Abstract

resistência das células do Câncer para anoikis impulsionados pela sinalização aberrante sustentada pelo microambiente do tumor confere alto potencial invasivo e resistência terapêutica. Recentemente, gerou um novo derivado baseado em quinazolina chumbo Doxazosin®, DZ-50, o que prejudica o crescimento de tumores e metástases através anoikis. ampla análise do genoma na linha celular de cancro da próstata humana DU-145 identificados alvos downregulated primárias de DZ-50, incluindo os genes envolvidos na integridade de adesão focal (fibronectina, integrina α6 e talina), a formação da junção estanque (claudina-11), bem como factor de crescimento semelhante à insulina de ligação proteína 3 (IGFBP-3) e a trombospondina angiogénese modulador 1 (TSP-1). A microscopia confocal demonstrou perturbação estrutural de ambas as adesões focais e junções apertadas pela regulação negativa destes genes alvos, resultando em diminuição da sobrevivência celular, migração e adesão à matriz extracelular (ECM) componentes em duas linhas celulares de cancro humano da próstata independente de androgénios, PC-3 e DU-145. Estabilização das interacções célula-ECM por sobre-expressão de talina-1 e /ou células para um ambiente rico em fibronectina expondo atenuado o efeito de DZ-50. A perda da expressão do efectores de sinalização intracelular de adesão focal talina-1 e integrina ligada quinase (ILK) sensibilizada para o cancro da próstata humano anoikis. Nossos resultados sugerem que DZ-50 exerce o seu efeito antitumoral, visando as interacções-chave funcionais intercelulares, adesões focais e junções apertadas, apoiando o significado terapêutico deste agente para o tratamento de câncer de próstata avançado

Citation:. Hensley PJ , Desiniotis a, Wang C, Stromberg a, Chen CS, Kyprianou N (2014) Novel farmacológico Segmentação de junções apertadas e focal aderências em células cancerosas da próstata. PLoS ONE 9 (1): e86238. doi: 10.1371 /journal.pone.0086238

Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de novembro de 2013; Aceito: 12 de dezembro de 2013; Publicação: 31 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Hensley et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Institutes of Health, R01-GRANT00491815 e pelo Centro Nacional de pesquisa de Recursos e do Centro Nacional para a Promoção da Ciência translacional, UL1RR033173. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Por favor, note que os autores declararam o seguinte COI: Como o autor correspondente, Natasha Kyprianou afirma que ela serve como um editor de Academic de PLOS ONE Editorial Board, mas confirma que isso não altera sua adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de partilha, conforme detalhado no guia para os autores. Além disso, existe uma patente relativa a pertinente material neste artigo, isto é, a geração da nova droga, DZ-50, pelos autores Chen e Dr. Kyprianou. Eles declaram esta patente, com o nome: “novos agentes e métodos da sua utilização na segmentação do cancro da próstata antitumoral,” University of Kentucky /Ohio State University Invenção Joint, Patente EUA S.N. 12 /323.073. (Ching-Shih Chen e Natasha Kyprianou, coinventors.) Os autores confirmam que a propriedade /invenção desta patente não altera a sua adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de partilha, conforme descrito no guia para autores.

Introdução

o câncer de próstata é o segundo câncer mais comum entre os homens, com 206,640 homens diagnosticados e 28.088 morrem de câncer de próstata em 2012 [1]. segmentação quimioterápico do andrógeno eixo no cancro da próstata sinalização tem contribuído para a melhor taxa de sobrevivência de câncer em homens. No entanto, um subconjunto de pacientes tornam-se refractários à terapia de ablação de androgénios ao não apoptose e na progressão do cancro da próstata resistentes à castração (CRPC) [2]. células epiteliais glandulares prostáticas têm uma necessidade intrínseca de sinais de sobrevivência, transmitidas por meio de matriz (ECM) interações intercelulares e célula-extracelular. adesões focais são vitais tanto para a sinalização dependente de contato normal por células normais e invasão, migração e metástase de células malignas.

O trabalho deste laboratório identificaram nova ação anti-tumoral exercida pelas drogas classicamente usados ​​para o tratamento de benigna hiperplasia prostática (quinazolina-α antagonistas

1-adrenoceptores) através da indução da apoptose em cascata extrínseca (activação de receptor de morte, a clivagem de caspase-8 e a inibição da sobrevivência de sinalização AKT) [3], [4], [5]. optimização estrutural conduziu à geração de novos compostos capazes de indução anoikis e inibição da angiogénese [6], [7]. Anoikis, morte celular apoptótica dela decorrente insuficientes interacções célula-ECM, é um componente crítico da angiogénese e metástase [8]. células tumorais agressivas subverter esse mecanismo, mantendo a sobrevivência através da difusão e semeadura em órgãos distantes [9]. resistência anoikis está intimamente ligada ao aumento do potencial metastático em muitas malignidades humanas, incluindo cancro da próstata [10], carcinoma de células renais [11], o cancro da mama [12], bem como tumores de origem mesenquimal [13].

metástase exige a interrupção das interacções celulares com o microambiente do tumor, aumento da capacidade de migração e invasão e a capacidade de superar os sinais pró-apoptóticos, transmitidas por meio intercelulares e célula-ECM interacções diminuídas [14]. O ECM compreende uma diversificada rede de citocinas que impactam crescimento celular, motilidade e angiogénese, que podem ser disponibilizados para uso por digestão enzimática celular e remodelação [15]. integrinas transmembranares são caracterizadas por uma sinalização bidireccional. A oligomerização de proteínas de integrina sobre um substrato ECM induz alterações conformacionais, que são transmitidas através da membrana plasmática para modular a afinidade de efectores intracelulares de sinalização citosólicas nas caudas de integrina [16]. Os agregados de proteínas, conhecidos coletivamente como o complexo de adesão focal (FAC), incluem proteínas de ligação de actina (Talin-1, vinculin, vimentina, paxilina, filamina, ect.) Que estabilizam o citoesqueleto e quinases (quinase de adesão focal [FAK], integrina quinase -ligada [ILK], e SRC não-receptor de tirosina-cinase), que se propagam de sinalização intracelular para o núcleo. Este mediada por integrina “outside-in” controlos de sinalização em cascata processos vitais para a função celular e o crescimento como a progressão do ciclo celular e diferenciação [17].

Como a rede do citoesqueleto de actina é submetido a remodelação dinâmica /organização, as induz integrina agrupamento “inside-out” de sinalização para aumentar a afinidade das integrinas para a ECM, que cria efectivamente uma adesão focal [18]. Após insuficientes interacções integrina-ECM, as células de regular negativamente os membros da família de anti-apoptótica de Bcl-2 e regulam positivamente o ligando de Fas (FasL), induzindo anoikis através da via extrínseca de apoptose [19], [20]. Talin-1 contribui funcionalmente à anoikis-resistência e metástase do câncer de próstata, aumentando a formação de adesão focal e Akt-sobrevivência sinalizando. Recentemente, demonstrou uma correlação significativa entre Talin-1 superexpressão e metástase em um rato modelo de desenvolvimento de neoplasias de próstata e na progressão do cancro da próstata humana [10].

Exploração farmacológica do doxazosin® antagonista α1-adrenérgicos levou à geração de novos compostos à base de quinazolina, com o agente de ligação, DZ-50, tendo efeitos indutores de anoikis potentes contra células cancerosas [6]. DZ-50 suprime o crescimento de xenoenxertos de cancro da próstata humana e inibe a sua potencial metastático

in vivo

, ao alterar a angiogênese, migração e invasão [7] através visando a adesão focal eixo [11] sinalização. O presente estudo investigou os alvos celulares de DZ-50 em células cancerosas humanas da próstata andrógeno-independente. análise de todo o genoma identificaram efetores críticos de adesão focal e interações junção apertados que são visados ​​pelo novo agente quinazolina.

Materiais e Métodos

linhas celulares e Reagentes

O andrógeno linhas celulares de cancro humano da próstata independentes de PC-3 e DU-145 foram obtidas a partir da American Type Tissue Culture Recolha e cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) contendo soro fetal de bovino 10% (Invitrogen) e antibióticos (PenicilinG /estreptomicina, 50 ug /mL). As células DU-145 foram transfectadas com pEGFP ou talina-1 plasmídeos e clonado sob selecção de G418 (Life Technologies Bethesda Research Laboratories). Para silenciamento talina-1 expressão, o vector de shRNA talina-1 (GIPZ shRNAmir talina-1) foi utilizado de Open Biosystems (Hunsville, AL) e shRNA talin1 DU-145 células de cancro da próstata foram seleccionados sob a puromicina. populações policlonais foram reunidas sob selecção, e as linhas de células estáveis ​​foram caracterizadas por imunotransferência. Células PC-3 foram estavelmente transfectadas com o vector contendo pTRIPZ TRE-ILK shRNA (Thermo Scientific). PC-3 shILK células foram induzidas com 2 ug /ml de doxiciclina (Enzo Life Sciences) para dois dias. DZ-50, um derivado de doxazosina de primeira geração (Shaw et ai, 2004;.. Garrison et al, 2007), foi utilizado a uma concentração de 5 uM dissolvidos em DMSO para todos os tratamentos. DMSO estéril foi utilizado para controle de amostras /não tratados.

Viabilidade Celular Ensaio

A viabilidade celular foi avaliada após o tratamento com 5 mM DZ-50 usando o MTT colorimétrico (3- [4,5-dimetiltiazol – 2-il] -2,5- difeniltetrazólio) ensaio (1 mg /mL de MTT em PBS), e quantificadas usando uma medição espectrofotométrica. A análise estatística de 3 experiências independentes, cada uma realizada em triplicado, está expressa em relação ao controlo não tratado.

A migração celular Ensaio

ferimento foi infligido utilizando uma ponta de pipeta estéril, em monocamadas de células confluentes em 6- placas de poços. Após incubação durante 12-48 horas na presença de DZ-50 (5 uM), as áreas feridas foram examinadas por microscopia de luz (Axiovert 10, Zeiss). As células que migram para as áreas feridas foram contadas sob um microscópio. potencial de migração foi determinada como a média do número de células em cada três de alta potência aleatório (400 ×) Campos /poço. Os dados numéricos são obtidos a partir de três experiências independentes realizadas em triplicado, e é expressa em relação aos controlos não tratados.

Ensaio de Adesão Celular

de culturas PC-3 e DU-145 foram tratadas sublinhas (24 horas) com DZ-50 (5 ^ M) e colhidas. As células (1 x 10

5 /cavidade) foram adicionadas a placas de 6 poços revestidas com fibronectina (5 ug /ml, BD Biosciences) e depois de uma incubação de 30 minutos a 37 ° C, as células foram fixadas com 100% ( v /v) de metanol frio e submetido a análise de imagem. O número de células aderentes foi contado em três campos representativos /poço (400 ×). Os dados numéricos representam a média de três experiências independentes realizadas em triplicado e são expressos em relação aos controlos não tratados.

Análise Western Blot

células de cancro da próstata humano, DU-145 e PC-3, foram tratados com DZ-50 (5 uM) para sequencial períodos de tempo e os lisados ​​celulares foram gerados em tampão de lise (150 mmol /L de NaCl, 50 mmol /L de Tris (pH 8,0), 0,5% de ácido desoxicólico, 1% de NP40 com 1 mmol /L fenil-sulfonil fluoreto de metilo, pH 7,4). As amostras de proteína foram sujeitos a SDS-PAGE e transferidos para membranas de Hybond-C (Amersham Pharmacia Biotechnology). As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários específicos: Akt (Cell Signaling Technology), fosforilado Akt Sor 473 (Cell Signaling Technology), a GSK-3β (Cell Signaling Technology), fosforilado a GSK Sor 9 (Cell Signaling Technology), ILK-1 (Cell Signaling Technology), ZO-1 (Invitrogen), Claudina-11 (Santa Cruz Biotechnology), Talin-1 (Millipore) ou actina (Calbiochem). A seguir à incubação com o anticorpo primário correspondente, as membranas foram expostas a anticorpos secundários marcados com peroxidase de rábano e o sinal foi detectado com SuperSignal Oeste Dura substrato ampliado Duração (Pierce) e expostos em película de raios-X. A análise densitométrica foi efectuada utilizando o software ImageJ e os valores são expressos em relação aos controlos.

Gene (qRT-PCR) Análise

O ARN foi isolado a partir de lisados ​​celulares utilizando TRIzol Reagent (Ambion) e RNA Ligação pura Mini Kit (Invitrogen) de acordo com o fabricante. Após a homogeneização e a separação de fases por centrifugação (12000 g, 4 ° C), o ARN foi precipitado com isopropanol. As amostras foram centrifugadas (12.000 g, 4 ° C) e o ADNc foi sintetizado utilizando ARN (1 ug) e o sistema de transcrição reversa (Promega). análise de arranjo de DNA foi realizado na Universidade de Kentucky Facility Microarray Núcleo usando Affymetrix GeneChip Technology. As transcrições foram avaliados pela ABI 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems Inc.); cada tratamento (5 uM DZ-50, 9 horas) foi realizada em triplicado.

Para a análise de RT-PCR, o RNA (1 ug) foi submetido a transcrição reversa utilizando o sistema de transcrição reversa (Promega). Os seguintes iniciadores foram concebidos (Sigma) para o sistema de verde quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) SYBR: Fibronectina-1 (F: 5′-TCATGAGGCAACGTGTTATGATG-3 ‘, R: 5′- CGAGATATTCCTTCTGCCACTGT-3′), TALIN- 1, (F: 5’-GCAGAAGGGAGAGCGTAAGATC-3 ‘, R: 5′-TGAGAGAACGGGCTAGCTTCA-3′), integrina α6 (F: 5’-CAGAAAGTGTGCATGGAGGAAA-3 ‘, R: 5′- TGGGAATGGGACGCAGTT-3′), e ZO-1 (F: 5’-GGAGCTGCGCTTACCACACT-3 ‘, R: 5′- TTTGCTCCAACGAGATAATTTGG-3’). Os seguintes iniciadores foram obtidos para o sistema de TaqMan qRT-PCR (Invitrogen): 18 s RNA ribossomal (rRNA), trombospondina-1, IGF-BP3, Claudina-11, caracol. O ADNc foi utilizado para a análise de qRT-PCR de acordo com a respectiva SYBR Green e protocolos TaqMan (Bio-Rad). Para as experiências de qRT-PCR, cada amostra foi analisada em triplicado e os dados representam os valores médios de três experiências independentes. Os dados numéricos para os níveis de transcritos foram normalizados para 18 s rRNA em controlos e expressa em relação aos controlos não tratados.

Análise por imunofluorescência

Células plaqueadas em lâminas com câmara 4 poços revestidas com fibronectina (5 ug /ml , BD Biosciences) foram expostos a tratamento DZ-50 (5 ^ M) durante 12 horas. As células foram depois fixadas em 100% (v /v) de metanol, e depois de bloquear a 4 ° C (5% NGS, 0,3% de Triton X), foram expostas ao anticorpo primário (4 ° C, durante a noite). Foram utilizados os anticorpos específicos seguintes: ILK-1 (Cell Signaling Technology), ZO-1 (Invitrogen), Claudina-11 (Santa Cruz Biotechnology), Caracol (Cell Signaling Technology), Talin (Millipore). As células foram então incubadas com anticorpo secundário conjugado com fluorocromo (Invitrogen) (2 horas, temperatura ambiente) e submetido a microscopia confocal utilizando uma v1.21 Olympus FV1000 confocal microscópio. ea versão do software FV10-ASW 3.1.

Análise Microarray

shTalin ou vetoriais DU-145 células cancerosas humanas da próstata foram tratados com DZ-50. As amostras de RNA a partir de células antes ou depois (9 h) tratamento foram apresentadas para a instalação de núcleo Universidade de Kentucky Microarray para análise em Affymetrix Human Gene 1.0 matrizes ST (Affymetrix, Santa Clara, CA). O experimento em cada condição foi realizada em duplicado.

Análise Estatística

dados de microarranjos foram normalizados usando RMA e analisadas usando dois sentidos análise de variância (ANOVA) modelos, com o genótipo (shTalin ou vector) e de tratamento (antes ou depois) como os dois factores. Contrastes foram gerados para avaliar mudanças na expressão de mRNA entre tratado versus não tratada em células vetor. taxa de falsos descoberta (FDR) e os valores de Q associadas foram calculadas utilizando o método de ref. genes diferencialmente expressos foram determinados com base em FDR 20% e dobre as alterações 1,5. As análises estatísticas para todos os dados a partir de outras experiências foram realizadas com base em uma-amostra ou amostras de dois testes t como apropriado. Na P 0,05 valores foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Novel quinazolina DZ-50 induz o cancro da próstata celular anoikis

O efeito anoikis indutores do composto quanazoline chumbo DZ. -50 foi investigada em linhas celulares de cancro de próstata humanas variavelmente expressando as proteínas FAC, talina-1 e ILK. Transfecção estável de células DU-145 resultou em knockdown da talina (DU-145 shTalin) e a sobre-expressão da talina (DU-145 Talin +) (Figura 1, painel A). As células PC-3 que expressam um vector indutível shILK demonstrado downregulation eficaz de ILK após indução com doxiciclina durante 48 horas (figura 1, painel A). Houve uma diminuição dependente do tempo na viabilidade celular em resposta a DZ-50 (figura 1, painel B). A perda da expressão de ILK e talina em DU-145 células de cancro da próstata PC-3 e, respectivamente, resultou no aumento da sensibilidade a DZ-50, enquanto que a sobre-expressão suprimida talina anoikis. Os dados no painel C (Fig. 1) mostram que, em resposta a DZ-50, da próstata migração Ell cancro é significativamente aumentada. Perda de qualquer ILK (células PC-3), ou a talina (células DU-145), inibiu a migração de células, enquanto melhorado ainda mais o efeito de DZ-50. Perda de qualquer ou de ILK talina independentemente levou a uma redução significativa na adesão celular de fibronectina (Figura 1, painel D).

Painel A, direita, Western blot mostrando que shILK transfectantes de PC-3 de células exibem perda total de ILK-1 a expressão da proteína em relação a células de controlo do vector após indução com doxiciclina (48 horas). À esquerda, células DU-145, em que a talina foi silêncio (shTalin) ou sobre-expressos (Talin +), exibem redução significativa ou a sobre-expressão marcada dos níveis de proteína talina, respectivamente, em relação a células DU-145 parentais. Painel B, 50-DZ tratamento conduz a uma diminuição significativa da viabilidade das células do cancro da próstata de um modo dependente do tempo. Perda de ILK1 aumenta a perda induzida DZ-50 da viabilidade celular; Em contraste talina sobre-expressão confere resistência a morte celular induzida DZ-50. Painel C, DZ-50 reduz significativamente a migração de células de cancro da próstata. A perda de resultados talina em uma redução significativa de migração de células de cancro da próstata em comparação com controlo parental células DU-145. Em resposta a DZ-50, talina superexpressão restaura a capacidade migratória de células para os níveis de células não tratadas. Painel D, perda funcional de ILK em células PC-3 de cancro da próstata e a talina perda de células DU-145 prejudica significativamente a capacidade das respectivas células de cancro da próstata para aderir à fibronectina (ECM). Talina superexpressão aumenta marcadamente a adesão de células de cancro da próstata para a fibronectina, em comparação com células DU-145 shTalin parental DU-145 e. A significância estatística foi fixado em * p . 0,05

identificação de alvos moleculares de chumbo quinazolina

Genome-wide análise da expressão gênica na linha de células de câncer de próstata humana DU-145 foi utilizado para identificar alvos primários de DZ-50 (Fig. 2). O mapa de calor a partir da análise do gene matriz após o tratamento de células de cancro da próstata com DZ-50 (para 9 horas) é mostrado na Figura 2 (painel A). DZ-50 resultou em uma regulação baixa significativa de genes que codificam proteínas associadas da membrana plasmática, incluindo reguladores de ECM (

fibronectina

e

integrina-α

6

) e junções apertadas (

claudina-11

), factor de crescimento semelhante à insulina proteína 3 (ligação

IGFBP-3

), bem como o mediador de angiogénese trombospondina 1 (

TSP-1