Abstract
activação aberrante da via /β-catenina Wnt é essencial para a iniciação e progressão de mais de cólon cancros. Esta activação provoca a acumulação de β-catenina nuclear e a indução dos seus genes-alvo.
Apc
min /+
ratos são o modelo mais comumente usado para câncer de cólon. Eles abrigam uma mutação
Apc
alelo e desenvolver adenomas intestinais e carcinomas durante os primeiros meses de vida. Este fenótipo é causado pela mutação da segunda
Apc
alelo e a consequente acumulação de β-catenina nuclear nas células afectadas. Aqui nós descrevemos que o receptor da vitamina D (VDR) é um modulador importante dos níveis de β-catenina nucleares no câncer de cólon
in vivo
. Pela criação de animais adequado de
Apc
min /+
ratos e
VDR
+/-
ratos temos animais gerados expressam uma mutação
Apc
alelo e dois , uma, ou nenhuma
VDR
alelos de tipo selvagem. Falta de
VDR
aumentou o número de cólon focos de criptas aberrantes (ACF), mas não a de adenomas ou carcinomas em qualquer intestino delgado ou cólon. Importante, ACF cólon e tumores de
Apc
min /+ VDR
– /-
ratinhos tinham aumentado nuclear β-catenina e os tumores atingiram um tamanho maior do que as de
Apc
min /+ VDR
+ /+
. Ambos ACF e carcinomas no
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos mostraram maior expressão de β-catenina /genes alvo TCF. Em consonância com isso,
VDR
knock-down em células cancerígenas do cólon humano em cultura reforçada conteúdo e gene-alvo nuclear expressão β-catenina. Consistentemente,
VDR
depleção abolida a capacidade de 1,25 (OH)
2D
3 para promover a deslocação do β-catenina a partir do núcleo para a membrana do plasma e para inibir β-catenina /genes-alvo TCF. Em conclusão, VDR controla o nível de β-catenina nuclear em células de cancro do cólon e pode, por conseguinte, atenuar o impacto das mutações oncogénicas que activam a via /β-catenina Wnt
citação:. Larriba MJ, Ordóñez-P Morán , Chicote I, Martín-Fernández G, Puig I, Muñoz A, et al. (2011) Vitamin D Receptor Deficiência Melhora Wnt /β-catenina Sinalização e carga tumoral no câncer de cólon. PLoS ONE 6 (8): e23524. doi: 10.1371 /journal.pone.0023524
editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 23 Março, 2011; Aceito: 19 de julho de 2011; Publicado: 15 Agosto 2011 |
Direitos de autor: © 2011 Larriba et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Fondo de Investigación Sanitaria-Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, PI081356), Vall d’Hebrón Instituto de Oncologia, Olga Torres Foundation, Fundación de la Asociación Española de Lucha Contra el Câncer (AECC), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2010-18302) e Red Temática de Investigação Cooperativa en Câncer (ISCIII, RD06 /0020/0009). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do cólon é a segunda causa mais comum de morte por câncer nos países desenvolvidos [1]. Provavelmente, nós sabemos mais sobre as alterações genéticas que causam câncer de cólon do que para qualquer outra neoplasia sólidos. Mutações no
APC
/polipose adenomatosa coli,
CTNNB1
/β-catenina ou
Axin
genes que ativam Wnt via /β-catenina são responsáveis pela iniciação da maior parte do cólon cancros [2]. O primeiro passo de tumorigénese cólon envolve a formação de focos de criptas aberrantes (ACF), que mais tarde progridem para o adenoma [3]. Posterior malignização de adenoma para carcinoma exige a aquisição de novas alterações em genes que estão relacionados com a sinalização Wnt /β-catenina ou pertencem a outras vias que actuam em sinergia no processo [2].
Apc
min /+
camundongos portadores de uma linha germinal mutação de inactivação em um
Apc
alelo desenvolver múltiplas adenomas intestinais e carcinomas depois de três meses de idade [4]. Este fenótipo ocorre como uma consequência da mutação espontânea do restante
Apc
alelo (perda de heterozigosidade) e a activação da via de sinalização /β-catenina Wnt. Este modelo de camundongo tornou-se o padrão ouro da iniciação do câncer intestinal.
via Wnt /β-catenina regula a capacidade da proteína β-catenina para conduzir a regulação dos genes-alvo específicos [5], [6]. Em breve, na ausência de um sinal de Wnt ou mutações de activação, β-catenina está presente apenas ligada a E-caderina no intercelular
junções aderentes
, como a proteína livre é rapidamente fosforilada por caseína-quinase-Iβ ( CK-Iα) (Ser45) e glicogénio sintase quinase-3 (GSK-3β) (Ser33, Ser37 e Thr41) num complexo formado também por as proteínas supressoras de tumores APC e axina. rótulos de fosforilação p-catenina para a ubiquitinação e degradação pelo proteassoma [7]. Em tais condições basais proteínas do factor de células T ligado ao ADN /linfóides factor de intensificador (TCF /LEF) interagir com co-repressores transcricionais para bloquear a expressão do gene alvo no núcleo. A ligação de ligandos aos seus Wnt complexos do receptor da superfície celular (frizzled-LRP) resulta no recrutamento de Axin citoplasmática para a membrana plasmática, a activação de proteína Dishevelled e outros efeitos não bem caracterizadas que levam à inibição da fosforilação β-catenina. Isto permite β-catenina a acumular-se e entra para o núcleo, onde interage com TCF /LEF e membros da família faz com que a activação dos seus genes alvo em contrário reprimidos [5], [7]. A via /β-catenina Wnt é a principal força motriz para trás a proliferação de células epiteliais do cólon, e é essencial para a manutenção dos compartimentos progenitoras [8], [9]. No entanto, as mutações encontradas no cancro do cólon resultado na activação aberrante da via e induzir a expressão constitutiva dos seus genes-alvo (principalmente envolvidos na proliferação celular e desdiferenciação), conduzindo à formação de adenomas ainda durabilidade benignos. Acumulação de progressão genética e epigenética adicional tumor combustíveis alterações.
Muitos estudos epidemiológicos e experimentais indicam que a vitamina D
3 (colecalciferol), seu metabólito mais ativo 1α, 25-hidroxivitamina D
3 (calcitriol , 1,25 (OH)
2D
3) e vários análogos de proteger contra o cancro do cólon [10] – [12]. Nós relataram que a 1,25 (OH)
2D
3 inibe a proliferação e promove a diferenciação epitelial das células cancerosas do cólon humano através da indução da expressão de E-caderina e antagonizando a via /β-catenina Wnt. O último é o resultado de dois mecanismos principais: a) a indução da ligação directa do receptor da vitamina D (VDR), a p-catenina, o que impede a formação de complexos β-catenina /TCF transcricionalmente activos, e b) a indução de β -catenina exportação nuclear e relocalização na membrana plasmática
adherens junções
como consequência da e-caderina regulação positiva [13]. Além disso, a 1,25 (OH)
2D
3 aumenta a expressão de Dickkopf-1 (DKK1), uma proteína secretada que inibe a sinalização Wnt dos seus receptores de membrana plasmática [14]. Temos também descrito que o ser humano
gene VDR
é um alvo direto de SNAIL1 e repressores de transcrição /SLUG SNAIL2, e que a expressão VDR em pacientes com câncer de cólon é reduzida em estágios avançados da doença associados à regulação positiva desses fatores [15], [16]. expressão em conformidade, alta SNAIL1 /2 em células cancerígenas do cólon cultivadas aumenta a atividade transcricional β-catenina reprimindo a expressão VDR e a sua actividade antagonista sobre Wnt /β-catenina sinalização [16], [17].
β-catenina tem uma ampla gama de efeitos pleiotrópicos que não pode provavelmente ser explicada apenas pela modulação da acção TCF /LEF. Assim, β-catenina foi recentemente descrito para ligar vários factores de transcrição nucleares das superfamília de receptores e proteínas homeobox [13], [18], [19]. Na maioria dos casos, a ligação β-catenina aumenta a actividade transcricional destes factores e afecta a expressão de conjuntos alternativos ou adicionais de genes alvo envolvidas no destino celular ao longo do desenvolvimento, a homeostase do tecido, ou do cancro [19], [20]. A nossa descrição inicial da interacção directa da β-catenina com VDR em células de cancro do cólon humano foi confirmado em outros sistemas de células [21] – [24]. β-catenina /VDR interacção envolve a função 2-activador (FA-2) domínio de transactivação de VDR e o domínio C-terminal de β-catenina [21]. Na pele do rato, β-catenina /VDR controla os genes-alvo, o destino de células-tronco epiteliais e desenvolvimento do tumor [20]. Neste sistema, o aumento da β-catenina nuclear promovido iniciação do tumor enquanto ligandos do VDR proteger contra o cancro, reduzindo a força de Wnt /β-catenina sinalização [20]. Coerente com isso, o tratamento de
Apc
min /+
ratos com 1,25 de carga (OH)
2D
3 ou análogos reduz tumor [25] ou o número de pólipos e de carga [ ,,,0],26].
é importante realçar que o nível de β-catenina no núcleo definir a força do sinal de Wnt e em consequência o destino ou o comportamento de vários tipos de células normais e tumorais [5], [27]. Além de mutações de activação dos componentes da via Wnt /β-catenina, outras alterações genéticas como mutações em
K-RAS
[28] ou activação de vias de oncogénicos como HGF /c-Met sinalização [29] melhorar nuclear beta-catenin acumulação durante a progressão do câncer de cólon. Em tal cenário, os agentes capazes de diminuir o conteúdo nuclear β-catenina e assim atenuar sinal /β-catenina Wnt poderia ser potencialmente utilizado na terapia do câncer, enquanto as células tumorais mostram dependência via Wnt.
Neste estudo avaliar as consequências de
VDR
deficiência na iniciação e desenvolvimento de câncer intestinal impulsionado pela ativação de Wnt via /β-catenina. O efeito da
VDR
ausência foi analisada tanto
in vivo
e
in vitro
: em tumores gerados no
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos e em células cancerígenas do cólon humano em cultura em que
VDR
expressão foi knocked-down por meio de shRNA. Além disso, temos estudado o efeito da VDR reconstituição em células cancerígenas do cólon humano VDR-negativo. Nossos resultados estabelecer uma ligação directa entre a função VDR e os níveis de β-catenina nuclear que é crucial para controlar a atividade de sinalização de Wnt /β-catenina no câncer de cólon
In vivo
.
Resultados
Usando disponível
Apc
min /+ Comprar e
VDR
+/-
ratos foram geradas por passagens apropriadas
Apc
min /+ VDR
+ /+, Apc
min /+ VDR
+/-
e
Apc
min /+ VDR
– /-
animais. A análise histológica aos cinco meses de idade revelou que
deficiência VDR
não afetou o número total de tumores em
Apc
min /+
ratos, quer no intestino delgado ou no cólon (Figura 1a, 1b). Em contraste, os tumores do cólon em
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos foram significativamente maiores do que em
Apc
min /+ VDR
+ /+
ou
Apc
min /+ VDR
+/-
ratos (Figura 1c). Embora diferentes em tamanho, os adenomas carcinomas do cólon e foram histopatologicamente equivalente em todos os ratos independentemente de o seu estado VDR (Figura 1D). Além disso, o número de ACF colônica foi maior no
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos do que em
Apc
min /+ VDR
+ /+
ou
Apc
min /+ VDR
+/-
ratos (Figura 2a).
número total de tumores (adenomas e carcinomas) no intestino delgado (a) ou no cólon (b) da
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/-
e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos. Cada ponto corresponde a um rato analisadas ea linha horizontal indica a média. (C) Tamanho de tumores do cólon (adenomas e carcinomas) de
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+ /- Comprar e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos. Cada ponto corresponde a um tumor analisadas e a linha horizontal que indica a média. O p-valor para o one-way análise de variância é mostrado. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre os grupos, mediante Bonferroni de comparações múltiplas pós-teste. (D) as imagens hematoxilina /eosina representativos de carcinomas do cólon de
Apc
min /+ VDR
+ /+ Comprar e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos. barra de escala, 300 mm.
(a) Número total de ACF do cólon em
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/-
e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos. Cada ponto corresponde a um rato analisadas ea linha horizontal indica a média. (B) painéis superiores, imagens de coloração hematoxilina /eosina representativos da ACF do cólon em
Apc
min /+ VDR
+ /+ Comprar e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos. As setas indicam a ACF. Barra de escala, 50 mm. painéis de média, das imagens de imunofluorescência representativas que mostram a expressão β-catenina e localização na ACF cólon de
Apc
min /+ VDR
+ /+ Comprar e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos. As setas indicam a ACF. barra de escala, 100 mm. painéis inferiores são uma ampliação de painéis de média. Barra de escala, 50 mm. (C) A quantificação do nível nuclear β-catenina em ACF cólon de
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+ /- Comprar e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos. Cada ponto corresponde a uma lesão analisados e a linha horizontal que indica a média. (D) A quantificação do nível nuclear β-catenina em adenomas do cólon e carcinomas de
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/-
e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos. Cada ponto corresponde a uma lesão analisados e a linha horizontal que indica a média. (A, c, d) Os valores p para one-way análise de variância são mostrados. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre os grupos, mediante Bonferroni de comparações múltiplas pós-teste.
Em seguida, avaliou o estado da ativação da via Wnt em lesões do cólon através da análise de expressão de β-catenina. Embora ACF no
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/-
e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos eram indistinguíveis por hematoxilina /eosina (/e H) coloração, observou-se um aumento líquido nos níveis de β-catenina nucleares e citosólicos na ausência completa de
VDR
(Figura 2b). Considerando coloração β-catenina foi alta e bastante homogênea entre células em ACF (Figura 2b), foi muito heterogêneo em carcinomas dos três tipos de animais (Figura S1A). Este fenómeno também foi observada em carcinomas do cólon primários humanos (Figura S1B), em que o nível de β-catenina nuclear é heterogéneo e, provavelmente, define o potencial tumorigénico das diferentes populações de células cancerosas presentes no tumor [29]. Esta heterogeneidade pode explicar porque um aumento estatisticamente significativo no nível de β-catenina nuclear foi encontrado em ACF da
Apc
min /+ VDR
– /-
em comparação com
Apc
observou min /+ VDR
+ /+
ou
Apc
min /+ VDR
+/-
ratos (Figura 2c), mas apenas uma tendência menor em adenomas e carcinomas (Figura 2d).
Para demonstrar um nexo de causalidade entre o
VDR
perda e o aumento da β-catenina nuclear, que estudamos SW480-ADH células cancerígenas do cólon humano em que
VDR
foi knocked-down por meio de shRNA. Estas células abrigar mais de anormalidades genéticas que caracterizam cancros do cólon avançadas, tais como mutação do
APC
e
TP53
genes supressores de tumor, ativação de
K-RAS
oncogene e
c-myc
amplificação [13]. De acordo com o
in vivo
resultados, um forte aumento no teor de β-catenina nuclear foi encontrado em células shVDR SW480-ADH, em comparação com células shControl (Figura 3a, 3b). Além disso,
VDR
knock-down abolida a capacidade de 1,25 (OH)
2D
3 para induzir a expressão de E-caderina e β-catenina deslocalização do núcleo para a membrana plasmática ( Figura 3a). Além disso,
VDR
knock-down impediu a reorganização do citoesqueleto β-tubulina e a mudança na morfologia celular induzida por 1,25 (OH)
2D
3 que leva à formação de células epitelióides compacto ilhas (Figura 3b).
imagens de imunofluorescência mostrando representativos β-catenina e e-caderina (a) ou β-catenina e β-tubulina (b) expressão e localização em células SW480-ADH infectadas com lentivírus expressando shVDR ou shControl e tratou-se com 1,25 (OH)
2D
3 ou veículo durante 72 h. Barra de escala, 20 ^ m.
Nós fato para analisar se o aumento do nível de β-catenina nuclear traduzido em uma sinalização /β-catenina mais forte Wnt. Para este fim, foi estudada β-catenina /TCF-dependente de transcrição em células de cancro do cólon. shControl células SW480 e shVDR-ADH foram infectadas com lentivírus que codifica a proteína eGFP repórter sob o controlo de sete cópias de um consenso TCF /LEF local de ligação (Figura 4a) [30]. A presença no construto lentiviral do mCherry proteína fluorescente vermelha controlado por um promotor constitutivo permitiu identificar células infectadas sob um microscópio de fluorescência e por citometria de fluxo. Da mesma forma para p-catenina coloração em tumores do cólon, encontramos certa heterogeneidade da actividade /TCF β-catenina entre a cultura de células: A expressão em células eGFP variável igualmente infectados (Figura 4b). A análise de toda a população de células por citometria de fluxo mostrou que a percentagem de células de alta EGFP foi superior em shVDR do que em culturas de células shControl (Figura 4c). Além disso, as células tinham um shVDR significativamente maior do que da média dos sinais eGFP shControl células (Figura 4d). Descobrimos também que a diminuição da acumulação de eGFP causada por 1,25 (OH)
2D
3 em células shControl (redução da percentagem de células de alta-EGFP e da média do sinal eGFP) foi atenuada em células shVDR ( Figura 4c, 4d).
(a) Diagrama do construto lentiviral 7xTCF /LEF-eGFP-SV40-mCherry usado para infectar células shControl e shVDR SW480-ADH. (B) representativas de contraste de fase e imagens de fluorescência mostrando a expressão de eGFP e mCherry em células SW480-ADH infectadas com o vector 7xTCF /LEF-eGFP-SV40-mCherry. As setas indicam células que têm expressão variável de eGFP semelhante infectado. Barras de escala, 20 um. (C) análise de citometria de fluxo da expressão de GFP em células shControl e shVDR SW480-ADH infectadas (mCherry positivo) com o vector 7xTCF /LEF-eGFP-SV40-mCherry e tratou-se com 1,25 (OH)
2D
3 ou veículo durante 96 h. Percentagem de células em cada porta é indicada. (D) quantificação da citometria de fluxo de dados que mostram a expressão de GFP em média as células mCherry-positivas infectadas. Os dados correspondem a três experiências independentes. O p-valor para o one-way análise de variância é mostrado. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre os grupos, mediante Bonferroni de comparações múltiplas pós-teste. (E) Análise por qRT-PCR de
VDR
,
AXIN2
,
LEF1
e
c-MYC
expressão de mRNA em shControl e shVDR SW480- células de ADH tratados com 1,25 (OH)
2D
3 ou veículo durante 48 h. A média geométrica da expressão de genes de manutenção SdhA e TBP foi utilizado para normalização expressão de ARN, tal como indicado em Materiais e Métodos. Os números indicam a percentagem de inibição por parte de 1,25 (OH) 2D3 tratamento em cada tipo de célula. Os dados correspondem a três experimentos independentes
É importante ressaltar que a elevação dos níveis de β-catenina nucleares se refletiu em um aumento da expressão de vários β-catenina /TCF genes-alvo:. Níveis de análise de qRT-PCR revelou mais elevados de
AXIN2
,
LEF1
e
c-MYC
mRNA em shVDR do que em células shControl (Figura 4e). Além disso, a inibição da expressão de genes alvo β-catenina /TCF de 1,25 (OH)
2D
3 foi reduzido em células shVDR (Figura 4E). A redução da expressão de VDR por shRNA foi também analisado por qRT-PCR (Figura 4E) e traduzido para níveis não detectáveis de proteína ([31] e dados não mostrados). Como controle, estudaram a expressão de
CDH1
/E-caderina e
CYP24A1
nestas células, dois genes 1,25 (OH)
2D
3-alvo. A indução de ambos os genes foi drasticamente inibida em células shVDR (Figura S2A).
Em seguida, estendemos nossos estudos para outras linhas celulares de cancro do cólon humano.
VDR
knock-down em células HCT116 e HT29 também promoveu um aumento nos níveis de β-catenina nuclear (Figura S2B) ea ativação de transcrição TCF /LEF-dependente (Figura S2c), levando a uma maior expressão de os genes alvo β-catenina
AXIN2
e
DKK1
(Figura S2D). Tal regulação do gene foi acompanhada de uma perda geral de organização epitelial (Figura S2B). Como esperado, a redução de
VDR
expressão bloqueou a capacidade de 1,25 (OH)
2D
3 para induzir o seu gene alvo
CYP24A1
(Figura S2D). No entanto, e contrariamente aos dados a partir de células SW480-ADH, 1,25 (OH)
2D
3 não teve nenhum efeito sobre a localização β-catenina ou a actividade de transcrição em células HCT116 e HT29 (Figura S2D e dados não mostrados) . A razão pode ser que estas células expressam elevado nível de E-caderina e, assim, β-catenina localiza-se na membrana plasmática na ausência de 1,25 (OH)
2D
3.
expressão transitória de exógena tipo VDR selvagem em células cancerígenas do cólon metastático SW620 humana VDR-negativos reduziram seus níveis de β-catenina nucleares elevadas (Figura S3). Em contraste, VDR- ΔAF2 e VDR-L417S mutantes que são incapazes de se ligar β-catenina e recrutar coativadores clássicos [21] não alterar o conteúdo nuclear de β-catenina (Figura S3). Do mesmo modo, a expressão de um mutante incapaz de se ligar VDR coativadores clássicos, mas capaz de se ligar β-catenina (VDR-E420Q) [21] não teve efeito sobre o conteúdo nuclear β-catenina em células SW620 (Figura S3).
o aumento observado no teor de β-catenina nuclear pelo
VDR
knock-down não é uma consequência da actividade reduzida das cinases CK-Iα ou GSK-3 uma vez que o nível de fosforilação β-catenina em Ser45 ou Ser33 /Ser37 /Thr41 permaneceu inalterada em células shVDR SW480-ADH (Figura S4A). Como fosforilação β-catenina em Ser552 e Ser675 pela proteína quinase A e /ou AKT tem sido proposto para promover a localização nuclear β-catenina e /ou a actividade de transcrição [32] – [34], também analisamos a possibilidade de que essas quinases estiveram envolvidas no efeito de VDR knock-down em β-catenina. Descobrimos que a fosforilação β-catenina em Ser552 e Ser675 foi reduzida em células shVDR SW480-ADH (Figura S4).
Em seguida, teve como objetivo confirmar o efeito da deficiência de VDR no alvo β-catenina genes
in vivo
. Para este fim, foram analisadas por imunof luorescência e quantificado o nível de expressão de dois genes alvo TCF /β-catenina (
CCND1
/Ciclina D1 e
LEF1
) em ACF carcinomas do cólon e de
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/-
e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos. Em conformidade com os dados de células em cultura, um aumento da expressão significativa de ambos os produtos do gene foi encontrado nas lesões de
Apc
min /+ VDR
– /-.
Ratos (Figura 5)
a quantificação da ciclina D1 (a) e LEF1 (d) a expressão da proteína em lesões do cólon de
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/-
e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos. Cada ponto corresponde a uma lesão analisados e a linha horizontal que indica a média. Os valores p para one-way análise de variância são mostrados. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre os grupos, mediante Bonferroni de comparações múltiplas pós-teste. imagens de imunofluorescência representativa mostrando β-catenina e ciclina D1 (b, c) ou β-catenina e LEF1 (E, F) Expressão e localização em ACF cólon (b, e) e carcinomas (C, F) a partir de
Apc
min /+ VDR
+ /+ Comprar e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos. As barras de escala, 50 uM (b, e) e 200 um (C, F). Os asteriscos indicam uma coloração inespecífica.
Por fim, analisamos o grau de diferenciação da ACF e carcinomas presente no cólon de
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/-
e
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos. Os anticorpos contra citoqueratinas (pan-citoqueratina) e villin1 como foram utilizados marcadores de diferenciação epitelial (Figura S5). ACF expressa muito baixos níveis destas proteínas como esperado a partir do fenótipo de células progenitoras imposta pela alta sinalização /β-catenina Wnt (Figura 6A, 6B). Em carcinomas da expressão de ambos os marcadores foi heterogénea (Figura 6c, 6d), que concorda com a expressão heterogénea de β-catenina anteriormente descrito (Figura S1a). Não há diferenças substanciais na expressão de citoqueratinas e villin1 foram encontrados entre as lesões de
Apc
min /+ VDR
+ /+
,
Apc
min /+ VDR
+/-
e
Apc
min /+ VDR
– /-
camundongos, sugerindo que estes dois marcadores de diferenciação são perdidos precocemente durante tumorigênese cólon, provavelmente em consequência da activação inicial da via Wnt /β-catenina.
imagens de imunofluorescência mostrando representativos β-catenina e villin1 (a, C) ou β-catenina e pan-citoqueratina (b, d) expressão e localização no cólon ACF (um , b) e carcinomas (c, d) a partir de
Apc
min /+ VDR
+ /+ Comprar e
Apc
min /+ VDR
– /-
camundongos. Pontilhada linhas delimitam ACF. Os números indicam as regiões com diferentes padrões de expressão das proteínas analisadas no mesmo tumor: 1) elevada β-catenina, baixo villin1 /citoqueratinas; 2) baixo β-catenina, alta villin1 /citoqueratinas. As barras de escala, 50 ^ m (a, b) e 200 uM (c, d).
Discussão
O nível de β-catenina nuclear define a resistência da via Wnt /β sinalização -catenina e, consequentemente, o destino eo fenótipo de muitos tipos de células normais e cancerosas. activação aberrante de sinalização Wnt /β-catenina, devido a alterações em componentes da via é responsável pela iniciação da maioria dos cancros do cólon humano, que destaca a importância de controlar a acumulação nuclear β-catenina [28], [29], [35] . Embora o início do cólon é considerado tumorigénese clonal [36], carcinomas do cólon mostram expressão β-catenina nuclear em grande parte heterogénea. Isto é conhecido como o paradoxo β-catenina e tem levado a procurar vias alternativas de modulação local β-catenina e a actividade. Entre eles,
K-RAS
mutação e miofibroblastos derivados de HGF foram propostos recentemente para aumentar o conteúdo nuclear β-catenina [28], [29].
Muito pouco se sabe sobre os mecanismos para diminuir o nível de β-catenina no interior do núcleo. Nós descrevemos que a 1,25 (OH)
2D
3 e várias análogos calcémicos menos interferir na via /β-catenina Wnt de uma série de linhas celulares de cancro de cólon humano em vários modos: eles aumentam a ligação de VDR de p-catenina que dificulta a formação de complexos /TCF β-catenina, induzir a expressão do DKK1 inibidor de Wnt, e promover a deslocalização da β-catenina a partir do núcleo para a membrana de plasma onde se liga a e-caderina em
adherens junções
[13], [14]. mecanismos putativos para este último efeito incluem a indução de exportação nuclear β-catenina ou o sequestrante de proteína β-catenina sintetizada de novo e /ou citosólica por E-caderina, cuja expressão é altamente induzida por 1,25 (OH)
2D
3. Outro mecanismo de inibição /β-catenina Wnt no cancro do cólon tem sido proposto por Kaler e cols .: 1,25 (OH)
2D
3 diminui a síntese e a secreção por células THP-1 macrófagos de interleucina-1β, uma citoquina que activa a via /β-catenina Wnt em células de cancro de cólon por meio do bloqueio da fosforilação β-catenina por GSK-3β [37]. No entanto, a função de todos esses mecanismos de célula autónoma e não de células-autônoma
in vivo
permaneceu desconhecida.
Neste estudo examinou se
β Altera VDR
deficiência -catenina conteúdo nuclear e via Wnt /β-catenina no modelo animal mais utilizado para o câncer de cólon, o
Apc
min /+
ratos. Nossos resultados mostram que
VDR
deficiência em
Apc
min /+
ratos aumenta os níveis nucleares β-catenina e expressão de genes alvo Wnt /β-catenina e, em consonância com esses efeitos , aumenta a carga total de tumor do cólon. Consistentemente, batendo-down
VDR
por shRNA em células cancerígenas do cólon humano aumenta o conteúdo nuclear de β-catenina, a sua actividade de transcrição e a expressão de genes-alvo /β-catenina Wnt. Além disso, a restauração transitória de expressão VDR tipo selvagem em células cancerosas SW620 cólon humano VDR-negativos diminui o nível de β-catenina nuclear, enquanto VDR-ΔAF2, VDR-L417S ou mutantes VDR-E420Q, incapaz de se ligar coactivators clássicos e activar a transcrição de genes [21 ], nao fiz. Curiosamente, entre eles, apenas VDR-E420Q é capaz de se ligar β-catenina [21] e sua re-expressão em
VDR
– /- ratos resgata alopecia, mas não raquitismo fenótipo [38]. Parece, portanto, que o nível nuclear β-catenina e a actividade dependem da capacidade de VDR para recrutar coativadores transcricionais clássicos.
Os nossos dados mostram que VDR knock-down em células SW480-ADH não afecta β-catenina fosforilação por CK-Iα ou GSK-3β, descartando um papel de VDR regulação acumulação total de β-catenina. Considerando que o nível aumenta β-catenina nuclear na ausência de VDR, a quantidade de proteína celular total β-catenina não é alterada (Figura S4a). Inesperadamente, também descobrimos que a fosforilação de β-catenina em Ser552 e Ser675 proposto para aumentar β-catenina actividade transcricional é reduzido em células SW480 shVDR-ADH. No entanto, o efeito inibidor putativo que a redução destas fosforilações pode ter sobre a actividade de transcrição β-catenina parece ser ultrapassado pelo efeito da deficiência de VDR aumentar a translocação nuclear β-catenina. Em conjunto, esses dados sugerem que VDR não controla a degradação β-catenina, mas provavelmente favorece a sua redistribuição para o núcleo da célula.
Os nossos resultados revelam um romance
in vivo
função de VDR como modulador fundamental da intensidade do sinal /β-catenina Wnt no câncer de cólon. A constatação de que
deficiência VDR
não altera o número de tumores, mas aumenta a carga de tumor indica que VDR não bloqueia as mutações iniciais que provocam a activação precoce da via /β-catenina Wnt, mas que tem preferencialmente um efeito protector a longo prazo sobre o crescimento do tumor, limitando a força do sinal oncogénico de Wnt /β-catenina. Concordantes com nossos resultados, um relatório muito recente mostrou que
Apc
min /+ VDR
– /-
ratos apresentar tumores intestinais maiores do que
Apc
min /+ VDR
+ /+
ratos, embora os mecanismos moleculares por trás deste fenótipo não foi investigado [39]. A concordância dos dois estudos paralelos confirma as suas principais conclusões.
Os resultados do nosso estudo são relevantes para a clínica, como expressão de VDR é regulada negativamente em cerca de dois terços dos tumores do cólon avançadas associadas à regulação positiva de
SNAI1 Comprar e
SNAI2
genes que codificam para SNAIL1 /SNAIL2 repressores da transcrição [15], [16], [40]. barra de escala, 500 mm.