Abstract

O crescimento do tumor após a radioterapia é uma causa comumente reconhecido de falha terapêutica. Desta forma, nós examinamos o crescimento de células tumorais após a radioterapia através do estabelecimento de um modelo de crescimento de células de câncer

in vitro

. Realizamos este modelo semeando luciferase2 não irradiados vaga-lume e gene de fusão proteína verde fluorescente (Fluc) marcado vivem células repórter câncer em uma camada alimentadora de células cancerígenas irradiadas. O crescimento de células tumorais viva foi monitorizada por imagem de bioluminescência. As células vivas repórter cresceram mais rapidamente quando semeados em células de alimentação irradiadas letalmente que quando semeados em células alimentadoras ou não irradiadas quando semeadas, na ausência de células alimentadoras. Verificou-se que os níveis das proteínas Shh e GLI1, ambas as quais são proteínas críticas em Sonic hedgehog (SHH) de sinalização de expressão, foram aumentadas após a irradiação e que esta expressão foi positivamente correlacionada com o crescimento de células repórteres. Além disso, a estimulação das células morrendo de crescimento de células tumorais viva foi reforçada com a adição de agonistas de sinalização de SHH e inibida pelos antagonistas de SHH de sinalização. agonistas SHH também aumentou o crescimento das células repórter na ausência de células alimentadoras irradiadas, sugerindo que este mecanismo desempenha um papel na estimulação do crescimento de células de alimentação. Tendo em conta estes resultados, podemos concluir que a ativação de sinalização SHH desempenha um papel importante durante o repovoamento do tumor após a radioterapia

Citation:. Ma J, Tian L, Cheng J, Chen Z, Xu B, Wang L, et al. (2013) o Sonic Hedgehog via de sinalização Suporta crescimento de células cancerígenas durante o cancro Radioterapia. PLoS ONE 8 (6): e65032. doi: 10.1371 /journal.pone.0065032

editor: Jingwu Xie, da Escola de Medicina da Universidade de Indiana, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de fevereiro de 2013; Aceito: 20 de abril de 2013; Publicação: 10 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da National Natural Science Foundation (81120108017, 81172030) e Programa Nacional de Pesquisa básica da China (2010CB529902) (a Q Huang e L Tian) e em parte por doações do Instituto Nacional dos Estados Unidos Câncer (CA131408, CA136748, CA155270 ) (para CY Li). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Em muitos tipos de câncer, o repovoamento do tumor após a radioterapia ocorre e representa um grande desafio para os clínicos. Neste processo, as poucas células tumorais que sobrevivem após a radioterapia será regredir e substituir as células tumorais perdidos. Repovoamento durante a radioterapia fraccionada é reconhecido como uma importante causa de fracasso do tratamento e as evidências sugerem que a taxa de repovoamento pode ocorrer a uma velocidade acelerada em alguns casos [1]. Repovoamento depende da activação de vias de sinalização que estimulam a proliferação de células tumorais e diversos agentes molecular-alvo têm sido desenvolvidos que inibem estas vias, tais como gefitinib, que tem como alvo o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) [2] sinalização. A fim de criar um modelo para o estudo de repopulação de células de tumor após a radioterapia, muitos outros têm tentado utilizar os chamados “células de alimentação” que foram tratadas com radiação para promover o crescimento de células tumorais não tratadas semeadas em experiências de co-cultura. Embora este modelo não mostra directamente o repovoamento das células cancerosas tratadas durante a radioterapia, acreditamos que os sinais promotores de crescimento libertados a partir de células alimentadoras letalmente tratados replicar as condições em um tumor tratado de forma homogénea. Portanto, vamos usar o conceito de repovoamento e de células morrendo estimulado vivendo crescimento de células tumorais como sinônimos em todo o nosso estudo.

Apesar de nosso conhecimento que morrer células alimentadoras podem aumentar o crescimento de células tumorais vivas, o mecanismo pelo qual isso ocorre permanece em grande parte desconhecido. A via de sonic hedgehog (SHH) de sinalização, identificado pela primeira vez em Drosophila melanogaster, está implicada no desenvolvimento de órgãos normal e homeostase, caule manutenção e proliferação de células em vertebrados e, portanto, pode ser um candidato para o mecanismo por trás sobrevivência crescimento de células de tumor [3]. Além disso, muitos cancros são associado com a sinalização de SHH, tais como o cancro carcinoma de células basais, esófago e do estômago, cancro do pulmão de células pequenas [4] e adenocarcinoma pancreático [5]. SHH activação da via é iniciado pela ligação do receptor transmembranar segregada e ligando-lípido modificado para Shh Patched1 (Ptch1). Como consequência, a inibição Ptch1 de Smoothened (Smo), uma proteína que atravessa a transmembranar-7 passe, é aliviada e a cascata de sinalização de SHH é iniciado, o qual por sua vez activa os factores de transcrição Gli [6]. Existem três proteínas que codificam tanto Gli activador e a função do repressor. GLI1 actua como um activador transcricional, Gli2 é um composto de domínios reguladores positivos e negativos, e Gli3 actua principalmente como um repressor de transcrição [7]. Na presença de Shh, Gli1 é transcricionalmente activado e o processamento fosforilada e proteolítica de Gli2 e Gli3 com as suas formas de repressor truncadas é inibida, levando à activação de genes alvo via de sinalização de SHH específicos, tais como Gli1 e Ptch1 [8].

uma vez que os mecanismos subjacentes tumor repovoamento acelerada durante a radioterapia não são bem compreendidos, pretendemos investigar um papel para a via SHH bem estabelecida na proliferação de células tumorais após o processo de radioterapia. É bem sabido que a radioterapia provoca a apoptose que podem desempenhar um papel crítico na repopulação de células de tumor [9]. Nos nossos estudos anteriores, que têm demonstrado que as células tumorais morrem utilizar o processo apoptótico para gerar sinais de caspase 3 estimulantes do crescimento mediadas para estimular o repovoamento de tumores submetidos a radioterapia [10]. Além disso, também encontramos via “Phoenix Rising”, através do qual caspases executoras, como a caspase 3 e 7, em células em apoptose promovem a cicatrização de feridas e regeneração de tecidos em organismos multicelulares [11]. No câncer de esôfago, a via de sinalização SHH foi amplamente ativado em xenoenxertos e tumores residuais após quimioradioterapia e sinalização de bloqueio SHH reforçada citotoxicidade da radiação [12]. Portanto, a via “Phoenix Rising” com a estimulação do crescimento do tumor mediada por caspase ea via de sinalização SHH podem ambos ser envolvido em repovoamento de células tumorais após a radioterapia.

Neste estudo, examinamos os papéis da via de sinalização SHH em células morrendo estimulou o crescimento de células tumorais. Os nossos dados mostram uma clara evidência para um papel para Shh secretado pelas células que morrem em promover a rápida repovoamento de tumores a partir de um pequeno número de células de tumor vivas. Acreditamos que esta via recém-descoberto de Shh estimulado repovoamento tumor desempenha um papel fundamental na radioterapia do câncer. Além disso, a segmentação da via SHH pode ter implicações clínicas para a melhoria dos resultados de radioterapia do cancro.

Materiais e Métodos

Celulares Condições Cultura

células Panc1 câncer pancreático humano e do cólon humano células HT29 câncer, foram adquiridos a partir da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China) e cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagles (DMEM) (Thermo, Beijing, China) com soro fetal bovino a 10% (FBS, Sijiqing, Hangzhou, China), 100 U ml

-1 penicilina e 100 ug ml

-1 estreptomicina a 37 ° C em atmosfera húmida contendo 5% de CO

2.

Tumor Repovoamento Modelo

In vitro

, células HT29, ou células cultivadas Panc1 em 10 cm de placa de petri foram irradiados raios-X e vinte e quatro horas mais tarde, eles foram tripsinizadas e semeadas em placas de 24 poços (Corning, Nova Iorque, EUA) a uma densidade de 2,5 x 10

5 células por poço, em triplicado, em DMEM contendo FBS a 2%. Vinte e quatro horas mais tarde, Fluc marcado, HT29 não tratadas ou células Panc1 foram semeadas a uma densidade celular de 1000 células por poço. O meio foi mudado a cada 2 dias durante 14 dias.

A irradiação de células cancerosas

irradiação de raios-X de células foi realizada utilizando um acelerador linear de Oncor (Siemens, Amberg, Alemanha), localizado no departamento de radiação oncológica na Shanghai Jiaotong University filiados Hospital People First. A taxa de dose para a máquina é de cerca de 3,6 Gy /min.

Transdução Gene nas células

Nós transduzidas vários genes exógenos em células alvo através da utilização de vectores lentivírus. O vector lentiviral mais vulgarmente utilizado é o sistema de pLEX (Thermo Scientific Inc, Pequim, China), que continha um gene de resistência à puromicina. Os genes que foram clonados neste vector, incluem o seguinte: luciferase2 de pirilampo e o gene de fusão de proteína fluorescente verde (Fluc) accionado por promotor de CMV, o gene de luciferase dirigido por × 8 do tipo selvagem Gli1 do local de ligação ou local de ligação de 8 × Gli1 mutada (isto é, wild- digite 8 × gene GBS luciferase ou mutação do gene luciferase 8 × GBS), bem como shRNA contra Gli1. Todos os vectores lentivirais foram empacotados em células 293T seguindo as instruções do fabricante. As células HT29 estavelmente transduzidas ou Panc1 foram obtidos por infecção por lentivírus e selecção puromicina na presença de 2 ug /ml de puromicina para duas semanas.

Luciferase Assay

O Luciferase Reporter Assay Sistema E1500 (Promega , Wisconsin, EUA) foi utilizado para determinar as actividades de luciferase de pirilampo de acordo com as instruções do fabricante. células HT29 e Panc1 que expressam o tipo selvagem 8 × gene da luciferase de GBS ou o gene da luciferase mutante 8 × GBS foram irradiadas com 6 Gy de radiação ionizante. As actividades de luciferase para a 6 Gy irradiados e células não irradiadas foram testados. As medições foram realizadas com um luminómetro Berthold (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanha), e os valores da luciferase do pirilampo de células que expressam a luciferase do gene de tipo selvagem foram normalizados pelos valores da luciferase do pirilampo de células que expressam gene da luciferase mutante. A normalização minimiza variabilidade experimental. Todos os experimentos foram realizados em triplicado e, em seguida, repetido três vezes.

bioluminescência imagem

Para a imagem dos sinais de luciferase emitidos a partir de células, foi utilizado o instrumento NC100 de Berthold Technologies (Bad Wildbad, Alemanha) localizados na Faculdade de Ciências Médicas básicas, Universidade de Fudan. Para Panc1 e células HT29, medimos sinais de luciferase por adição de D-luciferina (Promega, Wisconsin, EUA) em PBS a uma concentração final de 0,15 mg /ml. Cinco minutos após a administração de D-luciferina, as imagens foram capturadas e sinais de luciferase (fotões /sec) foram, em seguida, processadas e analisadas quantitativamente por utilização de software fornecido pelo fabricante. As imagens foram realizadas sempre no mesmo ponto de tempo para minimizar a variabilidade. Os sinais de luciferase foram medidos em células Panc1 e HT29 a 14 pontos tempo do dia para maximizar a diferença observada entre os controlos sem alimentação e não tratados do grupo experimental alimentador irradiado.

Antibodies and Chemicals chave utilizados neste estudo

anticorpos comercialmente disponíveis contra a Shh, Gli1, β-actina, GAPDH (Cell Signaling Technology, Boston, EUA) e anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Bio-Rad, Califórnia, EUA) foram adquiridos. SHH sinalização antagonista ciclopamina Gant61 e foram ambos obtidos da Sigma-Aldrich (Missouri, EUA). GDC-0449 foi comprado de Selleck Chemicals (Texas, EUA). SHH agonista sinalização SAG foi obtido a partir Enzo Life Sciences (NewYork, EUA) e recombinante do rato sónico hedgehog N-terminal foi obtido a partir de R D Systems (Minnesota, EUA)

agonistas e antagonistas Tratamento

agonistas ou antagonistas foram adicionados quando irradiadas ou células HT29 Panc1 foram semeadas em placas de 24 poços como alimentadores. Foram utilizadas as seguintes concentrações: ciclopamina para as células HT29 (2 jiM e 5 | iM), ciclopamina para células Panc1 (0,5 uM, 1 uM, 2 uM e 5 ^ M), GDC-0449 para as células HT29 (0,2 uM, 0,5 uM, 1 uM e 2 uM), GDC-0449 para as células Panc1 (0,5 uM, 1 uM e 2 uM), Gant61 para HT29 células (1 pM, 2 pM e 5 pM), Gant61 para células Panc1 (2 uM, 5 uM, 10 ? M e 20? M), de pequeno rato recombinante hedgehog Sonic N-terminal para as células HT29 e Panc1 (600 ng /ml), a SAG para as células HT29 (5 nM, 10 nM e 100 nM), a SAG para células Panc1 (3 nM, 5 nM , 10 nM e 100 nM). Para confirmar o efeito de agonistas em células tumorais vivas, agonistas foram também adicionados a poços contendo células HT29 ou repórter Panc1 sozinho. As concentrações foram utilizadas como: SAG para Panc1 e células HT29 (5 nM, 10 nM e 100 nM), o péptido N-terminal hedgehog Sonic de rato recombinante para as células HT29 e Panc1 (600 ng /ml). O meio foi trocado a cada quarenta e oito horas e substituído com meio fresco contendo mesma concentração de agonistas ou antagonistas. O crescimento das células repórter foi monitorada 14 dias mais tarde por imagem.

shRNA Knockdown

Os plasmídeos lentivirais que codificam shRNA contra o gene Gli1 (HSH007701-HIVmU6) e controle de corrida (CSHCTR001-HIVmU6) foram adquiridos de Genecopoeia (Maryland, EUA). A sequência para shRNA contra Gli1 é 5′-acgccatgttcaactcgat-3 ‘. Os lentivírus que codificam Gli1 shRNA controlo e precipitação foram produzidos como descrito acima. células HT29 e Panc1 foram semeadas em placas de seis poços e subsequentemente infectadas. As células foram então tratadas com puromicina para seleccionar para aqueles que expressam estavelmente shRNA contra Gli1 e ARN de controlo precipitação. eficiência silenciamento foi confirmada utilizando Western blot para a proteína Gli1.

Western Blot

As células foram lavadas duas vezes com PBS e lisadas usando 120-200 ul de tampão RIPA padrão contendo inibidores da proteína (Beyotime, Jiangsu, China ). A concentração de proteína de cada amostra foi quantificada e 40-60 | ig de proteína por cada amostra foi utilizada para a análise de Western blot. Em geral, 40-60 ug de proteína em tampão de carga foi aquecida a 100 ° C durante 10 minutos e, em seguida, separado num gel de SDS-poliacrilamida por electroforese e transferidas para uma membrana de PVDF (Bio-Rad, Califórnia, EUA). As membranas foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C e, em seguida, com anticorpos secundários durante 2 horas à temperatura ambiente. ECL Plus (Roche, Basel, Suíça) foi usado para visualizar os sinais na membrana.

Análise Estatística

Os resultados foram analisados ​​utilizando a análise de variância (ANOVA) teste para avaliar estatística significado, respectivamente, com valores de

P

0,05 considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas com SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultados

Números Reporter celulares foram linearmente associada com a actividade da luciferase Quando Imagiologia

A fim para confirmar a correlação da actividade da luciferase em imagens com o número de células repórter, fizemos uma série de diluição para Fluc rotulados células tumorais (chamadas de “células repórter”). 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500 e 10000 Panc1Fluc ou HT29Fluc células tumorais foram semeado em placas de 96 poços em 6 replica o dia antes de imagem. A imagiologia foi realizada 5 minutos após a adição de D-luciferina usando o instrumento NC100. Os fótons de cada poço foram recolhidos e posteriormente analisados ​​por ANOVA de duas caudas. Os resultados indicaram que os fotões /sec foram linearmente relacionado com o número de células semeadas em poços (Fig. 1A, 1B, R

2 = 0,9967 em células Panc1Fluc e R

2 = 0,9973 em células HT29Fluc respectivamente).

A. A análise de correlação de fótons medidos por imagem de bioluminescência

vs números

celulares banhados. Fluc células marcadas Panc1 foram plaqueadas em placas de 96 poços em 6 repetições para o número indicado no dia antes de imagem. O fótons média /seg a partir de 6 repete a cada número de células foram analisados ​​por bicaudal ANOVA (R

2 = 0,9967). Os resultados indicaram que a intensidade de sinal de imagem correlacionados positivamente com o número de células plaqueadas. barra de escala branca representa 1 cm de comprimento. A análise de correlação B. de fótons medidos por imagem de bioluminescência

vs números

de células em células HT29. A análise procedimento e resultado foram as mesmas que as células Panc1 mencionados acima (R

2 = 0,9973). barra de escala representa 1 cm. C. Análise da intensidade do sinal das células cultivadas sobre as células Panc1Fluc Panc1 irradiados. 2,5 × 10

5 de raios-X irradiados células Panc1 foram semeadas em placas de 24 poços como alimentador. As doses foram de 0 Gy, Gy 2, 6 Gy, 10 Gy, 14 Gy e 20 Gy, respectivamente. 1000 células Panc1Fluc foram plaqueadas em cada poço com ou sem células alimentadoras como repórter. 14 dias mais tarde placa foi fotografada para a intensidade de bioluminescência. Top: análise da atividade da luciferase; Inferior: imagem de bioluminescência representante, barra de escala representa 1 cm. D. Análise de intensidade de sinal de células HT29Fluc cultivados em células HT29 irradiados. A análise procedimento e resultado foram as mesmas que as células Panc1 mencionados acima. Top: A actividade da luciferase; Resumindo:. Image bioluminescência representante, barra de escala representa 1 cm

irradiado Morrer Tumor celular estimulada estar Tumor Cell Growth

Realizou-se uma série de experimentos para examinar os efeitos de morrer, células tumorais irradiadas em várias doses, em células tumorais viva. Para simular

in vivo

cenários onde a grande maioria das células tumorais são mortos por radiação ou quimioterapia, que semearam um pequeno número (10

3) de Fluc marcado câncer pancreático células Panc1 humanos ou câncer de cólon humano HT29 células num leito de um número muito maior (2,5 × 10

5) de células cancerosas homologus não marcados. As células cancerosas estas últimas designadas por “células de alimentação” foram irradiados com 2 Gy, 6 Gy, de 10 Gy, de 14 Gy e 20 Gy, ou não tratado (0 Gy), respectivamente. Crescimento do pequeno número de células vivas “repórter” foi monitorizada por microscopia de epi-fluorescência a intervalos de 3 dias e por imagem de bioluminescência no dia14 (Fig. 1C, 1D). actividades de luciferase foram utilizados como substitutos para o número de células “repórter” que foi verificada pela nossa experiência associação linear (Fig. 1A, 1B). Nossos resultados indicaram que as células repórter cresceram significativamente mais rápido quando semeados em células do que quando semeadas sozinho morrendo. Além disso, células de alimentação irradiadas com 6 Gy mostrou o maior crescimento aumentando a capacidade de outras doses fez, com células de alimentação irradiadas não mostrando nenhum papel de suporte. Em células tumorais irradiadas com doses mais elevadas do que 6 Gy, capacidade de estimular o crescimento foi reduzida com o aumento da dose de irradiação (Fig. 1C, 1D). Estas observações foram verdadeiro para ambas as células HT29 e células Panc1.

A ativação do SHH via de sinalização foi positivamente correlacionada com morte celular estimulada estar Tumor Cell Growth

Para examinar se a ativação da via de sinalização SHH foi associada com a estimulação de crescimento de células tumorais por células a morrer, realizou-se experiências de Western blot com duas linhas de células de cancro, Panc1 (Fig. 2A) e HT29 (Fig. 2B). SHH sinalização activada foi confirmada por os níveis de proteína de Shh e Gli1 que foram quantificadas através da medição do sinal do 160-kD bandas de 19 kD e, respectivamente. Nós descobrimos que os níveis de proteínas Shh e GLI1 foram maiores em 6 Gy irradiadas células cancerosas do que as outras doses células cancerosas tratadas (Fig. 2c, 2d). Além disso, em células tumorais irradiadas com doses mais elevadas do que os níveis de proteína 6 Gy, Shh e GLI1 foram reduzidas com o aumento da dose de irradiação. É interessante que as tendências no nível de expressão de proteínas da via de sinalização SHH apresentaram a mesma tendência com o efeito de estimulação do crescimento após a irradiação, sendo que ambos foram maiores para 6 Gy e gradualmente reduzida com o aumento da dose de irradiação.

A . mudanças expressão de perfil de proteínas Shh e GLI1 em células Panc1 irradiados em várias doses e detectados por Western blot. B. Alterações Expressão de perfil de proteínas Shh e GLI1 em células HT29 irradiados em várias doses e detectados por Western blot. C. Intensidade relativa de bandas de proteína Shh e GLI1 sobre Western blot em células Panc1 irradiados em várias doses. D. intensidade relativa de bandas de proteína Shh e GLI1 sobre Western blot em células HT29 irradiados em várias doses. atividade E. luciferase do repórter Gli1 em células Panc1 irradiados e não irradiados. ** Representa

P Art 0,01. atividade F. luciferase de repórter Gli1 em células HT29 irradiados e não irradiados. ** Representa

P

. 0,01

Para confirmar ainda mais a ativação da via de sinalização SHH nas células alimentadoras, as células cancerosas Panc1 e HT29 foram transduzidas com lentivírus transportando um wild- digite 8 × repórter luciferase GBS ou 8 × repórter luciferase GBS mutado abrigar uma mutação pontual que elimina a ligação de Gli1. As células infectadas por lentivírus foram seleccionados com 2 ug /ml de puromicina. As células HT29 Panc1 e estavelmente transduzidas eram não tratadas ou irradiadas com uma dose de 6 Gy, e, em seguida, a actividade da luciferase foi medida. Os resultados sugeriram que a actividade de luciferase relativa em 6 Gy irradiadas células cancerosas foi significativamente mais elevado do que em células de cancro não-irradiadas (

P

0,01), indicando que a actividade do factor de transcrição Gli1 foi aumentada em 6 Gy irradiadas cancro células. Os resultados que foram observados em ambas as células Panc1 (Fig. 2E) e células HT29 (Fig. 2F) foram semelhantes e consistentes com os resultados de imagiologia bioluminence mostradas acima.

SHH Sinalização Antagonistas Inibição de morte celular Tumor Stimulated estar Tumor

celular crescimento

Dada a actividade da via significativamente sobre-regulada SHH em células irradiadas, nós examinamos se a manipulação da via SHH iria inibir ou promover a morte de células de tumor estimuladas vivo o crescimento de células tumorais. Cerca de 2,5 × 10

5 6 Gy células irradiadas Panc1 foram semeadas em placas de 24 poços em meio contendo antagonista de Smo (GDC-0449) a 0,5? M, 1? M, 2 ^ M ou veículo de controlo, respectivamente. 1000 Fluc células marcadas Panc1 vivos foram semeadas na irradiado com ou sem camada de alimentação de drogas tratados. Como mostrado na Fig. 3A GDC-0449 reduziu o crescimento Panc1 células de uma forma dependente da dose. Em comparação com os controles de veículo que continham, o sinal nos poços que continham 1 uM GDC-0449 ou 2 uM GDC-0449 foi significativamente reduzida (

P

0,05). Estes achados sugerem que GDC-0449 poderia inibir morrendo célula tumoral estimulada vivendo crescimento de células tumorais.

A. GDC0449, um inibidor da via de SHH pré-clínico, inibe o crescimento celular Panc1Fluc induzida por células morrendo Panc1 de uma forma dependente da dose. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm. * Representa

P Art 0,05. B. Gant61 Panc1Fluc inibe o crescimento de células induzida por células morrendo Panc1 de uma forma dependente da dose. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm. ** Representa

P Art 0,01. C. Cyclopamin inibe o crescimento celular induzida por morrer HT29Fluc células HT29 de uma forma dependente da dose. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm. * Representa

P Art 0,05, ** representa

P Art 0,01. D. Gant61 inibe o crescimento celular induzida por morrer HT29Fluc células HT29 de uma forma dependente da dose. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm. ** Representa

P Art 0,01. E. GDC0449 inibe o crescimento de células HT29 Fluc induzida por morrer células HT29 de uma forma dependente da dose. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm.

Para confirmar ainda mais as funções de sinalização de SHH morrendo célula tumoral estimulada vivendo crescimento de células tumorais, testamos outro antagonista Gli1 (Gant61). O estado era idêntica à referida condição para GDC-0449, excepto que a concentração Gant61 era ou 5 uM, 10 uM ou 20 uM. Observou-se uma redução do crescimento semelhante em Gant61 poços tratados em comparação com poços de controlo tratados com veículo (

P

0,01, Figura 3B.). No entanto, as células tratadas com Panc1 outro antagonista de Smo (ciclopamina) não mostraram uma redução no crescimento celular (dados não mostrados).

Experiências semelhantes foram realizadas em células HT29. Cerca de 2,5 × 10

5 6 Gy irradiadas HT29 células foram semeadas em placas de 24 poços em meio com ou sem ciclopamina a 2 uM, 5 ^ M ou veículo de controlo, respectivamente, sobre a qual 1,000 Fluc marcado células HT29 vivas foram semeadas. Em comparação com o grupo de controlo tratado com veículo, ciclopamina reduzido o crescimento de células HT29 de um modo dependente da dose (Fig. 3C). As células HT29 cultivadas em veículo de controlo mostrou uma significativamente maior do que a actividade da luciferase as células cultivadas em 2 uM ciclopamina (

P 0,05

) e 5 ciclopamina uM (

P

0,01).

Testamos ainda mais o antagonista Gli1 Gant61 (Fig. 3D) e o antagonista de Smo GDC-0449 (Fig. 3E). Em ambos os casos, foram observados resultados semelhantes. O antagonista Gli1 Gant61 HT29 inibiu o crescimento de células de alimentação de morrer significativamente. No entanto, a diferença entre o grupo de controlo do veículo e os grupos tratados GDC-0449 não foi significativo (

P Art 0,05).

Gli1 Knockdown por shRNA Reduz Morrer Tumor celular estimulada estar tumoral celular crescimento

confirmou ainda mais o papel da sinalização de SHH na morte de células de tumor estimuladas vivo crescimento de células tumorais através da utilização de shRNA para knockdown expressão Gli1 em células alimentadoras. células HT29 e Panc1 infectadas com lentivírus transportando Gli1 shRNA foram seleccionados num meio com 2 ug /ml de puromicina, e análise de Western blot para expressão Gli1 foi utilizado para verificar a selecção correcta. Os níveis de proteína de Gli1 em ambos Panc1 e células HT29 (Fig. 4A, 4B) foram marcadamente reduzidas. Panc1 ou HT29 células transduzidas por Gli1 shRNA ou embaralhar shRNA foram irradiados com 6 Gy e usado como células alimentadoras, respectivamente. O crescimento de Fluc marcado células vivas Panc1 ou HT29 semeadas em células alimentadoras knockdown GLI1 foi significativamente atenuada como evidenciado pelas actividades de luciferase significativamente inferiores nos poços com Gli1 knockdown células Panc1 ou HT29 de poços com precipitação shRNA transduzidas células Panc1 ou HT29 (

P Art 0,05) (Fig 4A, 4B)

A… A expressão da proteína Gli1 reduzida em Gli1 shRNA transduzidas células Panc1 detectadas por mancha de Western (painel superior). A redução do crescimento celular Panc1Fluc morrendo Gli1 shRNA células Panc1 transduzidas. * Representa

P Art 0,05; barra de escala representa 1 cm. B. A expressão reduzida de proteína Gli1 em Gli1 shRNA células HT29 transduzidas detectadas por mancha de Western (painel superior). A redução do crescimento celular HT29Fluc morrendo Gli1 shRNA células HT29 transduzidas. barra de escala representa 1 cm.

SHH Sinalização agonistas Activate Tumor Cell Growth

A seguir, perguntou se o agonista via de sinalização SHH, SAG, que atua diretamente pela ligação a jusante Smoothened, faria promover o crescimento de células de cancro. células Panc1 e HT29 foram irradiadas a 6 Gy e semeadas em placas de 24 poços como alimentadores em meio com ou sem 3 nM, 5 nM, 10 nM ou 100 nM SAG respectivamente. SAG tratamento resultou no aumento do crescimento de células repórter de uma forma dependente da dose (Fig. 5A, 5B). Para comprovar os resultados obtidos com a SAG, nós adicionamos uma forma ativa de Shh, isto é, fragmentos N-terminais recombinantes de Shh em 600 ng /ml para o meio. Os resultados sugeriram que o fragmento N-terminal de Shh recombinante melhorada significativamente o crescimento de células de tumor em células alimentadoras morrendo em comparação com o controlo de veículo (

P

0,01). (Fig. 5C, 5D)

A. A activação de agonista de SHH de sinalização com sinalização SHH SAG aumenta o crescimento de células Panc1Fluc em células moribundas Panc1 irradiados de uma forma dependente da dose. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm. * Representa

P Art 0,05, ** representa

P

0,01. B. Activação de Shh sinalização com SAG aumenta o crescimento de células HT29 HT29Fluc em células moribundas irradiados de uma forma dependente da dose. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm. ** Representa

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0,01. C. Activação de Shh sinalização com agonistas de sinalização shh, fragmento N-terminal de Shh, aumenta o crescimento de células Panc1Fluc em células moribundas Panc1 irradiados. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm. * Representa

P Art 0,05. D. Activação de SHH de sinalização com o fragmento N-terminal de Shh aumenta o crescimento de células HT29 HT29Fluc em células moribundas irradiados. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm. * Representa

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. 0,05

SHH Sinalização agonistas Melhorar Viver Crescimento Reporter celular na ausência de células irradiadas Alimentador

Uma vez que a expressão Shh e Gli1 aumentou em irradiado Panc1 e células HT29 e SHH agonistas de sinalização de células tumorais morrem reforçada estimuladas vivo o crescimento de células tumorais, assumiu-se que o crescimento de células repórter reforçada foi causada pelo sinal SHH libertado a partir de células a morrer, activando deste modo a via de sinalização de SHH em células vivas repórter devem também causar célula crescimento. A fim de verificar nossa hipótese nós adicionamos a SHH sinalização agonistas SAG e o fragmento N-terminal recombinante da Shh às cavidades contendo Panc1 ou HT29 repórter sozinho. Ambos SAG e a forma activa de Shh aumentou significativamente Panc1 ou crescimento de células HT29 repórter (Fig. 6). Estes achados sugerem que o sinal de SHH libertada pelas células moribundas resultou no crescimento de células repórter devido à activação da via de SHH nas células repórter.

. SHH agonista sinalização SAG aumenta o crescimento de células Panc1Fluc de uma forma dependente da dose. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm. ** Representa

P Art 0,01. agonistas de sinalização B. SHH SAG aumenta o crescimento de células HT29Fluc de uma forma dependente da dose. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm. * Representa

P Art 0,05, ** representa

P Art 0,01. células C. Panc1Fluc tratados com fragmento N-terminal Shh demonstram maior crescimento. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm. * Representa

P Art 0,05. D. células HT29Fluc tratados com o fragmento N-terminal de Shh demonstram um aumento do crescimento. Top: análise de intensidade de sinal de imagem de bioluminescência de; Resumindo: imagens representativas bioluminescência; barra de escala representa 1 cm. ** Representa

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. 0,01

Discussão

repovoamento de células tumorais é um processo chave causando recidiva tumoral durante a quimioterapia ou radioterapia do cancro [13]. Repovoamento de células sobreviventes do tumor pode ocorrer entre fracções dose de qualquer radiação ou quimioterapia e pode levar ao fracasso do tratamento [14].