Abstract

A identificação de novos biomarcadores para lesões pré-neoplásicas pancreáticas (PanINs, IPMNs) e início de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é crucial devido à doenças alta taxa de mortalidade após a detecção tardia. Para fazer face a esta tarefa foi utilizada a técnica inovadora de assistida por matriz dessorção /ionização por laser (MALDI) imagiologia espectrometria de massa (IMS) em modelos de ratos geneticamente modificados (GEM) de câncer de pâncreas. Vários GEM foram analisadas com MALDI IMS para investigar o padrão de lesões precursoras de péptidos /-expressão da proteína em comparação com pâncreas normal e PDAC com resolução de celular. A análise estatística revelou vários tecidos normais e doentes discriminativo

m /z

-espécie entre. neoplasia intra-epitelial (pancreáticas intraepiteliais) e neoplasia mucinoso papilar intraductal (IPMN) poderia ser distinguido do tecido pancreático normal e PDAC por 26 significativa

m /z

-espécie. Entre estes

m /z

-espécie, identificou-albumina e timosina beta-4 por cromatograf ia líquida e espectrometria de massa em tandem (LC-MS /MS), que foram posteriormente validada por imuno-histoquímica, western blot, RT-quantitativa PCR e ELISA em ambos murino e o tecido humano. Timosina-beta 4 foi encontrado um aumento significativo no soro de ratos com lesões pancreáticas intraepiteliais. PanIN expressão sobre-regulada de albumina foi acompanhada por um aumento da expressão de genes restrita-hepático, sugerindo um programa hepática transdiferenciação de células pré-neoplásicas. Em conclusão, mostramos que GEM de PDAC endógena são um sistema modelo adequado para a subsequente análise por LC-MS /MS MALDI-IMS e, permitindo

análise in situ

de lesões precursoras pequenas e identificação de péptidos e proteínas diferencialmente expressas.

Citation: Grüner BM, Hahne H, Mazur PK, Trajkovic-Arsic M, Maier S, Esposito I, et al. (2012) MALDI imagem espectrometria de massa para

In Situ

Análise proteômica do pré-neoplásicas lesões no cancro do pâncreas. PLoS ONE 7 (6): e39424. doi: 10.1371 /journal.pone.0039424

editor: Frank T. Kolligs, Universidade de Munique, Alemanha |

Recebido: 15 Janeiro, 2012; Aceito: 20 de maio de 2012; Publicação: 26 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Grüner et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação alemã de Pesquisa (SFB824-C4), o Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF; # 01GS08115) e da Associação de Cancer Research (AICR; # 07-0543); todos JTS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é a quarta principal causa de morte por câncer no mundo ocidental [1]. Devido ao estágio avançado no momento do diagnóstico e da alta resistência intrínseca à terapia, a incidência de PDAC corresponde com a sua mortalidade, com uma sobrevida média de menos de 6 meses e uma taxa global-sobrevida de 5 anos abaixo de 5% [2]. Identificação de proteínas expressas em lesões pré-neoplásicas podem ajudar a identificar a doença em um estado pré-invasivo, uma meta clinicamente altamente relevantes como a ressecção permanece como a única abordagem curativa muitas vezes frustrada pela metástase não detectada cedo ou doença localmente avançada [2].

Clinical e estudos histopatológicos identificaram três lesões precursoras PDAC: neoplasia intra-epitelial pancreáticas (pancreáticas intraepiteliais), intraductal neoplasia papilar mucinoso (IPMN) e neoplasia cística mucinoso (MCN). Os precursores de longe mais comum são PanIN lesões, embora, devido a melhores métodos de imagem neoplasmas císticos tais como IPMNs e, em menor grau, MCNs são cada vez mais diagnosticada [3], [4]. A identificação e classificação de PanINs como precursores de PDAC [5] permitiu o desenvolvimento de um modelo de progressão morfológica e genética (visão geral em [3]). Estes avanços têm contribuído para o desenvolvimento de sofisticados

Cre /lox

baseados em camundongos geneticamente modificados (GEM) para [6] PDAC endógeno. Um modelo de rato bem estabelecida recapitulando as etapas moleculares e morfológicas de desenvolvimento PDAC humano é o

Kras

G12D

modelo, em que oncogênico

Kras

G12D

está ativado na endógena

Kras

lócus. Ratinhos desenvolvem localmente PDAC invasivo e metastático através de lesões pancreáticas intraepiteliais definidos progredindo da PanIN1 para PanIN3 [7]. activação adicional de sinalização de EGFR leva a um desenvolvimento acelerado de PDAC através de lesões pancreáticas intraepiteliais e IPMN, ampliando o espectro de modelos de ratos PDAC clinicamente relevantes [8]. Por causa do fundo genético definido e o curso de tempo experimentalmente endereçável do desenvolvimento da lesão pré-neoplásica e progressão para PDAC, a hipótese destes modelos a ser ferramentas de estudo valiosos para o estabelecimento de uma abordagem pré-clínico de identificação de biomarcadores detecção precoce.

laser assistida por matriz dessorção /ionização (MALDI) imagiologia espectrometria de massa (IMS) tem evoluído como uma técnica nova e promissora ferramenta na descoberta de biomarcadores e oncologia translacional [9]. Exemplos incluem Parkinsons [10] e [11] a doença de Alzheimer, bem como vários tipos de cancro, incluindo os gliomas [12], [13], [14], [15], do ovário [16], da próstata [17], da mama [18] e cancro do cólon [19]. Ao fornecer uma molecular

ex vivo

vista do tecido ressecado, o rastreamento sem rótulo de compostos endógenos com resolução espacial e especificidade molecular está habilitado (visão geral em [9], [20]).

neste estudo, foi aplicado MALDI-IMS para examinar a viabilidade desta técnica para a identificação de potenciais novos biomarcadores em lesões pancreáticas intraepiteliais. Nós caracterizado picos dois específicos-PanIN, que foram identificados como ALB1 e TMSB4X. Nós substanciar expressão ALB1 como parte de um programa de transdiferenciação hepática de lesões precursoras e fornecer evidências para o aumento dos níveis séricos de TMSB4X em ratos com lesões pancreáticas intraepiteliais.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o estudo foi aprovado pelo comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade Técnica de Munique. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes antes da inclusão no estudo.

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o alemão Federal leis de proteção animal e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Técnica de Munique .

mouse Cepas

Kras

+ /LSL-G12D, Ptf1a

+ /Cre, Ela-TGFa

e

Trp53

+ /LSL-R172H

estirpes foram descritos anteriormente [7], [8], [21], [22], [23]. Camundongos foram cruzaram para obter as linhas de rato

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D; Ela-Fa; Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

e

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D; Ela-Fa; Trp53

+ /LSL- R172H

e foram retrocruzado para C57BL fundo /6J durante pelo menos quatro gerações. Camundongos C57BL /6J serviu como controle.

amostras humanas

As amostras de soro foram obtidas de 57 indivíduos com diagnóstico comprovado histologicamente de adenocarcinoma ductal pancreático (21 mulheres, 26 homens, média de idade de 67,1 anos) . O sangue total foi recolhido antes da cirurgia. amostras de soro de controlo foram tomadas a partir de 10 indivíduos saudáveis ​​(2 mulheres, 8 homens, idade média de 66,2 anos) e de 12 pacientes com pancreatite crônica (3 mulheres e 9 homens, média de idade de 55,8 anos).

MALDI-IMS em secções de tecido de rato pancreata

Para pancreata MALDI-IMS foram ressecados e snap-congelados em nitrogênio líquido, sem qualquer pré-tratamento. 10 uM criocortes foram cortadas e transferidas para lâminas de índio-estanho-óxido (ITO) de vidro revestido pré-tratadas com poli-lisina 1:01 em água com 0,1% de NP-40. As secções foram fixadas em etanol a 70% e etanol a 100% durante um minuto. Matriz (10 g /l de ácido sinapinico em 60% de acetonitrilo e 0,2% de ácido trifluoroacético) foi depositada uniformemente sobre a lâmina utilizando o dispositivo ImagePrep (Bruker Daltonics). Os espectros de massa foram medidos utilizando o MALDI TOF /TOF Analisador Ultraflex III (Bruker Daltonics) com uma resolução espacial de 70 uM em modo linear. Os iões foram detectados numa faixa de massa de

m /z

2.500-25.000 com uma taxa de amostragem de 0,1 GS /s. Um padrão de proteína pré-feito (Bruker Daltonics) foi utilizado para a calibração de espectros, o qual foi feito externamente sobre o mesmo alvo antes de cada medição. Depois da medição as lâminas foram lavadas em 70% de etanol para remover a matriz e contra-coradas com hematoxilina /eosina (H E). Imagens de alta resolução de secções coradas foram feitas usando o sistema Mirax Scan (Carl Zeiss) e co-registrada com os dados MALDI-IMS correlacionar espectros de massa com as características histológicas da mesma seção.

Análise Estatística de MALDI-IMS dados

dados MALDI-IMS foram obtidos e analisados ​​utilizando o FlexControl 3.0, FlexImaging 3.0 eo ClinProTools 2,2 software (Bruker). Com as regiões de interesse de software FlexImaging (ROI) foram definidos de acordo com a morfologia (PanIN, IPMN, PDAC, WT) e 40 escolhidos aleatoriamente espectros único por ratinho por ROI-grupo foram exportados para ClinProTools para posterior análise. lesões respectivos foram classificados por um patologista pancreático especialista (ou seja). Os espectros de massa extraídos foram recalibrados sobre o “fundo” picos comuns (alinhamento espectral) e normalizado em sua contagem total de íons. Em todas as análises, os espectros de dois grupos de ROIs foram comparados e

p valores

foram calculados com o teste de soma de postos de Wilcoxon combinada para dois não-paramétrico, ordinal, amostras independentes e Benjamini-Hochberg corrigido.

P

valoriza ≤0.05 foram considerados significativos.

Para a validação dos picos de discriminar a análise da significância dos microarrays de teste (SAM) foi realizada e recursos com uma taxa de descoberta de falsas menos de 0.001 foram considerados significativos. O limiar de discriminação óptima foi determinada utilizando análise de características do receptor operacionais (ROC). A validação foi realizada com um conjunto independente de amostras (Fisher exato t-teste,

p Art 0,001).

Peptide e identificação de proteínas por cromatografia líquida e espectrometria de massa em tandem (LC-MS /MS)

Peptídeos e proteínas foram extraídas diretamente do ácido sinapínico preparadas secções de tecido. Para a extracção, 1 ul de 30% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1% foi aplicado sobre a fatia, removido e misturado com um volume igual de α-ciano-4-hidroxi-cinâmico solução de ácido (10 mg /ml em 30% de acetonitrilo , 0,1% de ácido trifluoroacético) em um alvo de MALDI de aço inoxidável para a medição inicial de MALDI MS ou diluída em 10 ul de ácido fórmico a 0,1% para as medições de LC-MS /MS subsequentes.

para obter precisas

m /z

valores para o

m /z

espécies de interesse, extractos de matriz de seções adjacentes de pancreata rato com uma alta intensidade das respectivas espécies m /z foram analisados ​​pelo modo de ião positivo reflector MALDI MS. As medidas foram realizadas em um espectrômetro de massa ultrafleXtreme MALDI-TOF /TOF equipado com um 1 kHz SmartBeam-II laser (Bruker Daltonics). Cada espectro foi calibrados externamente utilizando o peptídeo Calibração padrão II (Bruker Daltonics) ea função “cúbica aumentada” calibração, normalmente produzindo precisão em massa. 20 ppm

LC-MS /MS análise de extratos da matriz foram realizados num espectrómetro de massa LTQ Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) acoplado a um nano-HPLC (Ultra, nanoLC Eksigent Technologies). Os péptidos foram separados numa auto-embalados 75 um x 40 centímetros de coluna de fase reversa (Reprosil, Dr. Maisch) utilizando um gradiente linear de 25 min (2-35% de acetonitrilo em ácido fórmico a 0,1%, taxa de fluxo de 300 nl /min). massas intactas de peptídeos de eluição foram determinadas a 30.000 resolução e os três picos mais intensos foram selecionados para uma maior fragmentação por dissociação induzida por colisão (CID) e aquisição de espectros fragmento com baixa resolução (1.000). íons de carga única, bem como íons com estado de carga desconhecida foram rejeitadas. exclusão dinâmica foi habilitado ea duração da exclusão dinâmica foi ajustado para 10 segundos. arquivos Peaklist foram gerados usando Mascot Distiller versão 2.2.1.0 (Matrix Science) e pesquisas de banco de dados foram realizadas utilizando o motor de busca Mascot versão 2.2.04 (Matrix Science) contra o banco de dados do mouse IPI (versão 3.26). Pesquisa arquivos de resultados foram importados para andaime (Proteome Software).

imunofluorescência e imunohistoquímica

imunofluorescência ou imunohistoquímica foram realizadas de acordo com protocolos padrão. Foram utilizados os seguintes anticorpos: ALB1 (Santa Cruz Biotechnology, e Thermo Fisher Scientific), HepPar1 (DAKO), TMSB4X [24], [25] (Immundiagnostics, Bensheim) e CK19 (TROMA-III; Developmental Studies Hybridoma Bank)

RT-PCR quantitativo

PCR em Tempo real foi realizado como descrito materialização [8]. A ciclofilina foi utilizado para normalização.

valores

P foram calculados pelo teste de Wilcoxon. Foram utilizados os seguintes iniciadores:

ciclofilina-F /-R ATGGTCAACCCCACCGTGT /TTCTGCTGTCTTTGGAACTTTGTC

Tmsb4x-F /-R CCTCTGCCTTCAAAAGAAACA /GGGCAGCACAGTCATTTAAAC

Alb1-F /-R TTGGTCTCATCTGTCCGTCA /GGCAGCACTCCTTGTTGACT

A transferrina-F /-R ATCAAGGCCATTTCTGCAAGT /GGTTCAGCTGGAAGTCTGTTCC

alfa-fetoproteína-F /-R GGAGGCTATGCATCACCAGT /CATGGTCTGTAGGGCTTTGC

A apolipoproteína A4-F /-R AGAGCCTGAGGGAGAAGGTC /AGGTGTCTGCTGCTGTGATG

ELISA -Enzyme Imunoabsorção Ensaio

O kit de ELISA para a determinação quantitativa das concentrações TMSB4X no soro foi obtido a partir Immundiagnostics (Bensheim). ELISA foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante.

Western Blot

análise Western Blot foi realizada de acordo com protocolos padrão com anticorpos contra ALB1 (Santa Cruz Biotechnology) e HSP90 (Cell Signaling).

Resultados

MALDI-IMS na pré-neoplásicas lesões e PDAC de GEM Models

para identificar novos biomarcadores para as duas lesões pré-neoplásicas pancreáticas mais comuns, PanIN e IPMN, nós ressecado pancreata partir estabelecida GEM de PDAC: 13

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

, 8

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D; Ela-Fa Comprar e 5

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D; Ela-TGFa; Trp53

+ /LSL-R172H

ratos de idade mista (3 a 18 meses, dependendo do genótipo). Estes ratinhos desenvolvem lesões pancreáticas intraepiteliais e progredindo para IPMN PDAC invasivo e metastático com diferente agressividade início e [7], [8], [23]. Quatro camundongos C57BL /6J serviu como controle de tipo selvagem. Todos os pâncreas foram medidos num Ultraflex III MALDI TOF /TOF Analyzer com uma resolução espacial de 70 uM. O fluxo de trabalho de MALDI-IMS está representada na Figura 1A. Para testar a exactidão do método, primeiro re-visualizado o ião molecular já conhecido da insulina [M + H

+] em 5808 no pâncreas de ratinhos do tipo selvagem. O sinal da insulina, a qual é dada como uma ilustração do mapa de calor (onde azul significa menor e intensidade mais elevada em relação vermelho), bem co-localizada com as ilhotas de Langerhans (Figura 1B), o que demonstra a correlação correcta de medida

m /z

-espécie para características morfológicas com MALDI-IMS.

(a) Visão geral do fluxo de trabalho MALDI-IMS. (B) Re-visualização do ião molecular de insulina [M + H

+] em 5808 (barra vermelha) no espectro médio de uma secção de pâncreas de um ratinho C57BL /6 medido em MALDI-IMS. A intensidade do sinal medida é codificada por cores, em que a cor vermelha significa maior intensidade na posição em relação à secção. O pico de insulina co-localiza com as ilhotas pancreáticas (ampliadas no trecho). (C) Definição de ROIs em H E seções após a medição MALDI-IMS manchada. Painel superior: H E seções manchadas de um

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

(

CK

) e um

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D; TGFa

(

CKT

) mouse. linhas círculo tecido exócrino, linhas verdes PanIN1, linhas amarelas PanIN2, as linhas de laranja PanIN3, linhas azuis IPMN e linhas vermelhas PDAC diagnosticado regiões na respectiva seção. barra de escala representa 1 cm. Painel inferior: exemplos dos diferentes ROIs morfológicos, tal como indicado abaixo. barras de escala representam 50 mm.

Para comparar os espectros de diferentes áreas morfológicas, as regiões de interesse (ROI) para PanIN, IPMN, PDAC e tecido exócrina normal foram definidos por um especialista em patologia pancreática em o pâncreas utilizando o software FlexImaging e foram usadas para comparação dos espectros das respectivas regiões da mesma secção, bem como a partir de outras secções uma à outra. Figura 1C dá exemplos da definição de regiões em seções medidos (Figura 1C painel superior) e as características morfológicas distintas (Figura 1C, painel inferior). A única espectros destes ROIs foram exportados para o software de análise de ClinProTools. Como um primeiro experimento de controle foram comparados os espectros de tecido normal pancreática (ácinos e ductos) do tipo selvagem (WT) ratos com fenotipicamente normais aparecendo acinar e do tecido ductal de

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

ratos portadores do oncogênico

Kras

G12D

mutação. Não há diferenças nos espectros entre estes dois grupos eram detectáveis, por conseguinte, assegurar que não existem as variações detectáveis ​​nos espectros de WT e GEM (Tabela 1). Para uma análise mais aprofundada, ROIs fenotipicamente normais de ambos os genótipos foram classificados como “normal”

A seguir, analisados ​​espectros de tecido normal de C57BL /6J e

Ptf1a

+ /Cre;. Kras

+ /G12D

ratos (n = 11) contra espectros de lesões pré-neoplásicas de

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

e

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D; Ela-Fa

camundongos (PanINs e IPMNs, n = 24). Estes dois grupos podem ser distinguidos por 76 picos estatisticamente significativas (Wilcoxon teste rank-sum,

p

valoriza Benjamini-Hochberg corrigido), dos quais 26 eram específicos de lesão (ou seja, específico para IPMNs e PanINs) e 50 normal- específicos com o

valores p

entre 0.000001 e 0,05. Para PanINs encontramos 25 (

p

= 0,000001 para

p

= 0,05) e para IPMNs 18 (

p

= 0,03 a

p = 0,05

) específica

m /z

-espécie respectivamente, o que pode discriminar-los a partir de tecido normal. Além disso, IPMNs e PanINs puderam ser discriminados entre si por picos específicos 6-PanIN (

p = 0,02 para

P

= 0,05, n = 19 vs 13 ratinhos). Ao comparar as lesões pré-neoplásicas com PDAC (n = 24 vs. 10 ratos) foram detectadas 57 lesões específicas e massas 11 PDAC específicas-(

p

= 0,00169 para

p

= 0,038). A Tabela 1 fornece uma visão geral de todos os grupos comparados, o número de discriminar

m /z

-espécie, o correspondente

p valores e o número de animais utilizados

. Tabela Suplementar S1 fornecer informações detalhadas de todos significativamente identificados

m /z

-espécie das comparações mais importantes.

m /z

-espécie 2790, 2812 e 2829 são especificamente Encontrado em PanIN lesões

Um exame mais detalhado dos picos PanIN específicos de revelou que os PanINs

m /z

-espécie 2790, 2812 e 2829 foram exigentes de tecido normal (Figura 2A). A sobreposição dos espectros de média PanINs e tecido pancreático normais revelou que, no último caso, os picos foram quase não detectáveis ​​(Figura 2A). Uma análise mais aprofundada estatística desses picos (teste de Wilcoxon, correção de Bonferroni) revelou

P valores

abaixo 0,00001. A caixa de distribuição de lote e Princípio Análise de Componentes (PCA) da PanINs e tecido exócrino representado clara discriminação entre os dois grupos (Figura 2B + C).

(A) Sobreposição de um trecho do espectro média do ROI -group “PanIN” (azul) eo ROI-grupo “WT” (rosa). A propagação das intensidades dos espectros individuais é indicada em bares; u.a. (unidades arbitrárias). (B) Dot Plot da intensidade-distribuição da

m /z

-espécie 2829 em PanINs (azul) e WT (rosa) de cada único espectro. (C) PCA diferenciação baseada do exócrina (rosa) e PanIN tecido (azul). (D) Re-visualização dos picos significativos. O

m /z

-espécie 2829 claramente re-visualiza sobre lesões pancreáticas intraepiteliais (painel superior, engrandecido no trecho), enquanto que o pico em 6645 é específico para o compartimento de exócrina do pâncreas (painel inferior, ampliada à direita lado). Abaixo está o espectro médio da seção medida.

A seguir visualizado

m /z

2829 nas secções de tecido que demonstram especificidade deste pico para regiões pancreáticas intraepiteliais no mapa de calor ilustração ( Figura 2D, painel superior), enquanto que um pico a

m /z

6645, que era único para o tecido normal especificamente re-visualizada nas regiões de tecido pancreático morfologicamente normais (Figura 2D, painel inferior).

Validação de significativas Discriminando Peaks em uma amostra independente set Online

Para validar a importância do

m /z

espécie 2790 e 2829 em um conjunto de amostras independentes, foi realizada Receptor Características de operação (ROC ) a análise com esses picos para determinar os limiares que discriminam ideais. Com estes limiares que era possível distinguir tecido de 10 pancreata rato independente (4

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D Comprar e 6 ninhada de tipo selvagem em uma idade de 6 meses), com uma precisão de 100% (teste de Fisher,

p Art 0,001).

identificação de proteínas do significativo Espécies três mais por MS

LC-MS /

Para a identificação de proteínas de discriminar PanIN-determinada significativa

m /z

espécie, peptídeos foram extraídos diretamente lâminas MALDI-IMS e inicialmente analisados ​​por modo reflector MALDI MS para obter massas precisas ( 20 ppm) para as espécies MALDI IMS antes LC-MS para análises /MS. Sequência de pesquisa de banco de dados dos resultados LC-MS /MS usando o motor de busca Mascot permitiu a identificação de três altamente significativas

m /z

espécies que apontam para duas proteínas diferentes. O

m /z 2790

espécies foi identificado como um péptido que representa o terminal amino da forma madura de albumina sérica (ALB1), ao passo que ambos, o

m /z 2812 e

o

m /z 2829

espécies representados dois péptidos diferentes, pertencentes à porção carboxi-terminal da timosina beta-4 (TMSB4X). A identificação de TMSB4X foi ainda apoiado pela identificação de mais quatro péptidos diferentes da região carboxi-terminal da proteína. As identificações de peptídeos verificados manualmente de ALB1 e TMSB4X ea correspondente espectros MS /MS são listadas na Tabela 2 e disponível no material suplementar (Figura S1).

mais perto de Investigação e Validação dos actos identificados

Para investigar se ALB1 e TMSB4X também estão presentes no nível de transcrição em pancreata tumorigénico, nós isolado RNA pancreático total desde 8

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D Comprar e 6 ninhada de tipo selvagem em idade mista entre 4,5 e 9 meses e realizada análise quantitativa RT-PCR para estes dois candidatos. A expressão de ambas as transcrições foi significativamente regulada em

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

em comparação com ratinhos de tipo selvagem (

p

≤0.05, Figura 3B e . 4A)

(A) análise imuno-histoquímica de ALB1 mostra coloração específica das lesões pancreáticas intraepiteliais de

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

(

CK

) ratos, mas as células não ductal (n = 10 ratos). imunofluorescência para ALB1 e o marcador ductal CK19 demonstra a co-localização das duas proteínas. Todas as barras de escala representam 50 mm. (B) mRNA de

Alb1 Comprar e dos genes hepáticos

alfa-fetoproteína (AFP)

,

A apolipoproteína A4 (ApoA4) Comprar e

transferrina (Tfn)

são significativamente regulada em pancreata de

CK

ratos em comparação com o controlo de tipo selvagem (

p

= 0,04 para

Alb1

,

p = 0,008

para

AFP News,

p

= 0,04 para

ApoA4

,

p

= 0,004 para

Tfn

, n = 7 vs. 5 ratinhos). Os níveis de expressão são normalizados para amostras de ratinhos do tipo selvagem. Todas as barras de erro indicam os desvios padrão normalizados para a média do tipo selvagem. (C) Western Blot para ALB1 em lisatos integrais pancreáticas do tipo selvagem e

CK

ratinhos (n = 3). expressão ALB1 no tecido pré-neoplásica é robustamente aumentou em comparação com pâncreas normal. (D) A análise imunohistoquímica do marcador hepática HepPar1 em uma lesão PanIN3 humana

(A) TMSB4X mRNA é aumentada significativamente em

Ptf1a

+ /Cre;. Kras

+ /G12D (CK)

camundongos em relação ao controle de tipo selvagem (

p

= 0,01, n = 8 contra 6 ratos). Os níveis de expressão são normalizadas com o tipo selvagem. As barras de erro indicam os desvios padrão normalizados para a média do tipo selvagem. (B) Coloração para TMSB4X em amostras de tecido de 10-30 semanas de idade

CK

ratinhos (n = 10) mostra a expressão em PanINs (ponta de seta), mas não em células acinares (asterisco) (i). Alto grau mPanIN3 expressar TMSB4X (ii). Expressão em PanIN3 humana (iii) e PDAC humana (IV) também é detectável. As barras de escala representam 50 mm. (C) ELISA para TMSB4X a partir de amostras de soro de tipo selvagem e

CK

ratinhos (n = 7 vs 14 ratinhos). A concentração sérica de TMSB4X é significativamente regulada em

camundongos CK

(

p

= 0,043, teste de Wilcoxon). (D) ELISA para TMSB4X de amostras de soro de PDAC e pacientes com PC, bem como doadores sadios. Medianas são marcadas por linhas vermelhas.

Para validar correta identificação ALB1 coloração imuno e análise Western Blot para ALB1 foram realizadas. expressão ALB1 em seções de

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

ratos foi observada em lesões pancreáticas intraepiteliais mas não em ductos pancreáticos e células acinares (n = 10) normal. Além disso, a análise de imunofluorescência para ALB1 eo marcador ductal CK19 em criosecções de

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

e

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D; Ela-TGFa

ratinhos demonstraram co-localização das duas proteínas em lesões pancreáticas intraepiteliais (Figura 3A). Mais importante, os

m /z

espécies 2790 não re-visualização em pequenos e grandes vasos de seções MALDI-IMS medidos (Figura S2). análise Blot também ocidental de lisados ​​pancreáticas inteiros revelou aumento da expressão da proteína ALB1 em

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

e

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

ratinhos em comparação com os controlos do tipo selvagem (Figura 3C).

foi anteriormente relatado que células exócrinas pancreáticas podem transdiferenciar em hepatócitos e que os focos hepática pode ser encontrado no pâncreas e no adulto PDAC [26], [27], [28], [29]. Por isso ficamos intrigados para saber se o altamente sinal aumentado ALB1 identificado por MALDI-IMS pode ser devido a um processo de transdiferenciação hepática de

Kras células pancreáticas

G12D

-activated. Para testar essa hipótese, foi isolado ARN de toda pancreata de

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D Comprar e ratinhos de tipo selvagem entre 4,5 e 9 meses e realizada RT-PCR quantitativo para o fígado marcadores específicos

transferrina

(Tfn),

Alfa-fetoproteína (AFP) e

A apolipoproteína A4

(ApoA4). O nível de expressão desses marcadores foram significativamente aumentados em

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

comparação com ratinhos de tipo selvagem, indicando um possível processo de transdiferenciação ocorrendo em PanINs (

p

≤0.05, Figura 3B). Além disso foi realizada a análise imuno-histoquímica para o marcador específico do fígado em 14 HepPar1 PanIN1, 4 PanIN2 e 4 PanIN3 lesões. Duas lesões PanIN3 foram positivamente coradas para HepPar1 (Figura 3D), indicando características de células hepáticas em PanINs de alto grau.

Em relação à segunda proteína identificada, nós validado expressão TMSB4X em murino e humanos lesões pancreáticas intraepiteliais e PDAC, mas não em células acinares, ductais e dos ilhéus (Fig. 4B). Para a quantificação nos cortes corados de 10

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ G12D

ratos /com PanINs e encontrou todos eles para ser positivo para TMSB4X. De nota, a expressão já estava alto no PanINs de baixo grau e ficou em lesões malignas, apoiando os resultados da nossa abordagem baseada em MALID-IMS para identificação de marcadores de lesão pré-neoplásicas que ainda estão presentes no PDAC. Desde TMSB4X é uma pequena molécula e tem sido detectada em fluidos corporais previamente, o próximo investigado se ela pode ser detectável por ELISA em amostras de soro de ratos com lesões pancreáticas intraepiteliais. Curiosamente, encontramos upregulated significativamente os níveis sanguíneos em

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

comparação a camundongos controle WT, apoiando o valor principal da estratégia de detecção de marcadores apresentado (Fig 4C. ). No entanto, quando realizamos uma análise utilizando um conjunto de amostras humanas de doadores e pacientes com pancreatite crônica e PDAC, nenhuma diferença significativa foi notável entre estes grupos (Fig. 4D).

Discussão

por causa da falha em curso de abordagens terapêuticas para melhorar a sobrevivência em pacientes PDAC, a detecção precoce é de fundamental importância para um melhor resultado nesta doença de outra forma fatal. Neste estudo, foi aplicado MALDI imagem Espectrometria de Massa (MALDI-IMS), com resolução espacial para a

in situ

análise proteômica de lesões pré-neoplásicas do pâncreas na GEM com PDAC endógeno. Nós abordaram especificamente a questão de saber se é possível identificar proteínas ou peptídeos que podem discriminar entre o tecido pancreático, lesões precursoras morfologicamente normais PanIN /IPMN e PDAC.

Embora a necessidade de detecção precoce do PDAC, de preferência em uma pré-invasiva estado, é de importância óbvia, análise proteômica em humanos são prejudicadas por interindividual inerente e variações genéticas intratumorais, bem como fatores de confusão, incluindo condições ambientais e nutricionais. Além disso, a obtenção de tecido pancreático com lesões pancreáticas intraepiteliais ou IPMN pré-neoplásicas não é viável por razões óbvias. Assim, GEM recapitulando carcinogénese pancreático humano proporcionar uma plataforma de trabalho excelente e têm sido utilizados para a detecção de marcadores biológicos utilizando análise de SELDI-TOF [7]. Em outro estudo,

Pdx1-Cre; Kras

+ /G12D; INK4a /Arf

LOX /lox

ratos foram utilizados para a análise proteômica do plasma e os candidatos foram validados no sangue de pacientes com PDAC [ ,,,0],30]. Um estudo recente da Taguchi e colegas compararam os perfis de proteínas plasmáticas de quatro modelos de ratos com câncer de pulmão com perfis de modelos de pâncreas, ovário, cólon, próstata e câncer de mama e dois modelos de inflamação. Eles mostraram relevância para cancro do pulmão humano das assinaturas proteína identificada na base de modelos de rato [31]. Nós, portanto, a hipótese de estes GEM para ser uma plataforma adequada para a identificação de biomarcadores utilizando MALDI-IMS.

MALDI-IMS é uma abordagem em rápido desenvolvimento para análise de tecido molecular com alto potencial de questões clinicamente relevantes, incluindo a identificação de biomarcadores, a classificação tumor , monitoramento da resposta terapêutica e de imagem de drogas [14], [16], [32], [33], [34], [35], [36].