Abstract
fulgens Potentilla
raiz tradicionalmente usado como um remédio popular em Meghalaya, na Índia. No entanto, a avaliação sistemática da sua eficácia anticancerígena foi limitado. Foram investigados os potenciais anticancerosos dos diferentes extractos preparados por fraccionamento do extracto de metanol de raiz, com o objectivo de descobrir principais factores que contribuem a partir das fracções mais eficazes. extracto de metanol de
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raízes (PRE) foi preparado por maceração, que foi posteriormente fraccionado em hexano, acetato de etila (AE) e
n-butanol
frações solúveis. Vários ensaios (ensaio clonogénico, citometria de fluxo, Western blot, RT-PCR semiquantitativo e o nível de glutationa endógena) foram usadas para avaliar diferentes parâmetros, tais como a capacidade de sobrevivência celular, a PARP-1 proteólise, padrão de anti-apoptótica e γ- expressão sintetase subunidade pesada (GCSC) genes glutamil-cisteína em ambas as linhas de células MCF-7 e câncer U87. Uma vez que a fracção de EA-mostraram efeito inibidor do crescimento mais eficiente, que foi ainda purificado e um total de nove compostos e alguns flavan-3-óis monomérica e dimérica foram identificados e caracterizados. Três compostos viz., Epicatequina (EC), ácido gálico (GA) e ácido ursólico (UA) foram tomadas com base no seu mais elevado rendimento e 10 ug /ml de cada um foi misturado em conjunto. A concentração utilizada neste estudo para PRE, EA- e Hex-fracção foi de 100 ug /ml, que foi maior do que o IC
50 valores. morte celular por apoptose no PRE, EA-fração e CE + GA + UA tratadas culturas de células de câncer foi significativamente maior do que em células normais devido à supressão da Bcl2 proteína anti-apoptótica após o tratamento. Também foi observada a depleção de glutationa por downregulating GCSC. A indução de apoptose e a diminuição do nível de glutationa são consideradas positivas para a actividade de um agente anti-cancro. Assim, a modulação da concentração de GSH em células tumorais através da pré-fracção e a sua EA abriu a possibilidade de uma nova abordagem terapêutica porque estes produtos vegetais não são prejudiciais para as células normais e podem regular a resposta celular do tumor a diferentes tratamentos anticancerígenos. Assim, seria interessante examinar a eficácia destes produtos vegetais ou EA-fração no tratamento do câncer humano
Citation:. Tripathy D, Choudhary A, Banerjee UC, Singh IP, Chatterjee A (2015) indução de apoptose e Redução da endógena glutationa Nível pela fração acetato de etila solúvel do extrato metanólico das raízes da
fulgens Potentilla
em células cancerosas. PLoS ONE 10 (8): e0135890. doi: 10.1371 /journal.pone.0135890
editor: Ying-Jan Wang, da Universidade Nacional Cheng Kung, TAIWAN
Recebido: 22 Abril 2015; Aceito: 27 de julho de 2015; Publicação: 18 de agosto de 2015
Direitos de autor: © 2015 Tripathy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por DBT, Govt. da Índia (BT /59 /NE /TBP /2010) para AC, UCB, e IPS; DBT companheirismo e DST-Inspire comunhão (SE 120044) para Alka Choudhary; DBT-bolsa para DT
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
plantas medicinais tradicionais como agentes preventivos e terapêuticos do câncer potencial receberam atenção crescente durante os anos passados [1,2]. O gênero
Potentilla
pertence à família
Rosaceae
que inclui cerca de 500 espécies, e é distribuído principalmente em zonas temperadas, árticas e alpinas do hemisfério Norte [3].
Potentilla
extractos são considerados para ser seguro e não-tóxico, quando aplicado a seres humanos [4,5]. Extratos da raiz do
anserina do Potentilla
têm sido utilizados para o tratamento de certas infecções virais como populares ervas medicinais no Tibete [6]. Propôs-se que a presença de maior quantidade de hidrolisáveis e condensados taninos, flavonóides e triterpenos na maioria das partes da planta de
Potentilla
espécie poderia ser um fator importante para os efeitos biológicos observados [7].
fulgens Potentilla
Wall. Gancho Ex, vulgarmente conhecido como Himalayan Cinquefoil em Inglês, é uma planta medicinal importante de alcances superiores do Himalaia. Diferentes grupos étnicos do nordeste da Índia usam diferentes partes da planta como fonte de medicina, embora seu modo de ação ainda está para ser estabelecida. Habitantes desta região tradicionalmente mastigar betel-nut (
Areca catechu
), folhas de betel (
Piper betel
) e a raiz principal de
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fulgens Compra de várias doenças [8], mas apesar de sua ampla utilização pouco se sabe sobre a sua fitoquímica e mecanismo de ação. Estudos anteriores sobre o extracto de metanol da raiz do
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têm mostrado melhor sobrevivência dos ratinhos com células de ascite de Ehrlich, e também um efeito inibidor dependente da dose, no crescimento de células MCF-7 [9]. Uma tentativa recente para isolar e caracterizar compostos puros a partir da fracção solúvel em acetato de etilo-metanol do extracto de raiz de
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produziram nove compostos, incluindo dois novos triterpenóides tipo ursane ácido Fulgic A e Fulgic ácido B. Ambos estes novos compostos apresentam boa atividade antioxidante [10]. Estudos mais amplos, utilizando várias técnicas analíticas demonstraram que flavanas incluindo flavonóides oligoméricos seguido de triterpenos ácidos são os principais constituintes da raiz do
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[11].
O presente estudo tem como objetivo investigar os efeitos de diferentes frações de
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extrato de raiz sobre a sobrevivência celular, proliferação celular, apoptose e de nível GSH endógena em células cancerosas de mamíferos e determinar os principais fatores que contribuem para esse efeito a partir da fração mais eficaz deste extrato de raiz. Nós demonstramos que
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extrato de raiz e de sua fração solúvel em acetato de etilo inibir o crescimento de células cancerosas através da indução de apoptose. Analisámos também o estado de glutationa endógena (GSH) das células de cancro tratadas e demonstrou o seu esgotamento, considerada um efeito positivo de qualquer droga quimioterapêutica porque a redução do nível de GSH endógena torna a célula mais sensível a drogas [12]. Desde GSH foi encontrada a desempenhar um papel importante na regulação da morte celular e a sua depleção requer para a execução da apoptose [13], por conseguinte, o esforço para desenvolver fármacos antineoplásicos que se dirigem aos sistemas redox, por exemplo, glutationa e tioredoxina, têm atraído a atenção.
Materiais e Métodos
material vegetal
Raízes do
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, uma planta não-ameaçadas de extinção, foram coletados de 20 plantas diferentes em área de pico da floresta Shillong (altitude 1700 m acima do nível do mar; 25 ° 34 de latitude norte e 91 ° 54 de longitude leste) do estado de Meghalaya da Índia após a obtenção da devida aprovação do gestor florestal. Uma amostra comprovante foi depositado no herbário do Departamento de Botânica da Universidade North-Eastern Hill, Shillong (número de acesso 11906). O material de raiz (1 kg) foi seco ao ar à sombra por uma semana e chão em um moedor de misturador para um pó grosseiro.
Extração e isolamento
ursólico, ácido euscaphic, ácido corosólico, ácido fulgic a e B, epicatequina, catequina, ácido gálico, p-hidroxibenzaldeído, juntamente com vários flavan-3-óis diméricos foram isolados como descrito nos nossos anteriores comunicações [10]. Resumidamente, extrato de metanol (MeOH) (80:20) de
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raízes (PRE) foi preparado por maceração, que foi posteriormente fraccionado em hexano (Hex), acetato de etila (AE) e
n-butanol
frações solúveis. O extracto de acetato de etilo-foi submetido a cromatografia líquida usando vácuo e acetato de clorofórmio-metanol gradientes de hexano-acetato de etilo para produzir cinco fracções reunidas, E1 a E5. A cromatografia de coluna de E1 fração rendeu ácido ursólico, ácido euscaphic e ácido corosolic. Dois ácidos triterpénicos estereoisoméricas, ácido fulgic A e ácido fulgic B foram separados a partir da fracção E2 por HPLC. As fracções E3 a E5, após cromatografia em coluna e HPLC de fase reversa produziu fenólicos catequina, epicatequina, ácido gálico, ácido p-hidroxibenzóico, vários flavan-3-óis monomérica e dimérica [10,11]. regime de isolamento é mostrado na Figura 1.
linha celular e ensaio de sobrevivência de células clonogénicas.
MCF-7 (linha de células de câncer de mama humano) e U87 (linha de células de glioma maligno humano) foram adquiridos a partir do Centro Nacional de Cell Science (Pune, Índia). As células foram cultivadas em meio MEM de Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Gibco) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen-Gibco), 100 U /ml de penicilina e 100 mg /mL de estreptomicina (Invitrogen-Gibco) e 2 mM de L-glutamina ( Invitrogen-Gibco).
O survivality celular foi avaliada utilizando um ensaio clonogénico em ambas as linhas celulares de cancro. Resumidamente, as células foram tripsinizadas e os números de células apropriadas (células 2000 e 3000) foram semeadas em três 25 cm
2 frascos cada um e para os controlos não tratados, quatro frascos foram plaqueadas a uma densidade de células (1000 células). Cinco horas após a sementeira, as células foram expostas durante 24 h com de 5 a 150 ug /ml do extracto de raiz (PRE) de
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ou 10 a 120 ng /ml de EA- ou hex ou
n
butanol-fração. Após as células de tratamento foram lavadas duas vezes com o meio e, finalmente, os frascos foram incubados numa incubadora humidificada com 5% de CO
2 a 37 ° C com meio MEM fresco por Dulbecco com 10% de soro fetal de vitelo durante 10 dias. As colónias foram fixadas e coradas com 0,2% de violeta cristal em 70% de etanol. Cada ensaio foi realizado em triplicado e as colónias contendo pelo menos 50 células foram contadas. O número de colónias sobreviventes (amostras tratadas) foi normalizado contra o número de colónias em amostras não tratadas.
Os pormenores do tratamento
Em todos os experimentos que foram realizados após o ensaio colonogenic, as células cancerosas foram tratados com 100 ug /ml de PRE, eA-fração e Hex-fração do extrato metanólico das raízes da
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. Em caso de mistura de três compostos que foram isolados a partir da fracção de EA-i.e. epicatequina (EC), ácido ursólico (UA) e o ácido gálico (GA), cada uma foi feita a 10 ug /ml. Estes três compostos foram retirados de três diferentes EA-subfrações (fração 1, 3 e 4) e sua seleção foi baseada em sua maior rendimento. Em todas estas experiências, as células foram expostas durante 24 h.
capacidade de morte celular através da pré-EA e fracção de células normais e cancerosas
Isto foi determinado por ensaio de exclusão de azul de tripano. De colheita recente linfócitos do sangue periférico humano foi usado como células normais e MCF-7 e células U87 foram usados como células cancerosas.
sangue periférico heparinizado de dois doadores saudáveis do sexo masculino (HPBL) foi obtido depois de ter seu consentimento por escrito para a participação e utilizado logo após a sua coleção. As células mononucleares de sangue periférico foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) (densidade 1,077 g /ml) durante 30 min a 400
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destes sangue total heparinizado extraído recentemente . culturas de linfócitos foram criadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de calor de FCS inactivado. Penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 mg /ml) e 2 mM de L-glutamina foram adicionados ao meio. Os linfócitos foram estimulados com PHA e depois de 24 h de linfócitos foram tratados com pré-fracção e EA (100 e 150 ug /ml) durante 24 h. Estas culturas foram incubadas a 37 ° C e foram colhidos logo após o tratamento. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional e Humano. No caso de células cancerosas, as células MCF-7 e células U87 foram usadas e tratou-se com pré-fracção e EA (100 e 150 ug /ml) durante 24 h. As células foram lavadas com meio fresco e, em seguida, incubadas durante 10 min à temperatura ambiente com 0,4% de azul de tripano definitiva. As células mortas foram coradas de azul, e os vivos foram imaculado. As experiências foram repetidas três vezes.
capacidade de morte celular através da pré-fracção e EA também foi avaliada por análise de citometria de fluxo (S1 do ficheiro).
Efeito sobre a proliferação de células em células MCF-7 e U87 células
O ensaio de proliferação celular foi realizada em MCF-7 e células U87 depois de tratar as células com PRE, eA e Hex-frações. As células a uma densidade de 5 x 10
5 foram cultivadas em 25 cm
2 frascos em meio DMEM a 37 ° C e 5% de CO
2. Após 24 horas da sementeira, as células foram expostas a PRÉ, EA ou hex-fracção a uma concentração final de 100 ug /ml durante 24 h e, finalmente, fixado em 70% de etanol.
Todas as células foram fixas acima lavadas em PBS e ressuspensas em 500 ul de solução de iodeto de propídio (/ml de iodeto de propídio 20 ug, 0,2 mg /ml de ARNase) durante 1 h de incubação à temperatura ambiente no escuro. 10.000 células foram adquiridos para cada amostra e analisou-los num FACS Calibur (Becton-Dickinson) utilizando @ software @ CELLQuest, a fim de quantificar compartimentos do ciclo celular para estimar a percentagem de células distribuídas nas diferentes fases do ciclo celular.
Fluxo a análise de citometria de membrana mitocondrial potencial
a dissipação do potencial da membrana mitocondrial é considerada uma situação de perturbação mitocondrial antes da apoptose. Ela é causada por um aumento súbito na permeabilidade da membrana mitocondrial interna, conhecida como a transição de permeabilidade mitocondrial [14]. dano mitocondrial foi avaliada utilizando a sonda fluorescente lipofílico 5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’-tetra-etil-benzimidazol-carbocianina de iodeto de acordo com o protocolo do fabricante (JC-1; BD Mitoscreen JC-1 kit; Cat 51302). morte celular por apoptose foi avaliada em MCF-7 e células U87 tratadas com e sem PRE, EA-fração, Hex-fração e mistura de CE, UA e GA usando JC-1 mancha. Em resumo, a solução de trabalho de JC-1 foi preparada em tampão 1xAssay e adicionou-se 0,5 ml de JC-1 mancha para 1×10
6 MCF-7 ou células U87 durante 10 min a 37 ° C em CO
2 incubadora. As células foram lavadas duas vezes com tampão de ensaio 1x à temperatura ambiente e, finalmente, JC-1 de fluorescência foi medida utilizando um fluxo analítica Becton Dickinson FACScalibur citómetro (BD Biosciences, San Jose, CA). A percentagem de células de verde (530 nm) e a fluorescência foi analisada de JC-1 vermelho (590 nm).
imunotransferência
análises de imunotransf erência foi realizada para detectar a expressão de PARP e β- proteínas de actina em células tratadas e não tratadas MCF-7 e U87. As células foram plaqueadas em 25 cm
2 frascos a uma concentração de 4 x 10
5 e 20 h depois de terem sido expostos a PRÉ, EA, Hex e mistura de EC + AG + UA durante 24 h. As células foram recolhidas logo após o tratamento.
Todas as células recolhidas foram lavadas com PBS e as proteínas foram extraídas em tampão de lise celular (Tris 50 mM (pH 8,0), 150 mM de NaCl, 10% glicerol, 1% de NP-40 , 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS e 0,42% NaF) contendo inibidores de protease (1 mM de fenilmetilsulfonilo e 100 U /ml de aprotinina). As concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio de proteína do ácido bicinchonic e 40 ug de proteína de lisados a partir de cada amostra foi carregada em Tris-glicina Novex de 4-20% de gel gradiaent e a electroforese foi realizada em sistema de electroforese de NuPAGE (Invitrogen, EUA). As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF (Sigma), seguindo o protocolo padrão. As membranas foram sondadas com uma diluição 1: 1.000 de um anticorpo policlonal de coelho contra a PARP Ab-3 (Neo-marcadores, EUA) e o anticorpo monoclonal de ratinho contra β-actina (AC-15; ab6276; Abcam, EUA). As membranas foram bloqueadas em 5% de leite magro seco, feitos na hora em TBST (10 mM Tris-Cl, 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20) de tampão. Com fosfatase alcalina conjugada anti-IgG de murganho (Abcam, EUA), utilizado como anticorpo secundário, e a imunodetecção foi obtido por tratamento do blot com a solução de substrato de BCIP /NBT (Bangalore Genei, India). Toda a experiência foi repetida duas vezes.
ADN fragmentação ensaio
A fragmentação de ADN como um indicador da apoptose é um ensaio vulgarmente utilizado em estudos de interacção célula-droga. As células MCF7 e U87 (5 × 10
5 células /frasco) foram cultivadas durante 24 h e, em seguida, expostos a PRÉ, EA ou hex-fracção a uma concentração final de 100 ug /ml durante 24 h. As células foram lavadas uma vez com PBS gelado e ressuspensas em 250 ul de tampão de lise (10 mM de Tris-HCl, pH 7,6, EDTA 20 mM, pH 8,0 e 0,5% (w /v) de Triton X-100). Após centrifugação a 12.000 rpm durante 5 min, o sobrenadante foi extraído uma vez com fenol /clorofórmio (1: 1) e uma vez com clorofórmio /álcool isoamílico (24: 1). O DNA foi precipitado com acetato de sódio (pH 5,2) à temperatura de -20 ° C durante a noite. O ADN foi então sedimentado e subsequentemente digerido com ARNase isenta de ADNase (Amersham Biosciences UK Ltd., Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido) a 37 ° C durante 20 min. A electroforese foi levada a cabo num 2.0% (w /v) de gel de agarose e foi examinado num transiluminador de UV após coloração com brometo de etídio para determinar a extensão de fragmentação de ADN apoptótico.
semiquantitativa RT-PCR (transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase )
a expressão de Bcl-2, Survivin, cIAP, XIAP, GCLC (ligase subunidade catalítica glutamato-cisteína) e GAPDH foi analisada em células MCF-7 e células U87 após o tratamento com PRE, eA, Hex e mistura de CE + GA + UA. O ARN total foi extraído a partir de células usando o kit RNAeasy (Qiagen GmbH, Hilden Alemanha). Os cDNAs foram reverso transcrito a partir de 1 ug de ARN total de cada amostra utilizando Quantiscript Transcriptase Reversa, Quantiscript-RT-tampão e RT-iniciador-QuantiTect mistura de Transcrição Reversa (Qiagen GmbH, Hilden Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante.
a amplificação de cDNA foi levada a cabo em solução de 20 ul contendo 2 ul de cDNA, 10 pmol de pares de iniciadores para Bcl2, Survivina, XIAP, cIAP e GAPDH (iniciador para sequences- quadro a do ficheiro S1) e 10 ul de RT qPCR mestre mix (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). O PCR consistiu de uma desnaturação inicial a 94 ° C durante 5 min, seguido de 25 ciclos de reacção (30 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 60 ° C e 30 segundos a 72 ° C) e um ciclo final a 72 ° C durante 10 min. GAPDH foi utilizada como controlo interno. Os produtos de PCR amplificados foram separados por electroforese em gel de agarose e visualizado com brometo de etídio. A abundância de cada ARNm alvo foi detectado e normalizadas para GAPDH que de ARNm.
Determinação do nível de GSH
conteúdo de GSH celular total foi estimada através do método de Akerboom e Sies [15] em células MCF células -7 e U87 após o tratamento com o PRE, eA, Hex e CE + GA + UA. As células foram semeadas em 25 cm
2 frascos a uma concentração de 5 x 10
4 e quando as células atingiram confluência entre 75-80%, o PRE ou EA-fracção ou Hex-fracção ou CE + GA + UA foi adicionada durante 24 h. Ambos tratadas e células não tratadas eram mostradas em fosfato 0,1 M de solução salina tamponada com gelo (pH 7,4), e o volume foi completado até 1 ml. As células foram contadas num hemocitómetro e processadas para determinação do nível total de GSH, tal como descrito anteriormente [16]. Resumidamente, após a desproteinização por ácido 190 suspensão da amostra ul gelada 5-sulfossalicílico 10% foi feita e adicionou-se 700 de NADPH ul (0,3 mM), 100 ul de DTNB (6 mM) e 10 ul de GSH redutase (6 unidades /ml) e a densidade óptica das amostras foi medida a 412 nm utilizando o espectrofotómetro de UV-visível (Cecil série 1000, Camlab, Reino Unido). As concentrações de GSH foram determinados por comparação com padrões.
Estatísticas
Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (SD). A análise estatística dos dados foi realizada pelo teste t de valores e p . 0,05 foram considerados significativos
Os dados obtidos a partir de ensaios de sobrevivência clonogénica são representados como um ajuste de curva sigmoidal com uma escala linear X, a função utilizado foi de Boltzmann. O valor de Y em X
0 é considerada como sendo a meio caminho entre os dois valores limites no eixo Y e isto é considerado como sendo a concentração de inibidor de valor 50 (IC
50).
resultados
Efeito sobre clonog�icas
eficiência
células MCF-7 e U87 foram tratadas com diferentes concentrações de PRE e EA-, sextavada e frações extraído-butano. Considerando PRE, EA-fração e Hex-fração provocou redução dependente da dose na eficiência de clonagem em ambas as linhas celulares (Fig 2A-2D) da fração-butanol não fazê-lo (Fig 2B). No entanto, o grau de redução na eficiência de clonagem em ambas as linhas celulares foi máxima com o PRE. O valor de concentração de inibição (IC
50) deduzido a partir do gráfico foi Sigmoidal encaixar 39,34 ug /ml, com PRÉ enquanto que para EA foi de 48,4 ug /ml em células MCF-7. Para U87, esses valores foram de 64,2 e 134,3 mg /ml (Fig 2A) com PRE e EA-fração, respectivamente.
Após o tempo indicado do tratamento, as células foram mantidas sem materiais de teste por 10 dias. No dia 10, as colónias que cresceram foram contadas e a percentagem de fracção de sobrevivência foi então calculado e mostrado em (A e B) em células MCF-7 e (C e D) em células de U87. Os resultados foram expressos em média ± SD de três determinações independentes.
PRE e EA-fração matar mais células cancerosas do que as células normais
As frequências das células mortas são mais nas células cancerosas do que os linfócitos normais depois do tratamento com pré-EA ou fracção (Tabela 1). Aumento significativo nas células sub-G1 nas linhas celulares de cancro (medido por FACS) em relação aos linfócitos normais depois do tratamento com pré ou EA-fracção também apontam para o aumento da apoptose em células MCF-7 e U87 (Fig A no ficheiro S1) .
análise de citometria de fluxo de células após o tratamento com o extracto
a distribuição de células em diferentes fases do ciclo celular foi determinada por análise de citometria de fluxo do conteúdo em ADN em células MCF-7 ( Figura 3A) e células U87 (Fig 3B). Como mostrado na figura, não se observou qualquer acumulação significativa de células em qualquer fase em qualquer das linhas de células tratadas. No entanto foi observado o aumento da fracção de células na fase sub-G1, em amostras tratadas com PRÉ (49% em células MCF-7 e 45% em células U87) e EA-fracção (MCF-7: 31%, U87: 21%). O painel direito da Fig 3A e 3B mostrou aumento significativo na frequência de células sub-G1 após o tratamento com PRE e EA-fração. Hexano-fracção não alterou a frequência em células em fase sub-G1.
Painel direito-A percentagem de células em diferentes fases tanto MCF7 e células U87 com e sem tratamento. Os valores são a média ± SEM de três experiências independentes. * P 0,05, Students’t-teste, em comparação com o controlo não tratado
Análise do potencial de membrana mitocondrial por marcação JC1 revelou que a percentagem de células polarizadas foi significativamente reduzida em ambos MCF-7 e U87. células após tratamento com PRE, eA ou mistura de CE + GA + UA (Fig 4A e 4B; Fig B no Arquivo S1). A redução de células polarizadas foi menor com Hex-fracção em ambas as células. As células não tratadas exibiram principalmente fluorescência vermelha, indicando um potencial de membrana mitocondrial intacta. Sob tratamento PRE ou EA ou CE + GA + UA o número de células melhoradas, como mostrado por fluorescência verde. O painel direito da figura (Fig 4A e 4B) mostrou aumento significativo nas células com a despolarização da membrana mitocondrial após o tratamento com PRE, EA-fração ea mistura de CE + GA + UA.
A parte superior indica a percentagem de células que mostram a polarização da membrana mitocondrial e a parte inferior mostra a percentagem de células que possuem a despolarização da membrana mitocondrial. Todas estas experiências foram repetidas duas vezes. O painel direito mostra percentagem de células despolarizadas depois de cada tratamento. * P 0,05, teste t de Estudantes, em comparação com o controlo não tratado. (C) Efeito de PRÉ, hexano e acetato de etilo tratamento fracção solúvel na degradação de ADN e fragmentação em células MCF7 e de células U87. As amostras de ADN são rotulados como: (M) marcador de peso molecular, (1) as células não tratadas, (2) as células tratadas com fracção de hexano-, (3) as células tratadas com pré e (4) as células tratadas com fracção de acetato de etilo. Resultados são representativos de dois experimentos independentes. A concentração foi utilizado 100 ug /ml e o tratamento foi administrado durante 24 h.
fragmentação do ADN análise
Para validar a indução de apoptose por PRÉ, EA ou mistura de CE + GA + UA em ambas as células MCF-7 e U87, análise de fragmentação de DNA foi realizada (Figura 4C). Observou-se que o tratamento com pré e EA-fracção (100 ug /ml) durante 24 h mostrou a degradação de ADN em associação com a escada de ADN em células de U87 (painel 3 e 4), no entanto, em células MCF-7 degradação de ADN parcial e completa estava observada na pista 3 e 4, respectivamente sem escalonamento de ADN. degradação de ADN não pode ser observado nestas linhas celulares após tratamento com hexano-fracção durante 24 h. Tomados em conjunto, a fracção induzida degradação de ADN e EA PRÉ-solúvel tanto U87 e MCF-7cells que são as características bioquímicas da morte celular por apoptose.
A detecção da proteólise e nível de expressão de inibidores de apoptose de PARP-1
de modo a confirmar que a morte celular induzida por PRÉ, eA ou mistura de EC + AG + UA em ambas as células MCF-7 e U87 foi devido a apoptose, a clivagem de PARP foi medida em ambas as linhas celulares após 24 h de tratamento (Figura 5A). PARP-1 proteólise foi detectada após o tratamento com o PRE, a EA ea mistura de CE + GA + UA em ambas as células (Fig 5A). Consistente com esta observação, uma redução significativa na expressão de Bcl-2 em ambas as células MCF-7 e U87 também foi observada após tratamentos com PRÉ, fracção EA e os compostos-mix (Fig 5B e 5C). Tratamento com Hex-fracção não conseguiu reduzir o nível de Bcl-2 em ambos os tipos de células. Além Bcl2, a expressão de inibidores de proteínas de apoptose também foi reduzida após estes tratamentos em células MCF-7, enquanto que em células de U87 não foi observada tal redução.
(a) determinação da clivagem de PARP. painel inferior mostra a análise densitométrica quantitativa do nível de PARP com e sem clivagem nas células tratadas e não tratadas MCF-7 e U87. Os valores são a média ± SEM de três experiências independentes. Foram utilizadas duas amostras não tratadas independentes. Os valores são normalizados para os valores respectivos de p-actina. padrão de expressão de Bcl-2, survivina, XIAP e cIAP usando semi-quantitativo RT-PCR em (B) células U87 MCF-7 e (C) tratados com ou sem pre, EA, frações Hex e CE + GA + UA (duas amostras independentes). o painel do lado direito mostra a análise densitométrica quantitativa do perfil de genes nível de ARNm de expressão. Os valores são a média ± SEM de dois experimentos independentes e são normalizados para os respectivos valores GAPDH.
Nível de glutationa reduzida (GSH) e de expressão nível de GCLC
Nível de reduzida GSH em MCF-7 e células U87 é mostrado após o tratamento com PRE, eA, Hex e CE + GA + UA (Fig 6B e 6D). A concentração de GSH foi reduzida significativamente em ambos as células após o tratamento com o PRE, AE e CE + GA + UA.
Duas amostras não tratadas independentes foram utilizados neste estudo. painel inferior mostra a análise densitométrica quantitativa do perfil do nível de ARNm GCLC expressão. Os valores são a média ± SEM de duas expericias independentes e são normalizados para os valores respectivos de GAPDH. Níveis de glutationa em (B) células MCF-7 e células (D) U87 tratadas com ou sem PRE, EA, frações Hex e CE + GA + UA. Duas amostras independentes não tratadas foram usadas neste estudo. Os valores são média ± SEM de três experiências diferentes. * P . 0,05, teste t de Estudantes, em comparação com a ausência de tratamento
Esta redução de GSH-nível é acompanhado pela menor expressão de GCLC nas células MCF-7 e U87 tratados (Fig 6A e 6C).
Discussão
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porta-enxerto e erva inteira são comumente usados como medicina popular por nativos do nordeste da Índia, Nepal e Butão para variedade de doenças [8]. Usando várias técnicas analíticas com o extracto em bruto foi mostrado a presença de ácidos triterpénicos e do tipo B flavan-3-óis no extracto que são geralmente conhecidos para várias actividades biológicas [11]. partição solvente-solvente de extrato de metanol deu hexano, acetato de etila,
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butanol e extrato aquoso. O presente estudo demonstrou atividade anticâncer promissora do extrato metanólico bruto de
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raiz e sua EA-fração contra MCF-7 e U87 células. A concentração utilizada neste estudo para PRE, EA- e Hex-fracção foi de 100 ug /ml, que foi maior do que o indivíduo IC
50 valores. Todos os extractos foram avaliados anteriormente para actividades antioxidantes e citotóxicos e o EA-fracção foi encontrado como sendo o mais activo [10]. Neste estudo, foi observado que o tratamento com pré-EA ou fracção significativamente mortas mais células cancerosas do que células normais. Ambos PRE e EA-fração causada dose-dependente redução na eficiência de clonagem em ambas as linhas celulares, porém tal redução na clonagem-eficiência não foi observado com hexano e
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butanol-frações. Desde EA-fracção mostrou efeito inibidor do crescimento mais eficiente, que foi ainda purificado e testado quanto à sua actividade anti-cancro.
Anteriormente nove compostos e alguns flavan-3-óis monomérica e dimérica foi identificado e caracterizado a partir de EA-fracção do extrato de raiz de metanol de
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[10]. A partir destes nove compostos, três compostos viz., Epicatequina (EC), ácido gálico (GA) e ácido ursólico (UA) foram seleccionados e misturados em conjunto. A selecção de um destes compostos foi feita a partir de três sub-fracções diferentes e foi com base no seu mais elevado rendimento no que diz respeito ao montante; GA (3,6%), UA (3,3%) e CE (2,7%), em extracto bruto obtido em metanol [10,11]. UA foi encontrado para ser o composto mais ativo entre os triterpenos ácidos isolados com IC
50 5,3 e 7,8 M em DPPH
• e ABTS
+ • ensaio antioxidante [10,11].
neste estudo, as células MCF-7 foi mais sensível do que as células U87 desde redução significativa no crescimento celular foi obtida por concentração inferior de PRÉ e eA-fracção. Esta inibição no crescimento destas linhas celulares pode ser atribuída devido ou a inibição da proliferação celular ou morte das células. A análise de citometria de fluxo demonstraram um aumento da fracção de células em sub-G1 indicando a morte celular, que pode ser devido a apoptose. Para se obter evidência adicional para a apoptose, foi testado se as células que morrem exibiram outras características da morte celular programada. análise de citometria de fluxo demonstrou redução significativa de células polarizadas na membrana mitocondrial enquanto que os resultados immunoblot mostrou clivada da proteína PARP-1 em amostras tratadas com PRE, EA-fração ea mistura de CE + GA + UA. A PARP é activada numa fase intermédia de apoptose e é inactivada por clivagem proteolítica numa fase tardia por caspase3 e caspase7. Tal clivagem proteolítica da PARP é considerado como indicação de apoptose [17]. Assim apresentam resultados indicam que o extrato bruto de
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