Abstract

inibidores de pequenas moléculas contra a proteína geranilgeranil–I, como P61A6 foram mostrados para inibir a proliferação de uma variedade de células de cancro humanas e exibem actividade anti-tumoral em modelos de ratos. O desenvolvimento destes inibidores pode ser acelerado de forma dramática pela conferir direccionamento de tumor e capacidade de liberação controlada. Como um primeiro passo para atingir esse objectivo, temos encapsulado P61A6 em um novo tipo de lipossomas que se abrem e liberam cargas somente sob baixas condições de pH. Estes lipossomas de baixo pH do tipo de libertação foram preparadas ajustando a proporção dos dois tipos de derivados de fosfolípidos. Carregando de geranilgeranil-I-inibidor (GGTI) gerado lipossomas com diâmetro médio de 50-100 nm. libertação GGTI em solução era nitidamente dependente de valores de pH, única que mostra a libertação a pH inferior a 6. de lançamento de cargas de uma forma dependente do pH dentro da célula foi demonstrada pelo uso de um inibidor da bomba de protões bafilomicina A1 que o aumento do pH lisossomal e inibida a libertação de um corante transportado no pH-lipossoma. Entrega de GGTI de células de cancro do pâncreas humanos foi demonstrada pela inibição da geranilgeranilação da proteína dentro da célula e este efeito foi bloqueado pela bafilomicina A1. Além disso, GGTI entregue por Ph-lipossomas induziu a inibição da proliferação, paragem do ciclo celular G1, que está associado com a expressão do ciclo celular regulador de p21

CIP1 /WAF1. inibição da proliferação foi também observada com as várias linhas celulares de cancro de pulmão. Disponibilidade de GGTI nanoformulated abre-se a possibilidade de combinar com outros tipos de inibidores. Para demonstrar este ponto, nós combinamos a lipossomal-GGTI com inibidor de farnesiltransferase (FTI) para inibir K-Ras sinalização em células de câncer de pâncreas. Os nossos resultados mostram que a sinalização activado K-Ras nestas células pode ser eficazmente inibida e o efeito sinérgico dos dois fármacos é observado. Nossos resultados sugerem uma nova direção no uso de GGTI para a terapia do cancro

Citation:. Lu J, K Yoshimura, Goto K, Lee C, Hamura K, Kwon O, et al. (2015) Nanoformulation de geranilgeranil-I-Inibidores de Terapia Cancer: A encapsulação lipossomal e Entrega pH-dependente de células cancerosas. PLoS ONE 10 (9): e0137595. doi: 10.1371 /journal.pone.0137595

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, United States |

Recebido: 23 Abril 2015; Aceito: 18 de agosto de 2015; Publicação: 09 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder CA41996 (a FT) e R01GM071779 e P41GM081282 (a OK), https://grants.nih.gov/grants/giwelcome.htm. Uma parte do trabalho realizado neste trabalho foi apoiado por um acordo de pesquisa patrocinado com NOF, Inc (a FT). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. NOF Corporação forneceu apoio sob a forma de salários para os autores [Kohei Yoshimura e Ken Hamura ]. A sua contribuição para o estudo é definido na seção contribuição Autor. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A classe de medicamentos anticancerígenos destinado a inibir associação de membrana de proteínas sinalizadoras foram desenvolvidos ao longo dos anos . GGTI (geranilgeranil-I-inibidor) exemplifica este tipo de medicamentos anticancerígenos [1-3]. GGTI inibe a geranilgeranil-proteína I (GGTase-I), uma enzima que adiciona um grupo de geranilgeranilo C20 para proteínas tais como RhoA, RhoC, Rap1 e Ral na cisteína dentro da sequência de tetrapéptido de consenso do terminal carboxi CAAL (C é cisteína, A é um aminoácido alifático, e o resíduo C-terminal é a leucina ou a fenilalanina). Caracterização dos ratos nocaute com condicional da GGTase-I mostrou que os GGTase-I deficiência resulta na inibição da formação de tumores do pulmão induzida por K-ras oncogénico e aumenta drasticamente a sobrevivência de ratinhos [4]. GGTase-I inibição resulta em inibição da proliferação associada com paragem em G1 e a acumulação de reguladores do ciclo celular tais como p21

CIP1 /WAF1, indicando a importância da GGTase-I na proliferação celular e na progressão do ciclo celular [5-7].

por rastreio de uma biblioteca de compostos químicos construídos por catálise fosfina de allenoate compostos, que previamente identificados vários GGTase-I compostos inibidores (GGTI) que bloqueiam a modificação de proteínas e inibem a associação de membrana e função de Ral, Rho, e Rap da subfamília proteínas [8,9]. Estes compostos inibem a GGTase-I, competindo com as suas proteínas de substrato. Celular compostos activos P61A6 e P61E7 causada paragem do ciclo celular e suprimiu o crescimento de linhas celulares de cancro humano, incluindo cancro do pâncreas e cancro do pulmão de células não pequenas [10,11]. Eficácia de GGTI P61A6 para inibir o crescimento do tumor foi demonstrada por meio de xenoenxerto de cancro pancreático humano [10]. Nesta experiência, foi observada a inibição significativa do crescimento do tumor com poucos efeitos colaterais como julgado pelos perfis de rim e de enzimas hepáticas e pela caracterização hematológica. A inibição da geranilgeranilação no tumor foi demonstrada. Uma inibição do crescimento do tumor semelhante foi observada com o uso de xenoenxertos de cancro do pulmão em ratos [11].

Um grande desafio para o desenvolvimento GGTI é o de conferir capacidade de direccionamento do tumor para estes compostos. Embora seja possível utilizar quantidades reduzidas de GGTI para minimizar os efeitos secundários potenciais, a possibilidade de que haja toxicidade limitante da dose do presente composto GGTI não pode ser descontado, desde GGTase-I é uma enzima que funciona também em células normais. Assim, é importante desenvolver uma nova geração de GGTI formulados-nano que preferencialmente fornece composto GGTI para tumores. Isto permitiria a segmentação do tumor, diminuir a distribuição indesejável para outras partes do corpo, evitando assim quaisquer efeitos potenciais sobre os tecidos normais.

Um avanço em nanotecnologia dramática conduziu ao desenvolvimento de um número de sistemas de entrega de droga, incluindo lipossomas , micelas de polímero, vírus e nanopartículas de sílica mesoporosa [12-25]. Estas nanopartículas podem entregar a droga ao tumor por permeabilidade aumentada e retenção efeito [13], bem como pela utilização de ligandos que têm como alvo receptores em células cancerosas, evitando, assim, quimiotoxicidade sistémica indesejável. Entre eles, os lipossomas têm características vantajosas que incluem encapsulamento eficiente, relativamente fácil preparação, biodegradabilidade e biocompatibilidade [26-31]. Além disso, a estrutura de bicamada fosfolipídica de lipossomas é adequada para a criação de funções relacionadas com a bio tal como a desestabilização da membrana e /ou a fusão da membrana, promovendo a internalização celular de moléculas da membrana impermeável através das membranas celulares para as células.

Além à segmentação do tumor, é importante para conseguir uma libertação controlada de modo a que as drogas anti-cancro será libertado preferencialmente no tumor. Recentemente, aproxima-se de sintetizar um novo tipo de lipossomas com característica de liberação de baixo pH foram relatados [32,33]. Porque intracelular pH lisossomal é baixa e também porque microambiente do tumor tem pH baixo, devido a condições de hipoxia [34-36], esta característica proporciona uma vantagem que a liberação do fármaco é mais restrito às células cancerosas.

Neste trabalho, relatamos preparação de lipossomas que eficientemente encapsulam fármacos de moléculas pequenas e corantes e liberam a carga quando se deparam com condições de pH baixo. GGTI P61A6 foi eficientemente encapsulado em lipossomas sensíveis ao pH e foi entregue a células de cancro humano. A inibição da geranilgeranilação de proteínas, bem como inibição da proliferação, os efeitos do ciclo celular e a acumulação de p21 inibidor do ciclo celular

CIP1 /WAF1 foram observadas através da entrega de GGTI por os lipossomas sensíveis ao pH. Nós alargar ainda mais o uso de lipossomas para a terapia do cancro GGTI demonstrando que lipossomal-GGTI pode ser combinado com um inibidor da farnesil-transferase (FTI) para inibir a sinalização de K-ras em células de cancro pancreático.

Materiais e Métodos

Materiais

Um composto GGTI P61A6 utilizado para este estudo foi obtido a partir da biblioteca de compostos derivados de allenoate como descrito nas nossas publicações anteriores [9-11]. solução de estoque 20 mM de GGTI P61A6 em DMSO foi mantida a -20 ° C até à sua utilização. FTI composto BMS225975 foi descrito anteriormente [37]. Este composto inibe especificamente a proteína farnesil-transferase com pouca inibição da geranilgeranil-proteína I e RabGGTase. COATSOME

® MC-6081 (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfocolina (POPC)), Sunbright

® DSPE-PG8MG (produto de condensação de N- (octaglycerol-glutaril) com 3- diestearoilfosfatidiletanolamina ácido metilglutárico (DSPE-PG8MG)), foram fornecidos pela NOF CORPORATION (Tóquio, Japão). 1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- (lissamina rodamina B sulfonil) (sal de amónio) (rodamina-PE) foi adquirida a partir de Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, EUA).

projeto e preparação de baixa pH-sensíveis lipossomas

lipossomas vazios sensíveis ao pH foram preparados a partir de POPC e DSPE-PG8MG. Os procedimentos típicos são descritos abaixo. POPC e DSPE-PG8MG (razão molar; 85:15) foram dissolvidos numa mistura de clorofórmio-metanol, e o solvente foi removido num evaporador rotativo. A mistura de lípidos foi seca sob vácuo, e hidratada com uma solução aquosa (10 mL) contendo sacarose como crioprotector. Após a extrusão da suspensão de lipossomas através de membrana (tamanho de poro de 0,22), a suspensão obtida foi seca por congelação para dar os lipossomas sensíveis ao pH vazios [38].

fluorescência rodamina-rotulagem de lipossomas

lipossomas vazios sensíveis ao pH Rodamina-marcadas foram preparadas a partir de POPC, DSPE-PG8MG, e rodamina-PE (razão molar 85: 15: 0,1). POPC e DSPE-PG8MG foram dissolvidos numa mistura de clorofórmio-metanol. Rodamina-PE foi dissolvido em clorofórmio e adicionado à solução de lípidos, e o solvente foi removido num evaporador rotativo. A mistura de lípidos foi seca sob vácuo, hidratado com uma solução tampão de fosfato contendo sacarose. Após a extrusão da suspensão de lipossomas através de membrana (tamanho de poro de 0,22), a suspensão obtida foi seca por congelação para dar os lipossomas sensíveis ao pH vazios marcados com corantes fluorescentes.

pó lipossoma-Rodamina marcado foi reconstituída em PBS tampão a 10 ug /ml, sonicado, em sonicador (tipo banho-maria) durante 10 min, e adicionou-se células de MiaPaCa-2 que foram cultivadas na câmara de célula de vidro de 8 poços durante 4 horas. As células foram então lavadas com tampão PBS e incubadas com 50 nM de Lyso Tracker verde, seguido por incubação na câmara de cultura de células durante mais 1 hora antes da observação com microscópio de fluorescência.

carregadas com fármaco em lipossomas Preparação

Uma pequena aliquota (130 uL) de GGTI dissolvido (1,2 mg) em EtOH a 75% com 10% de DMSO (concentração final = 6,41 mg /ml), diluída em dH

2O a 10%, foi misturada com 1,3 mg de pó seco de lipossomas, e a mistura foi rodada a 4 ° C durante 4 horas, seguido de sonicação durante 2 minutos usando um banho de água sonicador do tipo. A suspensão de lipossomas foi extrudida através de uma membrana de policarbonato com um tamanho de poro de 100 nm. Ao mesmo tempo, 6 ml de gel de Sepharose 4B foi misturado com 2 ml de PBS em gelo e foi aplicado a 10 ml de coluna, embalada com a velocidade de 15 cm /h. E, em seguida, a mistura de lipossoma e GGTI foi carregado no topo do gel na coluna. Depois de deixar a amostra para introduzir a resina, a coluna foi imediatamente cheia com tampão PBS frio, e de bombeamento foi iniciado com uma velocidade de 15 cm /h, para remover fármacos livres que não foram carregados em lipossomas a partir dos lipossomas carregados com drogas [32] . Os eluentes foram recolhidas e as fracções contendo os lipossomas foram identificados pela sua turbidez. A amostra foi mantida a 4 ° C para outras experiências.

Droga e tintura de lançamento a partir de lipossomas

A libertação de fármacos a partir de lipossomas foi medida por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). 400 ul de Lipossomas que encapsulam GGTI (recolhidos a partir da coluna de Sepharose) foi misturada com NaCl 150 mM, centrifugado a 100.000 rpm durante 10 min, 4C, para precipitar GGTIs lipossomal. O precipitado foi ressuspenso em 400 ul de PBS. 73 ul de solução ressuspensa foi adicionado a 927 ul de tampão PBS com valores de pH diferentes, e, em seguida, misturados a 37 ° C durante 15 min. Triton X-100 foi utilizado como um controlo de 100%, porque o Triton X-100 pode quebrar os lipossomas (a concentração final: 0,1%). As misturas foram adicionadas aos tubos interiores do ultrafiltro Amicon Ultra-4 (MWCO = 10 kDa, Millipore), centrifugada a 13000 g durante 10 min à temperatura ambiente. Os eluatos foram sujeitas a HPLC para medir a concentração de GGTI libertado (Waters Micromass LCT Premier Espectrómetro de Massa). A libertação de corante fluorescente de piranina foi realizada como descrito anteriormente [32]. Uma pequena aliquota (500 uL) de piranina 35 mM, DPX 50 mM (brometo de p-xileno-bis-piridinio), e 25 mM solução tampão fosfato (pH 7,4) foram misturados com 7 mg de lipossomas, e a mistura foi sonicada durante 2 min, utilizando um sonicador de banho de água. fluorescência piranina é extinta por DPX dentro de lipossomas, mas irá emitir fluorescência intensa após ser liberado do lipossoma. Lipossomas que encapsulam piranina e DPX foram adicionados a 25 mM e fosfato de tampão 125 mM de NaCl com diferentes valores de pH e a intensidade de fluorescência (512 nm) foi medida com um espectrofluorómetro (416 nm, Jasco FP-6500). A libertação por cento dos piranina de lipossomas foi definida como Release (%) = (Ft-Fi) /(ff-Fi) × 100 em Fi e Ft dizer as intensidades iniciais e intermediários de fluorescência, respectivamente. Ff é a intensidade de fluorescência após a adição de Triton X-100 (concentração final: 0,1%).

Cultura celular

A linha de células de cancro da mama humano, MCF-7, linha celular de cancro pancreático MiaPaCa2, linha celular de cancro do pulmão de não pequenas células H596, H358, A549 e uma linha de células normais epitélio bronquial humano BEAS-2B foram obtidos a partir da American Type Culture Collection. Todas as linhas celulares de cancro foram mantidas em DMEM ou RPMI suplementado com 10% FCS (Sigma), 2% de L-glutamina, 1% de penicilina e 1% de estreptomicina. células BEAS-2B foram cultivadas com meios BEBM adicionado com fatores de crescimento especiais (Lonza /Clonetics Co.). O meio foi rotineiramente trocados a cada 3 dias, e as células foram separadas por tripsinização antes de atingir a confluência.

Entrega de Corantes às células cancerosas

entrega

Doxorrubicina foi examinada como se segue. Depois de centrifugação através de uma coluna de Sepharose 4B para remover fármacos livres, uma suspensão homogénea de os lipossomas carregados com doxorrubicina foi adicionado ao cancro da mama MCF-7 As células que foram cultivadas numa câmara de vidro de 8 bem. 6 horas após a incubação, as células foram lavadas e examinadas com microscopia de fluorescência para a imagem da distribuição da doxorrubicina em células de cancro. Os lipossomas carregados com piranina foram preparados como descrito acima. células MiaPaCa-2 (3 × 10

5 células) foram cultivadas durante a noite numa câmara de cultura de células 8 poços de vidro. As suspensões de lipossomas foram adicionados às células e incubou-se durante 4 h a 37 ° C. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS duas vezes e observadas com um microscópio de fluorescência (Cari Zeiss). bafilomicina tratamento foi realizado com 160 nM bafilomicina A1 durante 6 horas anteriores à adição de lipossomas. Acridina laranja (Sigma) a coloração foi levada a cabo a uma concentração de 6 uM.

Ensaio de Inibição da Proliferação

ensaio de inibição de proliferação foi realizada utilizando um kit de contagem de células-de Dojindo Molecular Technologies Inc., Câncer Cells foram semeadas em placas de 96 poços (5000 células bem

-1) e incubou-se em meio de cultura fresco a 37 ° C em 5% de CO

2/95% de ar durante 24 h. As células foram então lavadas com PBS e o meio foi mudado para um meio fresco contendo lipossomas carregados com GGTI ou com lipossomas vazios mesmo volume em tampão como controlo, nas concentrações indicadas. Após 24 h, as células foram lavadas com PBS para remover os lipossomas que não foram absorvidas pelas células, e as células foram depois incubadas em meio fresco durante mais 48 h. As células foram lavadas com PBS e incubadas em DMEM com 10% de WST-8 solução durante mais 2 h. A absorvância de cada poço foi medido a 450 nm com um leitor de placas. Uma vez que a absorvância é proporcional ao número de células viáveis ​​no meio, o número de células viáveis ​​foi determinada utilizando uma curva de calibração previamente preparada (Dojindo Co.).

Análise Western Blot

Células foram tratados com GGTI-lipossomas, lipossomas vazios, ou GGTI durante 24 horas, colhidas e lisadas em tampão de lise (1% Triton X-100, NaCl 150 mM, Tris-HCl a 20 a pH 7,5, EDTA 1 mM, e 1 mistura de inibidor de protease ×). As proteínas foram separadas por electroforese em gel num gel de poliacrilamida com SDS e, em seguida, transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 5% (w /v) de leite desnatado. Após a lavagem com TBS contendo 0,1% de Tween 20 (Sigma), as membranas foram incubadas durante a noite com o primeiro anticorpo (contra a forma de unprenylated rapi, Santa Cruz Biotechnology, CA) diluído com TBS. Após a lavagem, as membranas foram incubadas durante 2 h com o segundo anticorpo (Santa Cruz Biotechnology, CA). As bandas foram detectadas com um sistema ECL (Amersham Pharmacia Biotech K.K., Reino Unido). A fosforilação de ERK foi testada utilizando um anticorpo contra phorphorylated forma de ERK, bem como contra ERK total (Cell Signaling, CA). O anticorpo anti-actina foi adquirido de Sigma-Aldrich (CA).

A análise estatística

Todos os resultados são expressos como médias ± DP. As comparações estatísticas foram feitas utilizando o teste t de Student, após a análise de variância. Os resultados foram considerados significativamente diferentes no valor de P 0,05, marcados com *.

Resultados

desenho e preparação de lipossomas sensíveis ao pH baixo (pH-lipossomas)

Nossos pH-lipossomas são estáveis ​​a pH fisiológico, mas tornar-se desestabilizado em condições ácidas devido à protonação, por conseguinte, responder a ambientes de pH baixo do endossoma-lisossomas no interior das células [32]. Os lipossomas foram preparados usando dois diferentes lípidos, DSPE-PG8MG e POPC. Um esquema geral de DSPE-PG8MG é mostrado na Figura 1. Esta molécula contém um fosfolípido que está ligada à porção de poliglicerina carboxilado (cadeia PG). Sob condições ácidas, a cadeia de PG é protonado resultando na desestabilização de membranas de lipossomas, causando a fusão com membranas endossómicas. O conteúdo dos lipossomas irá então ser libertado para o citosol. Ao alterar o rácio de um dos dois lipidos, é possível conceber os lipossomas que respondem a diferentes valores de pH. Aqui, a poliglicerina modificada com ácido glutárico 3-metilo é conhecido por ter um valor de pKa de 6,3 [39,40]. Portanto, DSPE-PG8MG tem um valor de pKa semelhante do derivado de poliglicerina, e terá um pH próximo de pH-responsividade 6. No nosso caso, nós quisemos alcançar a libertação do conteúdo a um pH abaixo de 6, mas pouco libertação acima de pH 6. Assim, decidiu-se encontrar uma composição lipídica adequada no processo semelhante. Resumidamente, as dispersões de lipossomas de pH que encapsulados piranina corante foram adicionados a soluções a vários valores de pH. E o pH-responsividade dos lipossomas foi avaliada através da medição da quantidade de piranina libertado a partir deles. Depois de testar diferentes proporções, decidimos usar a POPC e relação de DSPE-PG8MG de 85 e 15 (mol%).

intracelular Localização de pH-lipossomas

Para investigar a captação celular e localização intracelular de ph-lipossomas, sintetizamos lipossomas vazios sensíveis ao pH Rodamina-marcados (Rhodamina foi conjugado covalentemente com os lípidos durante a síntese), tal como descrito nos Materiais e Métodos. células de cancro do pâncreas MiaPaCa-2 foram incubadas com lipossomas de rodamina-marcadas durante 4 horas, e a fluorescência lipossomal foi examinada com um microscópio de fluorescência. Como mostrado na Fig 2A, fluorescência punctata foi observada a uma região perinuclear indicativa da localização lisossomal. Este ponto foi confirmada pela utilização de Lysosensor verde NI-189 (Life Technologies). Lysosensor Verde DND-189 apresenta fluorescência verde somente quando no interior dos compartimentos ácidos intracelulares, tais como lisossomos. foi observada co-localização de fluorescência rodamina vermelho e verde fluorescência Lysosensor, confirmando localização lisossomal dos lipossomas. Assim, os lipossomas parece acumular nos lisossomas quando absorvidos pelas células.

lipossomas carregados com GGTI foram preparados e em seguida exposta a uma solução ajustada para diferentes valores de pH durante 15 minutos e a libertação de GGTI foi analisado por HPLC. Triton X-100 foi utilizado como um controlo de libertação total. O símbolo * indica diferença estatisticamente significativa no valor de P 0,05.

Droga carregar e Release

eficiência de carregamento de lipossomas de fármacos e corantes foi testada misturando com lipossomas, utilizando coluna de Sepharose 4B para remover medicamentos gratuitos e soltar o conteúdo de lipossomas por Triton X-100. GGTI concentração foi medida por comparação com uma amostra padrão GGTI utilizando LC-MS. Estimou-se que a capacidade de carga de GGTI em lipossomas é cerca de 30% do total de GGTI. Para examinar o tamanho dos lipossomas reconstituídos, nós submetido lipossomas carregados com GGTI para medição dinâmica de espalhamento de luz (DLS). Como pode ser visto na Fig 2B, verificou-se que o tamanho dos lipossomas carregados com GGTI variou 46-65 nm de diâmetro, com tamanho médio de 54,9 nm. Assim, nossa preparação tem uma distribuição de tamanho relativamente estreita.

Lançamento do GGTI de lipossomas foi examinado por carregar GGTI, coleta de lipossomas carregados com GGTI e liberar o conteúdo expondo-o à tampão PBS com vários valores de pH variando de 4,5 a 8. Como mostrado na figura 2C, os lipossomas retido firmemente no interior GGTI tampões neutros ou básicos. Pouco libertação de GGTI foi observado numa gama de pH 6-8. No entanto, quando o pH era inferior a 6, foi observada uma libertação significativa de GGTI a partir de lipossomas. A pH 5,5, mais de 80% de GGTI carregada foi libertado. Da mesma forma, quase libertação completa foi observada a um pH 5 e a pH 4,5 (não mostrado). Estes resultados sugerem que os lipossomas sensíveis ao pH foram eficientemente desestabilizado em condições ácidas. Uma transição nítida entre pH 5.5 e pH 6 sugere que este tipo de lipossoma fornece um veículo adequado para a liberação controlada intracelular.

Baixa Entrega de Loaded Dye Dentro dependente do pH do celular

A doxorrubicina loaded os lipossomas foram utilizados para examinar a capacidade de libertação do fármaco intracelular, uma vez que a doxorrubicina emite forte fluorescência vermelha sob excitação UV. Após eluição de uma coluna de Sepharose 4B para remover fármacos livres, uma suspensão homogénea de os lipossomas carregados com doxorrubicina foi adicionado ao cancro da mama MCF-7 As células que foram cultivadas numa câmara de vidro de oito poços. 6 horas após a incubação, as células foram lavadas e examinadas com microscopia de fluorescência para a imagem da distribuição da doxorrubicina em células de cancro. As células tratadas com doxorrubicina mostraram forte fluorescência vermelha (Fig 3A), no citossol e no núcleo. Esta foi semelhante ao observado com as células tratadas com doxorrubicina livre (dados não mostrados). Por outro lado, as células de controlo tratadas com lipossomas sem doxorrubicina permaneceu não-fluorescente

A:. As imagens de microscopia fluorescente de células MCF7 foram incubadas com lipossomas de doxorrubicina-carregadas durante 6 horas (fluorescência vermelha). As células de controlo não recebeu lipossomas. B: Libertação de piranina corante em células MiaPaCa-2 é examinada por sua fluorescência com ou sem o tratamento com bafilomicina A1. imagem de contraste de fase é mostrada. C:. Efeitos da bafilomicina A1 no pH de organelas intracelulares são mostrados usando Acridina Laranja

As experiências anteriores mostram que os lipossomas podem ser carregados com corantes e drogas e com sucesso e efetivamente entregar o conteúdo de células cancerosas. Quisemos caracterizar ainda mais a característica de libertação dependente do pH baixo dos lipossomas no interior da célula. Para investigar este ponto, usamos piranina corante lipossomas carregados e células tratadas com bafilomicina, uma droga que altera o pH do lisossoma. Bafilomicina A1 (Baf) é um inibidor específico da bomba de protões vacuolar intracelular, inibindo a acidificação do sistema vacuolares, tais como endo /lisossomas, assim, aumentar o pH lisossómico [41,42]. células de cancro do pâncreas MiaPaCa-2 foram tratadas com 160 nM Baf durante 6 horas e, em seguida, piranina lipossomas carregados com corante foram adicionados às células. As células foram incubadas durante um período adicional de 12 horas antes do exame por microscopia de fluorescência. Como mostrado na Fig 3B, o tratamento com Baf impediu completamente libertação intracelular de piranina, demonstrado pela ausência de coloração, em comparação com a fluorescência verde brilhante das células não expostas ao Baf. Para confirmar o efeito de Baf na desacidificação de endossomas, foi realizada laranja de acridina (AO) coloração. AO é uma base fraca fluorescente que é frequentemente utilizado como uma sonda para o controlo da acidificação de organelos. Em ambientes neutros ou alcalinos este corante emite fluorescência verde, mas quando expostas aos compartimentos acídicos, é ionizado e a sua emissão é submetido a um desvio para o vermelho. Nas células não tratadas, foi observada fluorescência vermelha dentro de organelos citoplasmáticos discretas, indicando que o AO tinha acumulado nos organelos acidicos (Fig 3C). No entanto, a fluorescência vermelha diminuiu dramaticamente após 6 horas de tratamento Baf, indicando que o Baf tinha aumentado o pH dos endossomas das células MiaPaCa-2. Estes resultados sugerem que a libertação de corante dos lipossomas é dependente das condições de pH baixo em organelas intracelulares.

lipossomal GGTI Inibe geranilgeranilação proteína dentro da célula e este efeito é dependente de pH baixo dos lisossomos

liberação GGTI e eficácia para inibir geranilgeranilação proteína dentro das células cancerosas foram investigados. Figura 4A mostra que a entrega de GGTI por os lipossomas resulta na inibição da geranilgeranilação da proteína dentro da célula. Nesta experiência, as células de MiaPaCa-2 foram tratados com lipossomas-GGTI durante 3 horas, e as proteínas foram recolhidos a partir de lisados ​​de células para análise de Western. Como se mostra, o tratamento das células, quer com P61 GGTI-A6 sozinho ou lipossoma carregado-GGTI levou ao aparecimento de banda Rap1 unprenylated, indicando que os lipossomas entregam e libertar composto GGTI no interior das células com a função e geranilgeranilação de proteínas inibida. Uma vez que o pH lipossomas exibem desestabilização significativa abaixo de pH 6, que corresponde ao pH da endolysosome interior, o pH lipossomas eram susceptíveis de ser desestabilizado ou fundidos com as membranas endossómicas, resultando na libertação da carga de droga em citosol, inibindo a GGTase-I e bloqueando Rap1 prenilação. Para analisar a sensibilidade ao pH de libertação GGTI, a mesma experiência foi repetida após tratamento das células com o composto que alteram o pH bafilomicina A1. Como mostrado na Fig 4A, o tratamento com bafilomicina A1 aboliu o efeito de lipossomal-GGTI em Rap1 prenilação. Isto está de acordo com a ideia de que o aumento do pH dos lisossomos alterados por bafilomicina A1 não poderia desestabilizar pH-lipossomas mais, portanto, GGTIs foram mantidos dentro de lipossomas. Portanto, quando absorvidos pelas células, a acidez de endossomas é crítico para a desestabilização e /ou de fusão dos lipossomas de pH com endolysosome para a libertação eficiente e transferência do conteúdo em citosol.

lipossomal GGTI Causas A inibição da proliferação de pâncreas e câncer de pulmão células

O efeito da entrega da droga a partir de pH lipossomas foi examinado com ensaio de proliferação celular. A linha de células de cancro do pâncreas MiaPaCa-2 foi tratada com lipossomas sem carga, lipossomas carregados com GGTI ou GGTI livre (mesmo volume em tampão) com várias concentrações durante 72 horas. Como mostrado na Fig 4B, uma inibição significativa da proliferação foi observada com lipossomas carregados-GGTI. Esta inibição foi semelhante ou melhor do que a observada com GGTI livre. Em contraste, os lipossomas vazios não afectou a proliferação celular, mesmo a 180 ug /mL. Os lipossomas si mesmos parecem ser não-tóxicos a estas concentrações.

Uma das principais características do GGTI é que eles induzem a paragem do ciclo celular na fase G1. Para analisar se esta aplica-se para a célula efeitos usando lipossomal GGTI, as células tratadas com lipossomal GGTI foram analisadas por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig 4C, o tratamento de células de MiaPaCa-2, quer com solução GGTI ou Lipo-GGTI durante 24 h causada enriquecimento de células em fase G1, enquanto que a percentagem de células em fase S foi reduzido por estes tratamentos. Percentagem de células G2 foi apenas ligeiramente alterada.

Temos anteriormente demonstrado que GGTI induz a expressão de um regulador do ciclo celular p21

CIP1 /WAF1 [7]. Indução desta dependentes de ciclina resultados inibidor de cinase na acumulação de células em fase G1. Nossos estudos anteriores mostraram que RhoA é um dos principais alvos da GGTI e que RhoA suprime p21

expressão CIP1 /WAF1. Para examinar se lipossomal-GGTI induz p21

expressão CIP1 /WAF1, que trataram células MiaPaCa-2 com lipossomal GGTI e realizada análise de Western. Como mostrado na Fig 4D, indução significativa de p21

CIP1 /WAF1 foi observada com o tratamento com lipossomas GGTI.

Nos nossos estudos anteriores, mostrou que GGTI P61A6 inibiu ambas as células de cancro do pâncreas e pulmão em animais modelos, por conseguinte, também testado GGTI lipossomal com diferentes linhas celulares de cancro do pulmão, H596, H358 e A549, assim como com o normal brônquica linha celular epitelial BEAS-2B. Como se mostra na figura 5, em comparação com lipossomas descarregadas, lipossoma-GGTI mostrou uma inibição significativa da proliferação de células com uma variedade de linhas celulares de cancro do pulmão de não-pequenas testados. Lipossomal GGTI suprimidas cerca de 60-80% da proliferação celular, enquanto que a mesma concentração de lipossomas vazios não o fez. Curiosamente, o brônquica linha de células de epitélio BEAS-2B humano normal mostraram resistência inesperadamente forte para lipossomal GGTI comparação com células de câncer de pulmão. O mecanismo para essa resistência continua a ser uma investigação mais aprofundada desconhecido e warrants.

Os números de células após os tratamentos 72 horas são apresentados como percentagem de células não tratadas. lipossomas vazios não afetam a proliferação. O símbolo * indica diferença estatisticamente significativa no valor de P 0,05.

lipossomais GGTI estabeleça sinergias com a FTI (inibidor de farnesiltransferase) para inibir a proliferação de K-Ras activado células cancerosas

Os resultados acima sugerem que lipossomal-GGTI é um novo tipo de anticancerígeno medicamentos que tem o potencial para ser entregue ao tumor. Isto abre a possibilidade de que ele pode ser usado para inibir a K-ras de sinalização que é activado num certo número de casos de cancro humanos, incluindo os cancros pancreáticos, do pulmão e do cólon. As proteínas da família ras, K-ras, especialmente, podem ser, alternativamente, preniladas por FTase ou GGTase quer-I [43-45].