de EGFR.

Materiais e Métodos

As células tumorais

células PC9 células de adenocarcinoma do pulmão albergando um exão 19 mutação de deleção de EGFR, foram fornecidos a partir Riken Bioresource Center e mantidas em meio de cultura (CM) contendo RPMI 1640 suplementado com 10% inactivado pelo calor lipopolissacárido (LPS) -qualified soro fetal de vitelo (FCS), 0,1 aminoácidos não essenciais 1 mM, piruvato de sódio uM, 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de sulfato de estreptomicina (todos de Life Technologies, Inc., Tóquio, Japão). HCC4006 células de adenocarcinoma de pulmão albergando um EGFR exão mutação 19 exclusão foram adquiridos da American Type Culture Collection e foram cultivadas em CM.

A transfecção de células PC9 com

DDX3X

cDNA

A transfecção de células de câncer de pulmão com

DDX3X

cDNA foi realizada usando um quadro de leitura aberta Myc-FLAG-marcado (ORF) clone de DDX3X variante transcrição humana 1 como DNA transfecção-ready (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD , EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. As células experimentais foram incubadas com meio fresco contendo G418 (600 ug /mL, Promega, Madison, WI, EUA), e o meio foi substituído com meio contendo G418 fresco a cada 3-4 dias até as colónias resistentes foram identificadas.

knockdown de DDX3X por shRNA

knockdown de DDX3X foi realizada utilizando um lentivírus shRNA (pLKO.1-Puro) plasmídeo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) possuindo a seguinte sequência alvo DDX3X: 5′-CCGGACGTTCTAAGAGCAGTCGATTCTCGAGAATCGACTGCTCTTAGAACGTTTTTTG. PC9 células foram plaqueadas em meio fresco, e de brometo de hexadimetrina (8 ug /ml) foi adicionado a cada poço. As células foram co-transfectadas com o plasmídeo pLKO.1-puro, mais o vector de empacotamento de acordo com o protocolo do fabricante. O meio foi mudado aproximadamente 16 h após a transfecção, e as células foram cultivadas durante um adicional de 48-72 h. As células experimentais foram incubadas com meio contendo puromicina fresco (2,0 ug /ml), e o meio foi substituído com meio contendo puromicina fresco a cada 3-4 dias até as colónias resistentes foram identificadas. Um mínimo de colónias resistentes a puromicina cinco foram colhidos, e cada clone foi expandido para o ensaio. A eficiência de DDX3X knockdown foi determinado por imunotransferência.

Os anticorpos monoclonais (mAbs) e citometria de fluxo

conjugado com PE anti-CD44 (IM7), anti-caderina-E (67A4), e anti-vimentina (GF2); isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anti-N-caderina (8C11) foram adquiridos da BD Pharmingen (San Diego, CA, EUA). Análise de fenótipos de superfície celular foi realizada por meio de coloração de imunofluorescência directa de 0,5-1 × 10

6 células com os mAbs fluoróforos acima mencionados e, em seguida, tratada com 1% de paraformaldeído. Em cada amostra, 1 × 10

4 células foram analisadas usando um microfluorometer fluxo FACScalibur (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, EUA). Os anticorpos da subclasse combinando-PE-conjugados utilizados como controlos de isotipo também foram adquiridos da BD Pharmingen. As amostras foram analisadas com o software CellQuest (BD).

immunoblotting

As células foram colhidas e lisadas em tampão de Nonidet P-40 contendo uma mistura de inibidor de protease (Sigma). Quantidades iguais de proteína foram sujeitos a dodecilo de sódio electroforese em gel de sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) na Mini-PROTEAN TGX Quaisquer kD Precast Gel (BioRad, Hercules, CA, EUA) e subsequentemente transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EUA). As imunotransferências de lisados ​​de células de tumor foram sondadas com anticorpos contra DDX3X (Sigma), EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfo-EGFR (Tyr1173), fosfo-EGFR (Tyr845), Akt, fosfo-Akt, ERK1 /2, fosfo- ERK1 /2, e β-actina (Sigma). Todos os anticorpos, excepto para o anti-DDX3X e anti-β actina foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, EUA). anticorpos secundários consistiu de IgG anti-rato (BioRad) e anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase de rábano (Abcam, Cambridge, MA, EUA). bandas de proteínas imunorreactivas foram visualizadas utilizando um kit ECL (Pierce). Pelo menos três experiências independentes foram executadas para todas as análises.

Aldefluor ensaios

ALDH actividade foi detectada utilizando o kit ALDEFLUOR (StemCell Technologies Inc., Vancouver, Canadá) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, Aldefluor ensaios foram realizados por células suspensão em tampão de ensaio contendo 1,5 uM Aldefluor BODIPY-aminoacetaldeído, um substrato de ALDH. As células foram então incubadas durante 30 min a 37 ° C e analisadas com um microfluorometer.

ensaios de viabilidade celular

Um total de 5 × 10

4 células de tumor foram semeadas em placas de 24 poços placas no dia 0. Vinte e quatro horas após a sementeira, erlotinib ou veículo foi adicionado. Número de células vivas e mortas foram contadas com a coloração azul de tripano. % De sobrevivência indica uma percentagem de células vivas, que excluiu coloração com azul de tripano, com base no número total de células no poço. As amostras foram preparadas em triplicado.

ensaios MTT

As células de tumor foram semeadas a 5 x 10

3 células por poço em placas de cultura de 96 poços de fundo plano e cultivadas em CM. Após um período de incubação de 24 horas para permitir que os prendem a placas de cultura, as células foram tratadas com erlotinib durante 48 h. As placas de cultura foram centrifugadas para células tumorais não aderentes e o meio foi removido tanto quanto possível e substituído por 100 ul de meio fresco. O (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) 3- para a viabilidade celular foi realizada por adição de 10 uL de MTT reagente por poço durante 2 h a 37 ° C, seguido pela a adição de 100 uL /​​poço de reagente corante de solubilização em detergente. O sobrenadante foi aspirado e a absorvância foi medida a 570 nm. Os resultados são representativos de três experiências independentes.

LEF /TCF Reporter Ensaios

células PC9 foram transitoriamente transfectadas com o vetor lentivírus incluindo TCF /LEF

Firefly

construção repórter luciferase e interna controle

Renilla

construção luciferase, ou não-inducible

Firefly

construção repórter luciferase e controlo interno

Renilla

construção luciferase (kit Reporter Cignal TCF /LEF, Qiagen). As células foram transfectadas com Lipofectamine 2000 e seleccionadas durante 2 dias em puromicin. células transfectadas foram então re-semeadas em placas de 24 poços a 30.000 células /poço antes do tratamento com Wnt3a recombinante (100 ng /mL; R D Systems) durante 12 horas. ensaio de repórter de luciferase dupla foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Dual-Luciferase Reporter Assay sistema, Promega), e os valores de actividade de promotor são expressos como unidades relativas de luz. unidades relativas de luz foram calculados como

Firefly

-luciferase /

Renilla

-luciferase. As experiências foram efectuadas em triplicado.

A análise estatística

A menos que indicado de outro modo, as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA) e desemparelhado dois

t

testes de Student -tailed. Para comparações entre mais de três grupos, foi utilizada a análise de duas vias de variância (ANOVA) com pós-teste de Bonferroni. Diferenças com

foram considerados significativos P

-Valores de menos de 0,05. Os resultados dos experimentos são apresentados como médias aritméticas SDs ±.

Resultados

DDX3X superexpressão induz tronco fenótipos semelhantes a células

Nós informou recentemente que a expressão DDX3X é regulada na CD133

+ subpopulação melanoma, que possui propriedades CSC-like, tais como a formação esfera tumor e de alta tumorigenicidade [8]. Para elucidar se expressão DDX3X foi correlacionada com propriedades CSC-like, que transfectadas células PC9, células de adenocarcinoma do pulmão albergando um EGFR exão mutação 19 eliminação, com o ADNc que codifica DDX3X e estabelecida uma linha celular de novo, denominada células A-1, que sobre-expressos DDX3X ( Fig. 1A). Como representado na Fig. 1B, a sobre-expressão DDX3X resultou na supra-regulação de Sox2, um factor de transcrição Yamanaka que induz as células estaminais pluripotentes. Além disso, a expressão de Snail, um factor de transcrição DDX3X-regulado que promove a migração de células e metástase em muitos tipos de cancros [17], parece ser regulada positivamente em células A-1 (Fig. S1A). Além disso, observou-se um aumento significativo no número de células em proliferação de uma forma independente de ancoragem (Fig. 1C e 1D).

. Immunoblotting análise de DDX3X em células parentais PC9, transfectantes simulados e A-1 as células que foram transfectadas com cDNA que codifica DDX3X. B. A análise de imunotransferência de Sox2, KLF4, e c-Myc, em células parentais PC9, transfectantes simulados e células A-1. C. Análise de proliferação celular independente de ancoragem por meio de microscopia de contraste de fase. D. 1 × 10

5 células parentais PC9 ou células A-1 foram cultivadas em placas de 24 poços durante 3 dias. As células não aderentes foram recolhidos por agitação suave em meio de cultura. A proporção de células não aderentes foi calculada com base no número total de células aderentes. As células mortas foram excluídas com o método de exclusão de azul de tripano. *

P Art 0,05. Os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências independentes

DDX3X mediada resistência EGFR-TKI

Dado que as células estaminais utilizar haste sinalização especifica para a célula.; Portanto, CSC-fenótipos como pode ser associado com a activação de diferentes outros do que o EGFR sinalização resultando na alteração da sensibilidade ao EGFR-TKI de vias de sinalização. Assim, ao lado examinamos sensibilidade EGFR-TKI de células A-1. Como mostrado na Fig. 2A, uma resistência significativa a 48 h de tratamento com o EGFR erlotinib-TKI foi observada em células A-1. Knockdown de DDX3X restaurou a sensibilidade a EGFR-TKI (Fig. 2B). Embora tenha sido observada redução de células viáveis ​​em% de células A-1, quando as células foram tratadas com erlotinib numa concentração maior do que 20 nM, não era claro se as células estavam a morrer ou não. Para testar se as células A-1 exibiam reduziu a viabilidade ou a proliferação reduzida simplesmente seguinte 72-H erlotinib, as células mortas foram coradas com iodeto de propídio (PI) e analisados ​​com uma microfluorometer. Embora o número de células mortas aumentou nas células parentais PC9, nenhum aumento foi detectada em células A-1 (Fig. 2C). Este fenómeno foi confirmada pela contagem do número de células durante três dias utilizando o método de exclusão de azul de tripano (Fig. 3A). O número de células mortas PC9 foi significativamente aumentada na presença de erlotinib em concentrações superiores a 20 nm. Em contraste, as células A-1 parou proliferação quando expostos ao erlotinib em concentrações maiores do que 20 nM, mas o número de células mortas a-1 não diferem daqueles em células não tratadas, mesmo após três dias de exposição a 2.000 nM erlotinib. Todos os outros clones que foram modificados para sobre-expressar DDX3X exibiu a mesma resistência à do erlotinib como células A-1 (Fig. 3B).

. ensaio MTT de células parentais PC9 e células A-1. As células cancerígenas foram tratados com a concentração indicada de erlotinib durante 48 h. As amostras foram preparadas em triplicado. Os dados são apresentados como a média ± DP. ensaio B. MTT de células PC9 parentais, A-1 células, e as células A-1 com knockdown de DDX3X. As células cancerígenas foram tratados com a concentração indicada de erlotinib durante 48 h. As amostras foram preparadas em triplicado. Os dados são apresentados como a média ± DP. C. citometria de fluxo de células cancerosas tratadas com 20 erlotinib nM durante 72 h.

A. Um total de 5 × 10

4 células de tumor foram semeadas em placas de 24 poços no dia 0. Vinte e quatro horas após a sementeira, erlotinib ou veículo foi adicionado às concentrações indicadas. Número de células vivas e mortas foram contadas com a coloração azul de tripano. % De sobrevivência indica uma percentagem de células vivas, que excluiu coloração com azul de tripano, com base no número total de células no poço. As amostras foram preparadas em triplicado. Os dados são apresentados como a média ± DP. * É usado para indicar significância. B. A Survival% das células cancerosas tratadas com 20 nM erlotinib foi demonstrada. A-1, 2, 3, 4, e 5 indicam os números de clones que foram transfectadas com cDNA que codifica DDX3X. A sobrevivência% indica a percentagem de células vivas que excluíram o corante azul de tripano, com base no número total de células no poço. As amostras foram preparadas em triplicado. Os dados são apresentados como a média ± DP. **

p

. 0,001

DDX3X reduzida EGFR sinalização em células cancerosas abrigar mutações de activação de EGFR

A sobrevivência e proliferação das células PC9 são dependentes um EGFR sinalização vício, porque as células PC9 possuem mutações driver no

EGFR

gene que aumentar a atividade tirosina quinase [18], [19]. Assim, analisamos se a sinalização EGFR foi afetada pela DDX3X superexpressão. Consistente com relatórios anteriores, Tyr1068 de EGFR foi fosforilado em células parentais e transf ectantes PC9 Mock, mesmo na ausência de EGF (Fig. 4A); No entanto, quase nenhuma fosforilação do EGFR foi detectada em células A-1. Além disso, knockdown de DDX3X em células A-1 restaurou a fosforilação do EGFR. Para confirmar que este fenómeno não se limitou a linha de células PC9, nós transfectadas HCC4006, um adenocarcinoma do pulmão humano abrigando uma deleção EGFR exão 19, com cDNA que codifica DDX3X (HCC4006 S1, HCC4006 S2). HCC4006 S1 e S2 também perdeu a fosforilação de EGFR (Fig. S1B). EGFR possui múltiplos resíduos de Tyr que sofrem fosforilação. Por exemplo, a proteína liga-se ao adaptador GRB2 activado pelo EGFR fosforilado Tyr1068 [20], e fosforilada Tyr1173 proporciona um local de acoplamento para a proteína Shc andaime, que está envolvida na cinase activada por mitogénio (MAPK) activação [21] sinalização. Além disso, Tyr845 pode ser fosforilada por outras cinases, incluindo Src, e tem sido mostrado para ser fosforilada em muitos mutantes de EGFR resistentes a gefitinib [22] – [24]. Portanto, o próximo examinados os estados de fosforilação destes três resíduos de tirosina (Tyr845, Tyr1068, e Tyr1173) na presença de EGF. Curiosamente, verificou-se a fosforilação reduzida de todos examinados em resíduos de tirosina do EGFR em células A-1 (Fig. 4B).

. Immunoblotting análise do EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068) e DDX3X em células cancerosas sem suplementação de EGF. B. A análise de imunotransferência de fosfo-EGFR em Tyr1068, Tyr1173, Tyr845 e em células parentais PC9 e células A-1. C. Análise Cinética de sinalização de EGFR em células parentais PC9 e células A-1. EGFR, fosfo-EGFR (Tyr1068), Akt, fosfo-Akt, ERK1 /2, e fosfo-ERK1 /2 níveis foram analisados ​​por imunotransferência com 0, 15, 30, 60, 120, e 900 min após a adição de 100 ng /ml de EGF.

na presença de 100 ng /mL de EGF, a fosforilação do EGFR (Tyr1068) foi aumentada em células parentais PC9 (Fig. 4C). Em contraste, fosforilação induzida pelo ligando de EGFR e quinase regulada por sinal subsequente (ERK) fosforilação extracelular foram significativamente atenuada em células A-1.

Para além de ser regulada por fosforilação, o EGFR pode gerar a sinalização através de fosforilação de outra receptor do factor de crescimento epidérmico humano (HER) por proteínas da família da formação de heterodímeros. A diafonia de Met com a via de sinalização de EGFR também tem sido mostrado para ser envolvido na resistência EGFR-TKI [25]. Assim, nós testamos se HER2, HER3, HER4, e Met foram fosforilada. No entanto, não foram encontradas diferenças nos estados de fosforilação de HER2 ou Met entre as células PC9 parentais e células A-1 (Fig. S1c, D). Além disso, HER3 e HER4 não foram fosforilados nestas células (dados não apresentados).

Uma pequena subpopulação de células PC9 expressa fortemente DDX3X e exibiu CSC-fenótipos como

As evidências acumuladas demonstrou que quase todas as células de tumor exibem variabilidade notável em fenótipos com base na heterogeneidade genética e epigenética [26]. Se DDX3X na verdade desempenha um papel na indução de um estado de células estaminais-like e sinal de comutação, uma população menor de DDX3X-superexpressão células PC9 pais possam existir. Por conseguinte, uma vez que as células A-1 exibiram a tendência para proliferar de uma forma independente de ancoragem, examinámos uma subpopulação pequena de células não aderentes PC9. Surpreendentemente, esta população não aderente de células parentais PC9 exibiu quase o mesmo nível de expressão DDX3X como células A-1 (Fig. 5a). Foi examinada a expressão de ALDH, um marcador CSC putativo (Fig. 5B). Apesar de apenas 0,47% de células aderentes PC9 expressa ALDH, 23,0% de células não aderentes exibiram actividade de ALDH. Por outro lado, 15,8% de células aderentes a-1 e 23,8% de células não aderentes a-1 foram ALDEFLUOR positivo. É provável que as células ALDEFLUOR-positivos existem apenas na população de células que expressam fortemente DDX3X. Além disso, a maioria das células não aderentes, mas não células aderentes exibiram forte expressão de CD44, um outro marcador de CSC putativo (Fig. 5C).

. Immunoblotting análise de expressão em células DDX3X PC9 parentais aderentes e não aderentes e células A-1. B. ALDEFLUOR ensaios foram realizados por células suspensão em tampão de ensaio contendo 1,5 uM Aldefluor BODIPY-aminoacetaldeído, um substrato de ALDH. As células foram então incubadas durante 45 min a 37 ° C e analisadas de acordo com as instruções do fabricante. C. Análise de citometria de fluxo de células PC9 parentais aderentes e não aderentes e células A-1. Histgrams indicam a expressão de CD44. As linhas ponteadas indicam controlo de isotipo, linhas finas indicam células aderentes, e as linhas grossas indicam células não aderentes. D. citometria de fluxo de células não fraccionadas, aderentes e não aderentes derivadas de células progenitoras e células PC9 A-1. Eixo dos X indica a intensidade de fluorescência de E-caderina, e o eixo Y indica a intensidade de fluorescência de N-caderina. E. Análise de citometria de fluxo de células não aderentes isoladas de PC9 parental e células A-1. histograma mostram expressão de vimentina em células de N-caderina + sensíveis.

Foi demonstrado que durante EMT, E-caderina é regulada negativamente, enquanto caderina neuronal (N-caderina) é regulada positivamente, referido como caderina e interruptor que promove o interruptor caderina invasão e metástases de cancro por meio de aumento da motilidade das células de cancro [27] – [30]. Assim, examinamos se interruptor caderina E /N foi induzida por DDX3X. Como mostrado na Fig. 5D, 15,5% de células não fraccionadas a-1 e 7,0% de células parentais não fraccionadas PC9 expressa N-caderina, assim, é provável que a expressão de N-caderina foi promovido por DDX3X. As células aderentes foram E-caderina único positivo e N-caderina

+ células pertencia a população de células não-aderentes. Curiosamente, 43,1% de células parentais não aderentes PC9 expressas tanto de E-caderina e N-caderina e 29,2% era de E-caderina

-N-caderina

+. Parece que o interruptor caderina incompleta ocorreu em células PC9 parentais. Em contraste, 42,3% das células não aderentes A-1 foram N-caderina único positiva e 10,8% era E-caderina

+ N-caderina

+. 21,7% dos fechado N-caderina

+ em células PC9 parentais, e 47,7% dos fechado N-caderina

+ em células A-1 vimentina expressa (Fig. 5E). Tomados em conjunto, uma subpopulação única que estava passando por EMT existia em células não aderentes de ambos A-1 e parental PC9 e que DDX3X facilitado E interruptor de caderina /N seguido por expressão de vimentina.

população de células não aderentes de PC9 parental faltava EGFR sinalização e exibiram resistência ao EGFR-TKI

Como se mostra na Fig. 6A, todas as células não aderentes faltava fosforilação do EGFR como células A-1. Além disso, a população de células não aderentes foi PC9 parentais resistentes ao EGFR erlotinib-TKI, semelhante ao aderente de células A-1 (Fig. 6B). Como as células não aderentes podem incluir células mortas, examinámos as percentagens de células a morrer com coloração de PI. FIG. 6C mostra que 28,5% de células PC9 parentais aderentes estavam a morrer depois de 72 h de tratamento erlotinib. Em contraste, a percentagem de células que morrem foi apenas de 14,1% em células não aderentes PC9. A seguir, as células cultivadas PC9 parental na presença de concentrações crescentes de erlotinib (até 3000 nM) para se obter células resistentes. Após a exposição de 3 meses para erlotinib, estabelecemos células R-PC9, que eram capazes de sobreviver em CM contendo 3000 nM erlotinib. FIG. 7A mostra que as células de R-PC9 foram significativamente resistente ao erlotinib. células de R-PC9 exibiram forte expressão de DDX3X (Fig. 7B). Coletivamente, os nossos dados demonstraram que as células PC9 parentais continha uma população menor exibindo forte expressão de DDX3X, fenótipos CSC-like, a EMT e resistência primária ao EGFR-TKI. A população menor pode sobreviver tratamento a longo com EGFR-TKI.

A. Immunoblotting análise do EGFR e fosfo-EGFR (Tyr1068) em células de câncer de aderentes e não aderentes. B. ensaios MTT foram usadas para medir a proliferação de células em células aderentes e não aderentes PC9 e A-1 as células seguintes erlotinib. Os dados são apresentados como a média ± DP. As amostras foram preparadas em triplicado. **

P Art 0,001. C. citometria de fluxo com coloração de PI foi usado para examinar células que morrem.

A. ensaios MTT foram usadas para determinar a proliferação de células aderentes e não aderentes PC9, bem como células de R-PC9, que foram obtidas por exposição de longa duração a concentrações crescentes de erlotinib. Os dados são apresentados como a média ± DP. As amostras foram preparadas em triplicado. * Indica diferenças significativas por two-way ANOVA e análise ad hoc. B. A análise de imunotransferência de expressão DDX3X em células PC9 parentais e células R-PC9.

β-catenina sinalização induzida por DDX3X

Embora as células A-1 faltou fosforilação de EGFR e sinalização subsequente , eles mostraram quase a mesma taxa de proliferação de células PC9 parentais

in vitro

. É provável que a sinalização do EGFR é substituído por outras vias de sinalização. As células-tronco utilizam vias de sinalização específicas, como Wnt /β-catenina ou hedgehog, em vez de tipo receptor de sinalização da tirosina quinase; Além disso, um certo subconjunto de manutenção CSC é dependente da via Wnt /β-catenina sinalização [31], [32]. DDX3X é necessária para a sinalização de Wnt /β-catenina, e mutado DDX3X tem mostrado desempenhar um papel na sinalização β-catenina patogenicidade em meduloblastoma [13], [33]. Portanto, o próximo analisados ​​sinalização de Wnt /β-catenina. TCF /LEF ensaio de repórter de luciferase mostrou que a sinalização de β-catenina foi promovida em células A-1 na presença ou ausência de Wnt3a (Fig. S1E).

Discussão

Neste estudo, nós investigou o papel da DDX3X na aquisição de resistência EGFR-TKI em células de câncer de pulmão. Nossos resultados revelaram que as células cancerosas com mutações de activação de EGFR poderia desligar sinalização de EGFR e perder EGFR vício sinal. resíduos de Tyr em EGFR das células de cancro do pulmão que sobre-expressam DDX3X não foram fosforilados, mesmo na presença de EGF. Esta foi uma descoberta inesperada e surpreendente, pois as mutações de activação de EGFR fazer com que o domínio de cinase de EGFR para permanecer na conformação activa, mesmo na ausência de ligandos, o que resulta na fosforilação de resíduos de tirosina nos segmentos da cauda C-terminal. O mecanismo preciso através do qual DDX3X inibe a fosforilação de resíduos de tirosina em EGFR não é clara. No entanto, a inibição da actividade da tirosina quinase é improvável que seja envolvido porque não apenas os resíduos de tirosina submetido a auto-fosforilação em segmentos da cauda C-terminal, mas também Tyr845 no domínio de cinase, que também pode ser fosforilada por Src, não foram fosforilados. A observação de que DDX3X mediada sinalização de Wnt /β-catenina é consistente com um recente relatório descreve a estimulação de Wnt-dependente de caseína-quinase 1 e promoção da fosforilação dishevelled por DDX3X em células de mamíferos [33]. Além disso, todo-exome análises DDX3X identificado como um componente de sinalização β-catenina patogénico, em meduloblastoma Wnt subgrupo [12] – [14]. Tomados em conjunto, os nossos dados actuais e estes estudos anteriores indicam que DDX3X é um componente crítico da via de sinalização /β-catenina Wnt e que a comutação de sinal de EGFR vício de sinalização de p-catenina pode ser induzida por DDX3X em células de cancro de pulmão albergando EGFR- mutações de activação.

DDX3X é uma helicase de ARN que é altamente conservada de leveduras para humanos e modulam a estrutura de ARN [34]. Assim, as helicases de RNA são acreditados para participar na transcrição do ARN, splicing, e tradução. DDX3 humano tem dois genes estreitamente relacionados, DDX3X e DDX3Y, que são codificados nos cromossomas X e Y, respectivamente. DDX3Y é expresso exclusivamente em células germinativas e é essencial para a espermatogénese [35]. Curiosamente, descobrimos que DDX3X induzida aumento de células cancerosas acompanhados por fenótipos tronco-like, como expressão regulada de Sox2, ALDH e CD44. Além disso, a proliferação independente de ancoragem, caderina mudança de E-caderina para N-caderina, expressão de vimentina, foi observada nestas células. Consistente com nossos achados, tumores abrigando upregulated DDX3X foram relatados para exibir propriedades tronco-like e /ou evidência da EMT no melanoma, cancro da mama e leucemia [8], [10], [12], [36]. Especialmente, meduloblastoma, em que DDX3X tem sido mostrado que actua como um gene controlador, é semelhante em aparência e potencial de diferenciação a células estaminais e progenitoras neurais. No entanto, é única conclusão que as células de adenocarcinoma de pulmão não tratada continha uma subpopulação expressar fortemente DDX3X e acompanhado por comutação de sinais, fenótipos CSC-like, e evidência da EMT.

Em resumo, este estudo forneceu a primeira demonstração que DDX3X perda induzida do vício sinal de EGFR resultando em resistência ao EGFR-TKI, acompanhado por propriedades CSC-like e ocorrência da EMT em células de câncer de pulmão que abrigam a mutação de activação de EGFR. Nossos resultados mostraram que a inibição da DDX3X pode ser uma terapia promissora para superar os mecanismos de EGFR-TKI-resistência primária com base em intratumoral heterogeneidade e para alcançar uma cura em pacientes com câncer de pulmão albergando mutações de activação de EGFR.

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