existem

Sumário

Os tumores sólidos em um microambiente hipóxico, e possuem metabólitos high-glicolíticas. Para evitar a acidose, as células tumorais têm de exibir um mecanismo de regulação do pH citosólico dinâmico (s). O canal de protões voltagem-HV1 medeia a função oxidase NADPH, compensando a perda celular de elétrons com prótons. Aqui, demonstramos pela primeira vez, que a expressão de HV1 é aumentada em tecidos de tumor colo-rectal e linhas celulares, associado com prognóstico pobre. A imuno-histoquímica mostrou que HV1 é fortemente expressa em adenocarcinomas mas não modesto ou expresso em colorrectal normal ou pólipos hiperplásicos. expressão hv1 no cancro colorectal é significativamente associada com o tamanho do tumor, classificação do tumor, estado linfonodal, estadiamento clínico e do estado p53. expressão HV1 alta está associada de forma significativa com a sobrevida global e livre de recidiva mais curto. Além disso, em tempo real de RT-PCR e imunocitoquímica demonstrou que HV1 é altamente expresso em linhas celulares de cancro colorrectal, SW620, HT29, Colo205 e LS174T, mas não em SW480. Inibições de expressão HV1 e da atividade nas células SW620 altamente metastáticas de pequena interferência RNA (siRNA) e Zn

2 +, respectivamente, notadamente diminuir a invasão e migração celular, extrusão contenção próton e a recuperação do pH intracelular. Os nossos resultados sugerem que HV1 pode ser utilizado como um biomarcador potencial para diagnóstico e prognóstico de carcinoma colorectal, e um alvo potencial para fármacos anti-cancerígenos em terapia do cancro colo-rectal

citação:. Y Wang, Wu X, Li Q, Zhang S, Li SJ (2013) Human Voltage-Gated Proton Canal HV1: Um potencial biomarcador Nova de Diagnóstico e prognóstico do câncer colorretal. PLoS ONE 8 (8): e70550. doi: 10.1371 /journal.pone.0070550

editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Centro, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Janeiro, 2013; Aceito: 19 de junho de 2013; Publicação: 05 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (31.271.464). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O canal de protões voltagem-HV1 foi identificado usando bioinformática pesquisas com base em canais catiónicos conhecidos, que é expresso principalmente nas células do sistema imunológico, tais como os macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e [1], [2]. HV1 em fagócitos de mamíferos foi proposto para ser responsável pela via de transporte de protões, que regula o pH intracelular durante o consumo de oxigénio associada com a fagocitose, chamado de “explosão respiratória” [3], [4]. Hv1 é ativado por despolarização e acidificação intracelular, cuja actividade mantém o pH intracelular neutro para manter espécies reactivas de oxigénio (ROS) geração [5], [6]. HV1 não só regula o pH no citoplasma, mas também pode fornecer protões no fagossoma, um compartimento membrana fechada para matar e digestão de um agente patogénico [3]. HV1 é extremamente selectivo para a H

+, sem permeabilidade a outros catiões detectáveis ​​[7], [8]. A relação de tensão de activação de HV1 depende fortemente tanto o pH intracelular (pH

i) e o pH extracelular (pH

O). o aumento do pH

o ou pH redução

i promove H abertura

+ canal deslocando o limite de ativação para potenciais mais negativos [3]. Além disso, a corrente HV1 é inibida por concentrações submillimolar de Zn

2+ e Cd

2 + e de outros cátions divalentes [9]

HV1 contém três domínios previsto:. N-terminal ácido e prolina domínio rico, transmembranar domínio tensão do sensor (VSD), e o domínio C-terminal.

+ canais voltagem-K são compostos de quatro subunidades, cada um dos quais tem um domínio de poros e uma VSD. Os quatro domínios de poros se juntam para formar um único poro central e quatro VSDs periféricos controlar o portão do poro [10]. Em contraste com o K dependentes da voltagem

+ canais, o HV1 contém um VSD, mas não possui o domínio de poro. Estudos recentes mostraram que as funções de HV1 como um dímero em que o domínio intracelular do terminal C é responsável pela arquitectura dimérica da proteína, e cada subunidade contém a sua própria via de transporte de protões-[11] – [14]. O domínio intracelular C-terminal de HV1 forma um dímero paralelo através de um

α

helicoidal em espiral enrolada e é essencial para a localização da proteína [14].

As células de tumor muitas vezes existem numa hipóxica microambiente, e possuem alta atividade-glicolítica e produzem metabólitos ácidos [15], [16]. Para evitar a acidose resultante da redução do pH citosólico, as células tumorais devem extrudir excessing protões citosólicas para manter o pH citosólico, que resulta no microambiente tumoral ácida. O microambiente do tumor hipóxico e ácido desempenha um papel chave no desenvolvimento do cancro, progressão, metástase e [15]. O nosso trabalho anterior mostrou que HV1 é especificamente expresso em tecidos de tumor da mama humano altamente metastáticas e linhas celulares, e promove a progressão de células de cancro da mama e de metástases, por meio de regulação de pH intracelular de células do cancro da mama [17], [18]. No presente estudo, foi investigada a expressão de HV1 em tecidos tumorais colorretais e linhas celulares e sua associação com características clínicas e sobrevida pós-resectional. Inibições de expressão e atividade HV1 nas células do câncer colorretal altamente metastáticas notadamente diminuir a invasão e migração celular, extrusão contenção de protões. Nossos resultados sugerem que HV1 sobre-expressão pode ser usada como um biomarcador independente para o prognóstico e diagnóstico de pacientes com câncer colorretal.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos dos procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração de Helsínquia e políticas relevantes na China. Obtivemos o consentimento informado por escrito de todos os participantes envolvidos no nosso estudo. A aprovação do estudo obtido ética para o nosso estudo do comitê de ética da Tonghua Centro Hospitalar.

Pacientes e amostras

amostras de tecido de câncer colorretal foram obtidas de pacientes submetidos à cirurgia curativa rotina no Departamento de Cirurgia , Tonghua Hospital Center entre 2001 e 2007. Os pacientes não foram pré-tratados com radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia. 139 tecidos de cancro colorectal e tecidos emparelhados colorectal não-tumorais adjacentes foram fixados em formalina a 10% e embebidos em parafina para análise imuno-histoquímica. As características clinicopatológicas destes pacientes foram mostrados na Tabela 1. Além disso, para verificar a expressão de HV1 em lesões pré-malignas displásicas, 10 colorrectal normal, 18 pólipo hiperplásico e 20 tecidos de adenoma também foram examinados usando imuno-histoquímica. estado clínico de cada paciente foi classificada de acordo com o grau do tumor patológico, tamanho do tumor, estado dos linfonodos. diferenciação do tumor foi classificado pelo sistema de classificação Edmondson. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Tonghua Centro de Ética do Hospital e consentimento informado foi obtido de cada paciente.

Geração de um anti-HV1 policlonal anticorpo

Um HV1 anti-policlonal anticorpo foi produzido contra o domínio do terminal carboxilo de HV1 (resíduos 221-273 de HV1, KTRSERQLLRLKQMNVQLAAKIQHLEFSCSEKEQEIERLNKLLRQHGLLGEVN). A proteína foi purificada até à homogeneidade após a expressão em

Escherichia coli

[19]. A proteína purificada foi injectada em ratinhos e o anticorpo policlonal anti-HV1 foi purificado por coluna de rProtein A Sepharose (GE Healthcare). HRP-conjugado de cabra IgG anti-rato foram adquiridos à Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA).

vector de expressão e transfecção

HV1 ADNc foi clonado em pEGFP-N1 (Clontech ) para criar o plasmídeo de expressão PHV1 HV1-EGFP, fundido com a proteína fluorescente verde melhorada EGFP porção () ligado ao C-terminal de HV1 [14]. 293 células T foram cultivadas em DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco; GIBCO) com 10% de soro fetal bovino acrescido de antibióticos (100 unidades /ml de penicilina e 100 g /ml de estreptomicina, Gibco) numa co 5%

2 incubadora a 37 ° C. As células cultivadas sobre lamelas de vidro a 50-70% de confluência numa placa de seis poços foram transientemente transfectadas com o plasmídeo PHV1-EGFP utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. As células foram usadas para experiências de 36-48 h após a transfecção.

Western blotting

transferência de Western foi realizada com um anticorpo policlonal anti-HV1 (1 mg /ml) tal como descrito acima com uma diluição final 1 de 1000. As proteínas desnaturadas foram separadas por 12,5% de SDS-PAGE e depois transferidos para uma membrana de PVDF (GE Healthcare) por dispositivos de molhagem electrotransferência. a absorção de proteína não específica foi prevenida usando 5% (w /v) de leite desnatado em solução salina tamponada com fosfato contendo 0,1% de Tween 20 (PBS-T) durante 1 h. a incubação do anticorpo primário em PBS-T foi realizada durante 1 h à temperatura ambiente. O anticorpo secundário anti-ratinho HRP-acoplado foi utilizado a uma diluição final de 1 15.000 em PBS-T, e a HRP foi revelada com um sistema de detecção quimioluminescente (Millipore).

A imuno-histoquímica

histológica diagnósticos de tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina tumorais e não tumorais foram confirmados em hematoxilina e-eosina. A imuno-histoquímica foi realizada com um anticorpo policlonal anti-HV1. O anticorpo anti-HV1 (1,0 mg /ml) foi diluído 100 vezes com PBST (solução salina tamponada com fosfato contendo 0,1% de Tween-20) contendo 1% (w /v) de BSA. As secções embebidas em parafina e encheram-se com 10 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) tampão (pH 8,0) foram aquecidos num forno de microondas durante 12 min. Após arrefecimento, as secções foram tratadas com 0,5% de Triton X-100 em PBS durante 10 minutos, exposta a 3% (v /v) de peróxido de hidrogénio (H

2O

2) durante 10 minutos para inibir a actividade da peroxidase endógena . Subsequentemente, os cortes foram incubados em PBST contendo soro de bovino fetal a 5% e BSA a 2% durante 30 min para reduzir a ligação não específica. A incubação com o anticorpo primário foi realizada durante a noite a 4 ° C numa câmara humidificada. anticorpo secundário anti-ratinho HRP-acoplado foi utilizado a uma diluição final de 1 400, durante 1 h. Finalmente, o sinal de visualização foi desenvolvido com diaminobenzidina (DAB) e as lâminas foram contrastadas em hematoxilina. O controlo negativo foi realizada para tratar com soro de rato não imune como o anticorpo primário em vez de anticorpo anti-HV1.

secções coradas foram avaliadas de forma cega, sem conhecimento prévio da informação clínica utilizando o marcador imunorreactivo alemão, imuno-reativa-Score (IRS). Resumidamente, o IRS atribui sub-scores para distribuição imunorreativa (0-4) e intensidade (0-3), em seguida, multiplica-los para produzir a pontuação IRS. A percentagem de positividade foi marcado como “0” ( 5%), “1” (5-25%), “2” (25-50%), “3” (50-75%), “4” ( 75%). A intensidade da coloração foi a pontuação de acordo com a área de coloração das células HV1-positivas como “0, -” (negativo, 5%), “1, +” (fracamente positivo, 5-25%), “2, ++ “(positivo, 25-50%), e” 3, +++ “(fortemente positiva, 50%). A pontuação HV1 expressão final foi calculada a partir dos valores de pontuação por cento positividade e pontuação da intensidade da coloração, que se variaram de 0 a 12. Estimou-se IRS calculando a média dos valores em oito campos de ampliação x 500 para cada espécime. Os níveis de expressão HV1 foram definidos da seguinte forma: baixa expressão (pontuação ≤3) e expressão alta (pontuação 3). A análise imunohistoquímica e pontuação foram realizadas por dois patologistas experientes independentes.

cultura celular

As linhas celulares de cancro colorrectal humano SW620, HT29, LS174T, Colo205 e SW480 foram cultivadas a 37 ° C em uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO

2 com meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, e 20 mM de L-glutamina.

imunocitoquímica

SW620, HT29, LS174T, células Colo205 e SW480 crescidas em lamelas de vidro em confluência em placas de cultura de tecidos de seis poços foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS à temperatura ambiente durante 30 min (v /w), lavadas em PBS, tratadas com 0,5% de Triton X-100 em PBS durante 20 minutos, exposta a 3% (v /v) de peróxido de hidrogénio (H

2O

2) durante 15 min, e bloqueadas com 5% fetal de soro de bovino e 2% de BSA em PBST, durante 20 min à temperatura ambiente. As lamelas bloqueadas foram incubadas com o anticorpo anti-HV1 (1,0 mg /ml) a uma diluição de 1 200 com PBST contendo 1% (w /v) de BSA a 37 ° C durante 1 h. Após lavagem em PBS três vezes, as lamelas foram ainda incubadas com um anticorpo secundário acoplado a HRP anti-rato a uma diluição final de 1 400, durante 1 h. Os sinais foram visualizados pelo sistema HRP /DAB. Os núcleos das células foram coradas com hematoxilina.

Quantitative real-time PCR

Os níveis de expressão de ARNm de HV1 em SW620, HT29, LS174T, Colo205 e células SW480, foram avaliadas por quantitativo em tempo real PCR utilizando ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os ARNs totais foram extraídos utilizando RNAiso Reagente (Takara), e sujeitos a transcrição reversa de MMLV por Super transcriptase (Takara). quantitativa de transcrição reversa PCR em tempo real foi realizado com o kit de SYBR PrimeScriptTM RT-PCR (Takara) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores foram como se segue: HV1, 5′-CAGGTCATCATCATCTGCTTG-3 ‘(directo) e 5′-CCGTTCTGAACGTGTCTTAAC-3′ (reversa); GAPDH, 5’-CCAAGGTCATCCATGACAAC-3 ‘(directo) e 5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’ (inverso). condição térmica de PCR usado foi: 94 ° C durante 30 s; emparelhamento, 52 ° C durante 30 s; extensão, 72 ° C durante 30 s. Os níveis de expressão de ARNm relativos das proteínas foram calculados de acordo com a equação: 2

-ΔΔCT, em que ΔΔCT = (CT

HV1 – CT

GAPDH) – (CT

HV1 – CT

GAPDH )

SW620. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

Imunofluorescência

SW620 e SW480 crescidas células em lamelas de vidro foram fixadas com 4% (v /v) de paraf ormaldeído em salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente durante 30 min, lavadas em PBS, tratadas com 0,5% de Triton X-100 em PBS durante 20 min, e bloquearam-se com soro de bovino fetal a 5% e BSA a 2% em PBST durante 1 h. As lamelas bloqueadas foram incubadas com anticorpo anti-HV1 (1,0 mg /ml) a uma diluição de 1 200 em 2% de BSA, a 4 ° C durante a noite. Depois de se lavar com PBS durante 5 minutos por quatro vezes, as lamelas foram incubadas durante mais 1 h à temperatura ambiente com uma IgG anti-ratinho de cabra conjugado com FITC numa diluição de 1 400 em 2% de BSA, seguido por outra lavagem tal como acima descrito . imagens confocais de FITC de fluorescência de células SW620 e SW480 foram registados num microscopia confocal Leica TCS SP5 (Leica, Alemanha) com o conjunto de FITC-filtro para o filtro de HV1 e DAPI definido para o corante de DAPI nuclear. As imagens foram posteriormente processados ​​por software Adobe Photoshop.

expressão de mRNA Suprimindo HV1

A sequência do siRNA visando o gene HV1 foi 5′- CTACAAGAAATGGGAGAAT-3 ‘e a sequência sentido aleatório foi 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘, os quais foram obtidos a partir de Ribobio (Cantão, China) [17]. células SW620 crescidas em confluência foram passados ​​em placas de 6 poços a 30% de confluência e foram incubadas durante a noite, em seguida, transfectadas com o siARN e o controlo negativo, respectivamente, utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen), de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração final de ARNip foi de 100 nM. Silenciamento foi examinada 48 h após a transfecção. A eficiência de siARN na supressão da expressão HV1 foi determinada por quantitativa PCR em tempo real, imunocitoquímica e transferência de Western utilizando anticorpo anti-HV1 como descrito acima.

cinética da migração

Para examinar o efeito de HV1 sobre a capacidade migratória de células de câncer colorretal, migrações de SW620, SW480 e SW620 células regulada para baixo expressão HV1 e atividade HV1 inibida por siRNA e Zn

2 + respectivamente, foram avaliadas no modelo monocamada ferida. Para regular negativamente a expressão HV1, SW620 células foram cultivadas até à confluência e transfectadas com ARNsi de controlo negativo e durante 24 h, respectivamente. Para inibir a actividade HV1, solução 1 M de ZnCl foi adicionado para o meio de DMEM a uma concentração final de 100 uM [1], [2]. As células SW620 e SW480 foram plantadas em uma placa de 24 poços (1,5 × 10

5 por poço) e cultivadas durante 24vh até à confluência e, subsequentemente, com uma ponta ferido. movimento celular foi observada por microscopia de contraste de fase, e foram capturadas com uma câmera digital a cada 12 h.

invasão e migração ensaios

In vitro

invasão e migração ensaios foram realizados para avaliar os efeitos da HV1 sobre habilidades invasivas e migratórias de SW620 e células SW480. células SW620 e SW480 foram cultivadas em placa de seis poços em meio DMEM com 10% de FBS a confluência, transfectadas com o ARNsi de controlo negativo, respectivamente e durante 24 h, e depois tripsinizadas, lavadas e contadas. Para a invasão de células, Transwells com filtros de 8 um de tamanho de poro (Millipore) foram cobertos com Matrigel (Becton Dickinson) e inseridos em placas de 24 poços. E para a migração de células, os transwells não foram revestidas com Matrigel. meio DMEM (500 uL) contendo 10% de FBS foi adicionado para a câmara inferior, e 200 ul de uma suspensão de células (5 × 10

4 células) foram colocados na câmara superior. As placas foram incubadas a 37 ° C em atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 durante 24 h. Para inibir a actividade HV1, solução 1 M de ZnCl foi adicionado para o meio de DMEM a uma concentração final de 100 uM [1], [2]. As células foram fixadas penetradas por paraformaldeído, coradas com solução de violeta cristal, e fotografados. Cada experimento foi realizado quatro vezes. As taxas de migração e invasão foram calculadas como [celular No. migração de célula de ensaio /migração Número de controle

SW620] × 100% e [celular No. invasão da célula de ensaio /invasão Número de controle

SW620] × 100%, respectivamente.

actividade de HV1 canal

a actividade de HV1 em células de cancro colo-rectal foi avaliada como uma alteração no pH intracelular (pH

i), em resposta à despolarização da membrana por BCECF fluorescência [11]. As células foram incubadas com 3,0 uM de BCECF-AM (Molecular Probe) em meio DMEM isento de soro durante 30 min, respectivamente, e lavou-se com solução de PSS (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, glucose 5 mM, CaCl 1 mM de

, MgCl2 1 mM de

2, 20 mM de Tris, pH 7,5) por 3 vezes. As células foram incubadas com NH

4Cl /NMDG (N-metil-D-glucamina) solução (NMDG 100 mM, NH 40 mM

4Cl, KCl 5 mM, glucose 5 mM, CaCl 1 mM de

2, 1 mM MgCl

2, 20 mM de Tris, pH 7,3) durante 20 min e lavou-se por solução livre de amónio (NMDG 140 mM, KCl 5 mM, glucose 5 mM, CaCl 1 mM de

, MgCl2 1 mM de

2, 20 mM Tris, pH 7,4), rapidamente induzir acidificação intracelular [5]. despolarização da membrana foi conseguida por carregamento de alta K

+ solução (KCl 145 mM, glucose 5 mM, CaCl 1 mM de

, MgCl2 1 mM de

2, 20 mM de Tris, pH 7,5). pH intracelular muda células carregadas com ácido foram detectados pela sonda fluorescente BCECF em comprimentos de onda de excitação de 490 nm e 440 nm e um comprimento de onda de emissão de 525 nm sob condições despolarizantes membrana utilizando RF-5301PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu, Japão).

as medições de pH intracelular

intracelular pH foi medido utilizando o pH sensível sonda fluorescente BCECF-AM. As células cultivadas em monocamadas foram incubadas com 3,0 uM de BCECF-AM (Molecular Probe), em meio DMEM isento de bicarbonato, a 37 ° C durante 30 min. Após o carregamento, as células foram lavadas três vezes com tampão HEPES para remover o corante extracelular, e feito para permanecer na memória intermédia idênticos. O tampão HEPES continha NaCl 140 mM, KCl 5 mM, MgSO 1 mM de

4, CaCl 1 mM de

2, NaH 1 mM de

2 PO?

4, glicose 5,5 mM, e 20 mM de HEPES, pH 7.4. A fluorescência a comprimentos de onda de excitação de 490 nm e 440 nm foi registada a um comprimento de onda de emissão de 525 nm utilizando RF-5301PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu, Japão). A calibração de fluorescência vs pH foi realizado por equilíbrio de pH externo e interno com nigericina (10 mM) em um elevado K

+ tampão com uma gama de pH entre 5,5 a 8,0. A alta K

+ tampão continha KCl 145 mM, glucose 5 mM, CaCl 1 mM de

, MgCl2 1 mM de

2, e HEPES a 20 mM (ou MES). Os valores da relação de fluorescência relativa foram plotados contra a pH

i valores, o que permitiu a determinação do pH desconhecido

correspondente i.

A análise estatística

Todas as estatísticas foram realizadas utilizando SPSS16.0 Programas. dados de medição foi representado como média ± SD. Comparação da média entre os grupos foi realizada pelo

t

teste.

valores P Restaurant 0,05 foram considerados significativos. A análise de sobrevida foi avaliada usando o método e sobrevivência de Kaplan-Meier taxa foi comparadas pelo teste de log-rank.

Resultados

achados clínico-patológicas

perfis clínico-patológicas dos 139 casos selecionados para este estudo foram revisados ​​na Tabela 1. A média de idade dos pacientes foi de 62,4 anos (variando de 36-76), incluindo 68 homens e 71 mulheres. As localizações dos seus cancros foram 29 casos do lado esquerdo e 43 do cólon do lado direito, e 47 reto, respectivamente. Entre os 139 casos ressecados, o tamanho do tumor primário variada como se segue: 5 cm em 72 casos, e ≥5 cm em 67 casos. Vinte dos 139 tumores mostraram fraca diferenciação citológica. A extensão do tumor foi limitada (T1 ou T2) em 45 casos e avançado (T3 ou T4) em 94 casos. Metástase do tumor para os nódulos linfáticos foi observada em 59 dos 139 casos.

A expressão aumentada de HV1 no cancro colorectal

HV1 expresso em células do sistema imune está associado com a “explosão respiratória” [3], [ ,,,0],4], mas a sua função na tumorigénese não tenha sido identificada. Para investigar HV1 para utilização como um biomarcador potencial e alvo terapêutico para o cancro colo-rectal, expressão HV1 em 139 tecidos de cancro colorectal e tecidos normais emparelhadas, 10 colorrectal normal, 20 adenoma colorrectal e 18 tecidos de pólipos hiperplásicas, foi detectada usando imuno-histoquímica com um anticorpo anti-HV1 anticorpo policlonal que foi gerado em casa. Para examinar a especificidade do anticorpo, 293 células T foram transfectadas com EGFP-PHV1 plasmídeo de expressão. E a expressão de HV1-EGFP foi detectada por imunocitoquímica e Western blotting com o anticorpo, e a fluorescência EGFP. Os resultados mostraram que o anticorpo reconhece especificamente HV1 e EGFP é um marcador para a expressão HV1 (Fig. 1A e B).

, 293 células T foram transfectadas com o plasmídeo PHV1-EGFP e observadas por uma Leica TCS SP5 microscopia focal. a, observação por EGFP fluorescência. HV1-EGFP fluorescência é representado em verde. b, anti-HV1 imunofluorescência (TRITC comprimentos de onda) (vermelho). c, mancha DAPI para visualizar os núcleos (azul). d, imagem fundida é composta de fluorescência EGFP, anti-HV1 imunofluorescência, e mancha DAPI. B, 293 células T foram transfectadas com o vector pcDNA3.1 e do plasmídeo pcDNA-HV1, respectivamente. E HV1 foi detectada por transferência Western. C, HV1 é expresso em tecidos de cancro colo-rectal. A (100 ×) e b (500 ×), C (100 ×) e d (500 ×), tecidos colorrectais normais; E (100 ×) e F (500 ×), tecidos de adenoma; g (100 ×) e H (500 ×), I (100 ×) e J (500 ×), K (100 ×) e L (500 ×), tecidos de cancro colo-rectal. Em tecidos colorretais normais, pólipos hiperplásicos e tecidos de adenoma colorretal, a coloração foi negativa ou fracamente positiva. Em tecidos tumorais, foi observada intensa imunorreactividade para HV1. HV1 é observado principalmente na membrana de plasma (h, j, l) (tal como indicado por setas). O HV1 é corado em castanho, enquanto os núcleos estão em fundo azul.

Como se mostra na Fig. 1C e Tabela 2, HV1 coloração era principalmente moderada ou fortemente positiva em tecidos de cancro colorectal, mas não em colorrectal normal e tecidos de pólipos hiperplásicos. HV1 foi observada principalmente na membrana plasmática das células tumorais em tecidos colo-rectais, como mostrado na Fig. 1C (h, j, l) (tal como indicado por setas). Em tecidos de adenoma colorretal, a coloração foi negativa ou fracamente positiva (Fig 1C, E e F;. Tabela 2). HV1 em tecidos de cancro colorectal foi significativamente expressa em comparação com o que em colorrectal normal, pólipos hiperplásicos e tecidos de adenoma, sugerindo que HV1 pode estar envolvido na tumorigénese colorectal. No geral, 106 dos 139 (76,3%) casos apresentaram HV1 alta expressão nos tecidos tumorais (IRS superior a 3), enquanto 33 (23,7%) dos casos apresentaram baixa expressão (IRS 0-3). Geralmente, HV1 densidade foi significativamente maior nos tecidos de cancro do que em tecidos de adenoma (7,20 ± 3,25 contra 2,20 ± 2,12) (Tabela 2).

expressão alta HV1 está associada a um mau prognóstico

as correlações entre HV1 expressão e clínico-patológicas características estão resumidas na Tabela 3. Houve associações significativas com a profundidade de classificação de tumor (

P

= 0,007), idade (

P

= 0,021) , o tamanho do tumor (

P

= 0,000), o estado do linfonodo (

P

= 0,000), estadiamento clínico (

P

= 0,000) e p53 status (

P

= 0,014) nos pacientes que tiveram alta expressão HV1 em comparação com pacientes que tiveram baixa expressão HV1. Não houve associação significativa entre a expressão HV1 e as outras características clínicas, tais como sexo, diferenciação e Ki-67. Além disso, as correlações entre os níveis de p53 expressão, Ki-67, TopoII, GST-π e P-gp e as características clínico-patológicas foram apresentados na Tabela 4. p53 estatuto relacionada com a classificação do tumor (

P = 0,011

), Ki-67 a diferenciação (

P

= 0,010), TopoII à diferenciação (

P

= 0,010), e GST-π ao tamanho do tumor (

P

= 0,007) e diferenciação (

P

= 0,000). No entanto, P-gp não apresentaram significância estatística com os parâmetros clínico-patológicas.

curvas de sobrevida de Kaplan-Meier mostrou que os pacientes que tiveram alta expressão HV1 eram mais propensos a ter uma sobrevida global mais curto (

P

= 0,008, Fig. 2A) e sobrevida livre de recidiva (

P

= 0,008, Fig. 2B) em comparação com pacientes que tiveram baixa expressão HV1, sugerindo que HV1 sobre-expressão pode ser associada a um prognóstico clínico pobre. Os pacientes que tiveram alta expressão HV1 tiveram uma sobrevida livre de recidiva pobre (

P

= 0,008) em comparação com pacientes que tiveram baixa expressão HV1 (análise univariada) (Tabela 5). A sobrevida global examinado por análise univariada de Cox também indicou que alta expressão de HV1 foi significativamente associada com menor sobrevida (

P

= 0,008). Análises de regressão univariada de Cox mostrou que o nível de expressão HV1 foi significativamente associada com livre de recorrência e sobrevida global, enquanto outras características clínicas perderam a significância preditiva. Além disso, a regressão de Cox multivariada revelou que a alta expressão de HV1 foi fator de risco independente para a sobrevida global (risco relativo [RR] = 0,443,

P

= 0,015) e sobrevida livre de recidiva (RR = 0,427,

P

= 0,026) (Tabela 6). Os pacientes que tiveram alta expressão de HV1 eram propensos a ter uma recidiva precoce em comparação com pacientes que tiveram baixa expressão de HV1 (37,4 ± 3,0 vs 47,2 ± 10,7,

P Art 0,008). (Tabela 5)

os pacientes com baixa expressão tem mais global ea sobrevida livre de doença do que os pacientes com alta expressão.

Distribuição de HV1 em linhas celulares colorectais humanos

Para examinar se HV1 também é expresso em linhas celulares de cancro colo-rectais humanos, a expressão de HV1 em linhas celulares de cancro colorrectal humano, SW620, HT29, LS174T, Colo205 e SW480, foi detectada por imunocitoquímica e em tempo real de RT-PCR. Como mostrado na Fig. 3, os níveis de expressão de HV1 entre estas linhas celulares de cancro colorrectal têm diferença significativa. HV1 é expresso a um nível elevado em SW620, HT29, LS174T, e células Colo205, mas não em células SW480. A localização de HV1 em células SW620 foi determinada através de um microscópio confocal. Como mostrado na Fig. 3C, HV1 é altamente expresso em células SW620, que é localizada em ambos os locais intracelulares e de membrana de plasma (como indicado por setas), enquanto que HV1 é pouco expresso em células SW480. O resultado que a expressão de HV1 é mais elevada em células SW620 do que em células SW480 é idêntico com os resultados de imunocitoquímica (Fig. 3A) e em tempo real de RT-PCR (Fig. 3B).

A, HT29 (um , 200 ×), LS174T (b, 200 ×), Colo205 (C, 200 ×), SW480 (d, 200 ×), SW620 (e, 200 ×) e SW620 (f, 500 ×) detectado por imunocitoquímica. B, os níveis de expressão de ARNm de HV1 em SW620, HT29, LS174T, Colo205 e células SW480 estimativa quantitativa por PCR em tempo real. Os valores são médias ± DP (

N

= 3). *

P Art 0,05, em comparação com células SW620. C, SW620 (a, b e c) e SW480 (d, e, f) células crescidas em lamelas de vidro em confluência numa placa de seis bem-cultura de tecido foram coradas com anticorpo anti-HV1 e observado por um microscópio SP5 confocal Leica TCS . a e d, anti-HV1 imunofluorescência (FITC, verde). b e e, mancha DAPI para visualizar os núcleos (azul). C & F, as imagens fundidas são compostas de HV1-anti imunofluorescência e mancha DAPI. HV1 é observado na membrana plasmática e locais intracelulares nas células SW620 altamente metastáticas (tal como indicado por setas), mas não nas células metastáticas SW480 mal. D, expressão de HV1 em HT29, células SW620 e SW480, foi detectada por transferência Western. Down-regulação da expressão HV1 foi realizada por siRNA segmentação HV1 (HT29-si, SW620-si e SW480-si).

A inibição da actividade HV1 diminui invasão e migração em células de câncer colorretal altamente metastáticas

Invasion e migração são dois marcos importantes da malignidade do tumor. Para avaliar a contribuição de HV1 ao potencial invasivo e migratório em células de câncer colorretal, realizamos ensaios de invasão e migração. Primeiro, examinamos a cinética da capacidade migratória de SW620, SW480 e células HT29. FIG. 4A, B e C mostraram a cinética da migração de SW620 (Fig. 4A), SW480 (Fig. 4B) e HT29 (Fig. 4C) células. Uma monocamada de células SW620 ferido permitido para o encerramento de feridas após 48 h (Fig. 4A, a, b, c, d, e). SW620 e HT29 (Fig. 4C, a, b, c, d, e) células fechada a ferida drasticamente mais rápido do que as células SW480 (Fig. 4B, a, b, c, d e e). De modo a infra-regulação da expressão HV1 e inibição da actividade HV1, HV1 o siRNA alvejando e uma concentração final de 100 uM de ZnCl

2 [1], foram utilizados, respectivamente [2]. As eficiências de HV1 knock-down com ARNsi em SW620, SW480 e células HT29 foram avaliadas por transferência de Western, que mostram a redução nos níveis de proteína HV1 sobre siRNA knockdown em SW620 e células HT29 (Fig. 3D). Supressões de expressão HV1 por siARN (f, g, h, i e j na Fig. 4A, B e C) e a actividade HV1 por 100 uM de ZnCl

2 (k, l, m, n e o, na Fig. 4A Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig.