Abstract

A proteína motora cinesina proteínas da superfamília (KIFS) estão envolvidos na progressão do cancro. O esgotamento de uma das KIFS, KIF14, pode retardar a passagem da metafase-a-anafase, resultando em um estado binucleadas, o que aumenta a progressão do tumor; No entanto, a correlação exata entre KIF14 e progressão do câncer permanece ambígua. Neste estudo, usando a perda de heterozigose e matriz analisa hibridização genômica comparativa, observou-se uma perda de 30% nas regiões circundantes KIF14 no 1T cromossomo em adenocarcinomas pulmonares. Além disso, os níveis de expressão de proteína de KIF14 em adenocarcinomas do pulmão 122 também indicou que aproximadamente 30% dos adenocarcinomas apresentaram KIF14 regulação negativa em comparação com a expressão nas células epiteliais brônquicas de contrapartes normais adjacentes. Além disso, a redução da expressão de mRNA ou proteínas KIF14 foi correlacionada com a sobrevivência pobre em geral (P = 0,0158 e 0,0001, respectivamente), e os níveis de proteína também estavam inversamente correlacionados com metástases (P 0,0001). A superexpressão de KIF14 em células de adenocarcinoma de pulmão inibiu o crescimento independente de ancoragem

in vitro Comprar e xenoenxerto crescimento do tumor

in vivo

. A sobre-expressão e silenciamento de KIF14 também inibiu ou reforçada a migração de células cancerosas, invasão e adesão ao extracelular proteínas da matriz laminina e colágeno IV. Além disso, detectamos as moléculas de adesão caderina 11 (CDH11) e molécula de adesão de células de melanoma (MCAM) como carga a KIF14. A sobre-expressão e silenciamento de KIF14 aumentada ou reduzida do recrutamento de CDH11 na fracção de membrana, sugerindo que KIF14 pode actuar através de moléculas de adesão de recrutamento para a membrana celular e modulação da adesão celular, migração e propriedades invasivas. Assim, KIF14 pode inibir o crescimento tumoral e metástases de cancro em adenocarcinomas do pulmão

citação:. Hung P-F, Hong t-H, Hsu Y-C, Chen H-Y, Chang Y-G, Wu C-T, et al. (2013) O KIF14 Protein Motor inibe o crescimento tumoral e metástase de câncer no pulmão Adenocarcinoma. PLoS ONE 8 (4): e61664. doi: 10.1371 /journal.pone.0061664

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Outubro, 2012; Aceito: 12 de março de 2013; Publicação: 23 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada através de bolsas do Conselho Nacional de Ciência da República da China (NSC98-2628-B-002-086-MY3, NSC100-2321-B-002-071 e NSC100-3112-B-006-005) e Nacional Taiwan University (NTU101R7601-2 e NTU102R7601-2). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cinesina (KIF) consiste superfamília de proteínas do motor que organelos de transporte, proteínas e ARNm em uma adenosina-5′-trifosfato (ATP) – e forma dependente da microtúbulos [1], [2]. Há mais de 45 membros da superfamília KIF, que são divididas em subfamílias 13 de acordo com a sua orientação, e domínio função [3]. KIF14, um membro da família da cinesina-3, contém um motor e um domínio associada-forkhead, e esta proteína desempenha um papel importante na citocinese e na segregação, congression e alinhamento de cromossomas [4] – [6]. Depleção de KIF14 pode causar um atraso de tempo na transição metafase-a-anafase, inibir a citocinese e produzir um estado binucleadas [7], [8]. Outros estudos têm mostrado que KIF14 pode promover a citocinese eficiente através de interacções com citron quinase (CIK) e o regulador de proteína de citocinese 1 (PRC1) [7].

Citocinese representa a fase final do ciclo celular em que a duas células filhas completamente distinta [9]. A evidência crescente sugere que a citocinese aberrante pode gerar células tetraplóides instáveis, levando a aneuploidia, que eventualmente se desenvolve em carcinogénese [9] – [11]. Muitos dos componentes que regulam a citocinese foram identificados, e algumas moléculas, incluindo KIFS, foram claramente associados com o cancro. Por exemplo, KIF2 e KIF15 foram identificados como antigénios de tumor no cancro da mama [12], [13]; KIF13A é sobre-expresso em alguns retinoblastomas [14]; KIF20A é regulado para cima em câncer pancreático [15]; KIF3 e KIF4 foram identificados como genes supressores de tumores em cancro gástrico [16], [17]; e a expressão de KIF10 é reduzida no carcinoma hepatocelular [18]. Além disso, tem sido relatado que alguns membros da família, incluindo KIF KIF3, KIF4 e KIF22, têm um papel na tumorigénese em conflito [16], [17], [19] – [23].

O cancro do pulmão é a causa mais comum de morte por câncer, especialmente na Ásia, e as contas por 17% das mortes totais de câncer em todo o mundo [24], [25]. Estudos recentes têm-se centrado no papel da cinesina proteínas, tais como KIF3, KIF5B e KIF14, na progressão do cancro de pulmão; No entanto, os mecanismos detalhados subjacentes as funções destas proteínas permanecem incertos [16], [26] – [28]. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar o papel da cinesina proteínas do motor no adenocarcinoma de pulmão.

Neste estudo, foi avaliado o papel potencial da KIF14 no adenocarcinoma de pulmão com perda de heterozigosidade (LOH) e matriz comparativa hibridização genômica (CGH) analisa de 138 adenocarcinomas pulmonares no 1T cromossomo, que é onde KIF14 está localizado. Além disso, nós também analisou a expressão da proteína de KIF14 em amostras de tecido de pacientes com adenocarcinoma de pulmão 122 usando coloração imuno-histoquímica. A expressão de mRNA e proteína KIF14 foram correlacionados com as taxas de sobrevida global e metástases nestes pacientes. Também dissecados o mecanismo molecular de KIF14, que medeia a supressão de invasão de células de cancro, migração e adesão. Estes resultados sugerem que KIF14 pode inibir o crescimento de tumores e metástases de câncer em adenocarcinoma de pulmão.

Resultados

Expression KIF14 em pacientes com câncer pulmonar

Para avaliar o papel potencial da cinesina no pulmão adenocarcinoma, primeiro analisou a frequência de LOH nos cromossomos utilizando marcadores microssatélites, e observou que LOH ocorreu entre os marcadores D1S1660 (40,0% LOH e 86,7% instabilidade de microssatélites (MI)) e D1S213 (31,6% LOH e 60,5% MI), que são localizado perto KIF14 no cromossoma 1q (Figura 1A). Para confirmar estes resultados, realizamos de alta densidade de arrayCGH em uma coorte independente de 138 adenocarcinomas do pulmão [29]. Os dados indicaram que cerca de 25% (22,5% e 26,8%) perda das duas sondas numa localização KIF14 e 5% (2,9% e 6,5%) Ganho ocorreu nos doentes (Figura 1B e Tabela 1).

(a) Perda de heterozigosidade (LOH) e microssatélites instabilidade (MI) analisa perto do local do KIF14 no adenocarcinoma pulmonar primária. Cromossomo 1 ideograma mostrando os marcadores microssatélites mapeadas no 1T de acordo com o banco de dados de localização; o número de paciente e porcentagem são indicados. (B) Os perfis de alteração número de cópias do cromossoma 1. A localização KIF14 é indicado dentro cromossomo 1q32.1. (C) O padrão de expressão de proteínas de KIF14 foi examinada usando imuno-histoquímica com anticorpos anti-KIF14 na mucosa brônquica (painel da esquerda) normais e amostras do tumor primário (média e painel da direita). ampliação original de 200 ×.

A seguir, examinou a expressão de KIF14 em amostras de tecido e tecidos normais adjacentes de 122 adenocarcinomas pulmonares utilizando imuno-histoquímica. A especificidade do anticorpo KIF14 foi confirmada através de competição KIF14 antigénio utilizando imunotransferência e imuno-histoquímica (Figura S1), e as características clínicas destes pacientes são resumidos na Tabela 2. Estes resultados mostraram que KIF14 foi fortemente expressa em células epiteliais brônquicas normais (Figura 1C ). Uma análise posterior indicou que 30,3% dos adenocarcinomas apresentaram KIF14 regulação negativa nos tumores, em comparação com as células epiteliais brônquicas em homólogos normais adjacentes e que 18,0% dos adenocarcinomas apresentaram uma expressão KIF14 mais elevada do que na mucosa brônquica normal (Tabela 1). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que KIF14 pode ter uma maior perda (~ 30%) do que o ganho (3-6%) em adenocarcinomas pulmonares.

baixa expressão de KIF14 foi associada com mau da sobrevivência global nos adenocarcinoma pulmonar pacientes

Para investigar se a expressão de KIF14 no adenocarcinoma de pulmão está correlacionada com os resultados clínicos, os níveis de mRNA de KIF14 em espécimes de tumor de doentes com adenocarcinoma do pulmão foram determinados 53 utilizando o reversa em tempo real quantitativa de polimerase de transcriptase reação em cadeia. As características clínicas destes pacientes estão resumidas na Tabela S1. Os pacientes com baixa expressão KIF14 apresentaram sobrevida global pior do que aqueles com expressão alta KIF14 (Figura 2A, P = 0,0158). Na análise multivariada Cox proporcional de regressão de risco indicou que a expressão KIF14 (hazard ratio [HR] = 0,341, 95% intervalo de confiança [CI] = 0,179-0,652; P = 0,0011) e estágio da doença (HR = CI 1.962, 95% = 1,311-2,936 ; P = 0,0010) foram fatores independentes associados à sobrevida global dos pacientes de adenocarcinoma pulmonar (Tabela S2)

(a) a expressão do mRNA Baixa KIF14 foi associado à sobrevida global pobre em pacientes com adenocarcinoma de pulmão.. Os níveis de ARNm KIF14 foram medidos utilizando em tempo real quantitativa de RT-PCR de amostras de tumor primário. O valor médio foi utilizado para dividir os pacientes em baixo (linha vermelha) e alta (linha azul) grupos de expressões KIF14 (classificação, P = 0,0158 log). a expressão da proteína (B) Baixo KIF14 foi associado à sobrevida global pobre em uma coorte independente de pacientes de adenocarcinoma de pulmão. Os pacientes foram divididos em dois grupos de acordo com a imunorreactividade dos anticorpos KIF14. O valor de corte foi de 70% em secções de tumor que mostram a imunorreactividade com os anticorpos. Kaplan-Meier foram utilizadas para estimar a sobrevivência global dos doentes com adenocarcinoma do pulmão de acordo com a expressão KIF14 (log rank, P 0,0001). Análise (C) Percentagem do estado metastático em grupos de expressão KIF14 altas e baixas. Os pacientes em ambos os grupos de expressão KIF14 alta e baixa foram ainda divididos com base na presença de metástases; e os números de cada subgrupo são apresentados como uma percentagem usando a análise estatística (teste de qui-quadrado, P 0,0001). (D) A expressão KIF14 no adenocarcinoma de pulmão humano previu a ocorrência de metástase. curvas livres de metástase de sobrevivência de 122 pacientes de adenocarcinoma de pulmão estratificados por baixo (linha vermelha) e expressão da proteína KIF14 (linha azul) de altura (log rank, P 0,0001)

Para estender a nossa análise à proteína. os níveis de expressão, utilizou-se imuno-histoquímica para examinar a expressão de KIF14 em espécimes de tumor de doentes com adenocarcinoma do pulmão 122 numa coorte independente. Consistente com os resultados anteriores, os pacientes com baixos níveis de expressão KIF14 tinha sobrevivência global mais pobre do que pacientes com níveis elevados de expressão KIF14 (P 0,0001; Figura 2B). As análises multivariada Cox de regressão de riscos proporcionais revelou que os fatores prognósticos independentes foram KIF14 expressão (HR = 0,37, 95% CI = ,18-,76; P = 0,0006) e estágio da doença (HR = 5,38, 95% CI = 2,82-9,88; P . 0,0001) (Tabela 3)

KIF14 foi negativamente correlacionada com Metástase em Adenocarcinoma pulmonar pacientes

Nós investigado se os níveis de expressão de proteína de KIF14 em amostras de tumor foram negativamente correlacionada com metástase do cancro em doentes. Os resultados de 122 adenocarcinomas pulmonares mostrou que 29 dos 63 pacientes com baixa expressão de proteína KIF14 teve metástase do câncer. No entanto, apenas 6 dos 59 pacientes com alta expressão KIF14 desenvolvido metástase do câncer (Figura 2C, P 0,0001). A estimativa de Kaplan-Meier de livre de metástases-sobrevivência também mostrou que pacientes com baixa expressão KIF14 teve uma taxa de sobrevida livre de metástases significativamente mais pobres do que aqueles com alta expressão KIF14 (Figura 2D, P 0,0001). Estes resultados indicam que KIF14 pode ser um supressor tumorigénico e metastático no adenocarcinoma de pulmão.

A sobre-expressão de KIF14 em células de pulmão de Adenocarcinoma inibiu o crescimento ancoragem independente in vitro e a formação de tumor de xenoenxerto

In vivo

as nossas observações suportam a hipótese de que KIF14 actua como um supressor tumoral no adenocarcinoma de pulmão. Para examinar esta hipótese ainda, primeiro avaliou a expressão da proteína KIF14 endógeno em low-invasiva CL1-0 e células de adenocarcinoma de pulmão CL1-5 alto-invasiva (Figura S2A). Observou-se que a proteína em células KIF14 CL1-0 foi maior do que em células CL1-5. Para examinar as mudanças na progressão do cancro

in vitro

e

in vivo

[30], nós estabelecemos linhas de células estáveis ​​Flag-tag-expressando KIF14 de células CL1-5 e KIF14-silenciados CL1- 0 células, e o padrão de expressão da proteína foi confirmada através de imunotransferência (Figura 3A e 3B). Na detecção da taxa de proliferação de células, observou-se nenhuma diferença significativa entre os controlos apenas com vector e as linhas celulares KIF14 que sobre-expressam (Figura 3C), mas a proliferação reduzida foi observada nas células silenciados-KIF14 em comparação com o controlo shLacZ (Figura 3D, P 0,0001). Com base na evidência que mostra que o crescimento celular independente de ancoragem pode ser associada com o potencial tumorigénico [31], [32], examinámos ainda mais o crescimento das linhas de células estáveis ​​em agar mole. Os resultados indicaram que o número de colónias formadas foi reduzida quando KIF14 foi sobre-expresso em células CL1-5 (Figura 3E) e aumentou quando KIF14 foi silenciada em CL1-0 células (Figura 3F). Subsequentemente, as linhas de células estáveis ​​foram transplantadas subcutaneamente em ratinhos SCID de explorar o efeito de KIF14 no crescimento do tumor

In vivo

. A superexpressão de KIF14 reduziu significativamente o crescimento do tumor em comparação com os controles (Figura 3G, certo; P = 0,0021). As imagens representativas de ratos CL1-5 /vectores e KIF14 # 2-inoculadas são mostrados (Figura 3G, esquerda).

As linhas celulares (A) que expressam constitutivamente KIF14 foram estabelecidos através da transfecção de pCMV-7.1- 3-3 × Bandeira-KIF14 em células CL1-5. As colónias únicas foram seleccionados utilizando geneticina, e a expressão da proteína KIF14 foi avaliada através de imunotransf erência com anticorpos anti-FLAG; actina foi utilizado como um controlo interno. O asterisco e ponta de seta indicam a banda não-específica e Flag-KIF14, respectivamente. (B) a expressão KIF14 foi derrubado em células CL1-0 usando infecção lentivírus shRNA. Após selecção com puromicina, durante duas semanas, os padrões de expressão de proteína KIF14 foram avaliadas através de imunotransf erência com anticorpos anti-KIF14; actina foi utilizado como um controlo interno. (C e D) Efeitos de KIF14 superexpressão e silenciamento na proliferação de células de tumor em cultura. O número de células foi calculado nos tempos indicados após o plantio. As barras de erro representam desvios padrão da média. Não foram observadas diferenças significativas nas taxas de proliferação entre as diferentes linhas de células de one-way análise de variância (C). (E e F) o crescimento ancoragem independente de linhas de células que sobre-expressam KIF14 -silencing e foram avaliados pela formação de colónias em agar mole. As barras de erro representam os desvios padrão de três experiências independentes realizadas em triplicado. crescimento do tumor sobre-expressão reduzida (L) KIF14. Os ratinhos foram injectados subcutaneamente nos flancos com CL1-5 /vector e células CL1-5 # 2 /KIF14. Painel esquerdo: fotografias final do tumor em 35 dias de injeção de pós-subcutâneo. Painel da direita: O volume médio de tumor em 35 dias de injeção de pós-subcutâneo foi calculado, e os animais foram posteriormente sacrificado. As barras representam as médias ± desvios-padrão dos seis ratos por grupo (one-way ANOVA, P = 0,0021).

Manipulação dos níveis de expressão KIF14 alterou a migração, invasão e adesão de Adenocarcinoma pulmonar linhas celulares

Uma vez que a expressão de KIF14 foi negativamente correlacionada com metástases em pacientes, o próximo investigou se KIF14 afetados metástase da célula cancerosa. Um ensaio de cicatrização da ferida foi utilizado para detectar a capacidade de migração de células que expressam KIF14. KIF14 expressão reduzida a migração de células CL1-5, ao passo que o knockdown da expressão da proteína em células KIF14 CL1-0 aumento da migração de células (todos com P 0,05; Figura 4A e 4B, esquerda). Para confirmar os resultados obtidos a partir das células CL, foram examinados os níveis de expressão KIF14 em outras linhas de células de adenocarcinoma do pulmão (Figura S2B) e sobre-expresso KIF14 em células A549 com baixo teor de proteína KIF14 endógena e silenciados KIF14 em células H1299 com os níveis de proteína de alta KIF14 relativos. As taxas de expressão de proteínas e a proliferação destas células KIF14 são mostrados na Figura S3. Resultados semelhantes foram obtidos utilizando linhas de células adicionais em comparação com as células Cl (todos com P 0,05; Figura 4A e 4B, direita).

(A) As células CL1-5 com células A549 e superexpressão KIF14 permanentes transitoriamente infectadas com lentivírus codificação de não-etiquetado de comprimento completo KIF14 foram analisadas quanto à capacidade migratória célula num ensaio de cicatrização de feridas. Os dados mostram o número de células migratórias, e os valores de P foram calculados em relação aos controles só de vetor usando Estudante de

t

-teste. ensaio de células CL1-0 e H1299 (B) cicatrização de feridas com silenciamento KIF14. O número de células migratórias, também foi calculado. (C e D) KIF14 superexpressão reduzida invasão celular. A capacidade de invasão KIF14 estável ou transientemente e infectadas linhas celulares KIF14-silenciados foi medida utilizando um ensaio de câmaras de Boyden modificada. As células invasoras foram indicados com coloração com iodeto de propídio e quantificada (n = 3). (E) KIF14 sobre-expressão aumentada de adesão celular. Uma placa de 96 poços foi revestida com laminina e colagénio IV. Um total de 3 × 10

4 células foram plaqueadas numa placa de 96 poços, incubadas a 37 ° C durante 1 hora e a actividade adesiva foi calculada usando cristal violar coloração. Alta absorção a 540 nm, indicou que a adesão celular aumentada.

A seguir, avaliou as propriedades invasivas dessas linhas celulares utilizando ensaios de câmara de Boyden modificadas. KIF14 superexpressão em CL1-5 e células A549 reduzida capacidade de invasão das células 11,6-64,9% em comparação com os controlos apenas por vectores (P 0,05; Figura 4C). Por outro lado, o knockdown de expressão KIF14 endógeno em células H1299 CL1-0 e maior capacidade invasiva de células 1,4 a 2,3 vezes (P 0,05; Figura 4D).

De um modo geral, a adesão celular é um mecanismo complexo envolvido na uma variedade de processos, incluindo migração celular e invasão [33]. Uma vez que estes dados indicam que a expressão de KIF14 poderia afectar as capacidades invasivas e migratórias de linhas celulares de adenocarcinoma de pulmão, ainda investigado se a adesão de células foi afectada após modulação KIF14. Consistente com nossa hipótese, os dados mostram que a sobre-expressão de KIF14 aumento da adesão à matriz extracelular de proteínas, laminina e colagénio IV, em ambas as células A549 e CL1-5; Além disso, silenciando KIF14 diminuição da aderência em ambas as células CL1-0 e H1299 (Figura 4E).

KIF14 Pode Regular o Recrutamento de Adhesive Molecule CDH11 para a membrana celular em linhas celulares de Adenocarcinoma pulmonar

Devido KIF14 inibiu a migração celular, invasão e aderência

in vitro

e câncer metástase

in vivo

, queríamos determinar se as mudanças na função motora em células pode levar a mudanças fisiológicas. Por isso, investigamos potencialmente associados parceiros de KIF14 utilizando a cadeia de banco de dados de interação 9.0 proteína (https://string.embl.de/) e identificou a duas proteínas associadas conhecidas, PRC1 e CIK [7], e duas proteínas adicionais, caderina 11 (CDH11) e a molécula de adesão de células de melanoma (MCAM), que foram potencialmente associado com KIF14 (Figura S4). Porque CDH11 e MCAM são moléculas de adesão importantes associados com tumorigênese e metástase [34], [35], a hipótese de que KIF14 pode afetar adesão e migração celular através destas moléculas de carga. Para confirmar esta hipótese, primeiro analisou se KIF14 poderia associar com CDH11 e MCAM usando co-imunoprecipitação. Os resultados mostraram que marcada com HA e CDH11 MCAM associada com proteínas KIF14 Flag-tag (Figura 5A). imunoprecipitação endógena também confirmou associações entre KIF14 e CDH11

in vivo

(Figura 5B). As distribuições de KIF14 e CDH11 proteínas ou MCAM foram examinados em H1299 células utilizando imunofluorescência. Os resultados mostraram que as proteínas de CDH11 e MCAM pode co-localizar em compartimentos comuns com KIF14 proteína, e a expressão de CDH11 e MCAM foi observada principalmente na periferia da célula quando KIF14 foi sobre-expresso (Figura 5C). Como KIF14 é uma proteína motor que participa no transporte de moléculas, que mais explorado se a expressão de KIF14 poderia regular a localização de CDH11. Isolamos proteínas fracção de membrana e analisou a expressão de CDH11 de linhas de células que sobre-expressam KIF14 e KIF14-silenciados. As quantidades de HA-CDH11 na fracção da membrana foram quantificadas através da normalização com a quantidade em lisados ​​de células totais, e os resultados mostraram que a sobre-expressão de KIF14 aumentou a expressão de CDH11 na fracção da membrana em comparação com as células de controlo (Figura 5B, à esquerda ). Em contraste, a depleção de KIF14 reduzida expressão CDH11 na superfície da célula em comparação com os controlos não-silenciados (Figura 5B, a direita). Também examinamos a distribuição de CDH11 endógeno em CL1-5 células /vetor, CL1-5 /KIF14 # 2, CL1-0 /shLacZ e CL1-0 /shKIF14, e os resultados foram similares aos dados anteriores (Figura S5).

(A) KIF14 associado com CDH11 e MCAM. O lisado de células HEK293T transfectadas com os plasmídeos indicados foi usado em ensaios de imunoprecipitação exógenos. A imunotransferência foi realizada com os anticorpos indicados. Actina foi utilizado como um controlo interno. (B) O lisado de células H460 foi utilizado em ensaios de imunoprecipitação endógenos. A imunotransferência foi realizada com os anticorpos indicados. (C) A distribuição de CDH11 e MCAM alterado com a sobre-expressão de KIF14. células H1299 foram co-transfectadas com HA-CDH11 ou HA-MCAM e GFP-KIF14, fixo e hibridada utilizando anticorpos anti-HA. O sinal foi capturada usando um microscópio confocal (ampliação original, 1000 ×). (D) As células HEK293T foram co-transfectadas com HA-CDH11 e Flag-KIF14 ou siKIF14 e, subsequentemente, a fracção da membrana foi isolada. A proteína da fracção de membrana de células totais e lisado foi analisada através de imunotransf erência. As quantidades de HA-CDH11 na fracção da membrana foram quantificadas através da normalização com a quantidade nos lisados ​​de células totais. Hsp90 foi usado como um marcador citosol.

Discussão

Estes resultados demonstraram que os KIF14 proteína age como motor de um tumor e supressor de metástase do adenocarcinoma de pulmão. Observou-se maior perda do que ganho perto KIF14 no cromossomo 1q32 (Figura 1) e descobriram que os pacientes com baixa expressão KIF14 apresentaram sobrevida global e livre de metástases pior em comparação com pacientes que expressam elevados níveis de KIF14 (Figura 2). A superexpressão de KIF14 em células de câncer de pulmão inibiu significativamente o crescimento independente de ancoragem

in vitro Comprar e xenoenxerto formação de tumores

in vivo

(Figura 3). Além disso, a modulação da expressão de KIF14 inibiu a migração celular, invasão e a adesão através de se associar com e aumentando a expressão da proteína de membrana de carga, CDH11 (Figura 4 e 5). Portanto, KIF14 pode ser um alvo potencial para o tratamento de adenocarcinoma de pulmão.

cromossômicas mis-segregação resultado em citocinese aberrante e aneuploidia. Este fenómeno é impedida em células normais por meio de paragem do ciclo celular e apoptose; No entanto, as células tumorais mostram o aumento das taxas de aneuploidia, que podem ser associados com maus resultados clínicos [36] – [41]. funções KIF14 na segregação dos cromossomas e a citocinese, e a sua depleção pode resultar em um ou binuclear estado multi-nuclear [4], [5], [7], [8]. Estes resultados suportam a hipótese de que se desenvolve em aneuploidia carcinogénese [9] – [11], [42]. Neste estudo, a sobre-expressão ou silenciamento de KIF14 em células reduzido ou aumentado, respectivamente, crescimento independente de ancoragem

in vitro

e KIF14 superexpressão crescimento do tumor reduziu

in vivo

(Figura 3). Estes resultados são consistentes com os de um estudo anterior no qual a expressão de KIF14 silenciados em células de cancro do pâncreas resultou no aumento da sobrevivência independente de ancoragem [43]. Além de KIF14, muitos outros reguladores citocinese também têm sido relatadas como genes supressores de tumores, incluindo KIF1A, KIF1B, KIF3, KIF4, KIF10, proteína síndrome de Von Hippel-Lindau (pvhl) e BRCA2 [16] – [18], [44] – [47]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a deficiência KIF14 pode promover a aneuploidia, resultando na formação de tumores, e que KIF14 pode actuar como um supressor tumoral no cancro do pulmão.

Progressão

O cancro é um processo complexo que envolve o crescimento celular, membrana basal degradação, a migração celular, invasão, adesão, e metástase [48], [49]. Os resultados obtidos no presente estudo mostrou que KIF14 não só estava envolvido na tumorigênese, mas também participou na adesão celular, migração e invasão (Figura 3 e 4). Immunochemistry indicou que os níveis de expressão foram KIF14 negativamente correlacionada com a metástase do cancro em doentes (Figura 2C e 2D). Em linhas celulares CL, os níveis de proteína KIF14 foram inversamente associados com habilidades invasivos celulares (Figura S2A). Estas observações foram semelhantes aos de um relatório anterior, em que a expressão KIF14 foi negativamente correlacionado com Matrigel e invasão do nervo no cancro pancreático [43]. Portanto, KIF14 pode agir como um supressor metastático em adenocarcinoma de pulmão.

Notavelmente, os resultados do

in vitro

ensaios foram ligeiramente discordante. Os dados obtidos no presente estudo sugerem que o silenciamento KIF14 reduz a proliferação celular (Figura 3), possivelmente devido a atrasos de fase M e falhas citocinese. No entanto, a sobre-expressão KIF14 não afectou significativamente a proliferação celular em comparação com o controlo. Examinámos ainda mais a distribuição de KIF14 e os fenómenos de células em cada fase, e os dados indicaram que não ocorreu com defeito específico KIF14 superexpressão (dados não publicados). Assim, o silenciamento ou superexpressão de KIF14 reduzida ou não afetou a proliferação celular, mas aumentada ou reduzida a formação de colónias; tais efeitos são consideradas capacidades transformar células. A sobre-expressão de KIF14 (KIF14 # 2) em células CL1-5 reduziu fortemente a formação de colónias, a migração celular e invasão, e o ligeiro expressão de KIF14 (KIF14 # 1) ligeira redução da formação de colónias e a migração de células fortemente reduzida e invasão (Figura 3 e 4). Estes resultados sugerem que a proteína KIF14 afecta a transformação celular e a invasão de diferentes graus. Propõe-se que o ligeiro aumento de expressão de proteínas em KIF14 # 1 células estáveis ​​CL1-5 /KIF14 também promove a migração de células através da inibição dramática o transporte de várias proteínas de carga importantes envolvidos na migração celular e invasão.

Embora KIF14 é uma importante proteína do motor que participa na citocinese através de interacções com PRC1 e citron quinase, o papel de KIF14 em outras funções ainda não está claro [7]. Os resultados obtidos no presente estudo mostrou que KIF14 pode regular a migração e adesão celular através de associações com CDH11 e MCAM; Este aumento na localização da membrana de CDH11 em linhas celulares de adenocarcinoma de pulmão é uma nova descoberta no que diz respeito à função de KIF14 (Figura 5). Estes resultados são semelhantes aos de um relatório em que KIF13 participou no transporte do receptor de manose-6-fosfato a partir do citossol para a membrana do plasma [50]. Estes dados indicam que KIFS pode regular funções celulares diferentes, alterando a localização de proteínas de carga diferentes.

Estes resultados suportam a hipótese de que KIF14 actua como um supressor tumoral e inibidor de metástases em adenocarcinoma do pulmão. O papel de KIF14 na progressão do cancro foi discutida nos últimos anos. Corson et al., Kim et al. e Wang et al. mostrou que KIF14 é altamente expresso no retinoblastoma, cancro da mama, cancro do ovário, carcinoma hepatocelular, glioma e alguns tumores pulmonares [28], [51] – [55]. Usando um array CGH análises, Corson et al. observar um aumento de 20% em tumores de pulmão e brônquios em uma grande área do cromossoma 1q31-1q32 [51]; No entanto, no presente estudo, foi realizada análise de arrayCGH e observou-se uma perda de 25% (22,5% e 26,8%) das duas sondas dentro de localização KIF14 e um ganho de 5% (2,9% e 6,5%) em adenocarcinomas do pulmão. Para explorar esta discrepância, nós também analisou a expressão de mRNA de KIF14 em nossa coorte estudo utilizando os primers e sonda de Corson et al estudos de.. De forma semelhante aos resultados mostrados na Figura 1B, os pacientes com expressão baixa KIF14 exibiu sobrevivência global pior em comparação com os pacientes com expressão elevada KIF14. Corson et ai. também silenciados KIF14 utilizando siRNA em linhas celulares tumorais de pulmão e indicou que o silenciamento KIF14 proliferação celular reduzida e a formação de colónias [28]. No presente estudo, nós silenciados a expressão de KIF14 através da entrega de lentivírus shKIF14 e obtiveram resultados semelhantes para a proliferação mas os resultados opostos no que diz respeito à formação de colónias. Curiosamente, ainda não está claro por que diferentes resultados foram obtidos para o mesmo gene; No entanto, há várias explicações possíveis para estes fenómenos. 1. Diferença na KIF14 marcas de proteína: Theriault et al. extraída ou reutilizada C-terminal EGFP- e KIF14 marcada com myc em ensaios de proliferação e formação de colônias, e EGFP-marcado KIF14 exibiu efeitos mais suaves do que KIF14 Myc-marcado [54]. Portanto, foram geradas construções marcadas não-KIF14 de tipo selvagem e examinaram os efeitos na invasividade de células; os resultados foram semelhantes aos de KIF14 Bandeira-rotulado (Figura 4C). Nós também gerado KIF14 Flag-tag no terminal C para examinar a migração de células, e os dados foram semelhantes aos obtidos com N-terminal e marcada com Flag-tag não KIF14 (dados não mostram). 2. As diferenças étnicas: um estudo recente indicou explicitamente que a ocorrência, causa, estado de mutação do gene, sobrevivência, prognóstico e tratamento do cancro do pulmão eram diferentes na Ásia e os EUA [56]. 3. Um gene ou uma proteína pode desempenhar papéis duplas ou múltiplas na função fisiológica. Por exemplo, factor de crescimento transformante beta (TGF-beta) actua tanto como um supressor de tumor ou um tumor de promotor em condições diferentes durante a progressão do cancro [57], [58], e o transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3) possui