Sumário

CD44 como um dos marcadores de células estaminais mais putativos desempenha um papel fundamental em muitos processos celulares, incluindo crescimento celular do cancro e da migração. polimorfismos funcionais de nucleotídeo único (SNPs) de

CD44

pode modular as suas funções de genes e, assim, o risco de câncer. No presente estudo, investigamos se polimorfismos na região 3 ‘não traduzida (UTR) do

CD44

estão associados com aumento da susceptibilidade ao cancro colorectal (CRC) através da realização de um estudo de 946 pacientes com CCR caso-controle e 989 controles sem câncer. Três polimorfismos (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /A) no 3′-UTR de

CD44

foram genotipados. Descobrimos que os genótipos variantes (CT e TT) de rs13347 (odds ratio ajustado (OR) = 1,79, intervalo de confiança de 95% (CI) = 1,50-2,17) aumento da susceptibilidade do indivíduo para CRC, em comparação com rs13347CC genótipos homozigotos. Nós também descobrimos que os pacientes de CRC com o genótipo CT /TT tinham um risco aumentado de 1,6 vezes para o desenvolvimento avançado (estágio III + IV) CRC. Além disso, ensaios funcionais mostraram que o C a mudança de base T em rs13347C /T interrompe o sítio de ligação para o microRNA HSA-mir-509-3p, aumentando assim a

CD44

atividade transcricional e nível de expressão. Estes achados sugerem que o rs13347C /T no local de ligação microRNA podem ser potenciais biomarcadores para a susceptibilidade genética para CRC

Citation:. Wu XM, Yang HG, Zheng BA, Cao HF, Hu ZM, Wu WD (2015) variações genéticas funcionais do Binding-site microRNA no

Gene CD44

estão associados com risco de câncer colorretal em populações chinesas. PLoS ONE 10 (5): e0127557. doi: 10.1371 /journal.pone.0127557

Editor do Academic: Yifeng Zhou, Faculdade de Medicina da Universidade de Soochow, CHINA

Recebido: 13 de fevereiro de 2015; Aceito: 16 de abril de 2015; Publicado em: 26 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Provincial de Zhejiang Natural Science Foundation (No. 2013C33106). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CCR) é a terceira trato gastrointestinal mais comumente diagnosticado em todo o mundo [1], e sua incidência e mortalidade tem vindo a aumentar rapidamente ao longo das últimas décadas na China [2]. Estudos epidemiológicos têm demonstrado que fatores de risco ambientais, bem como fatores relacionados ao estilo de vida como dieta, tabagismo e consumo de álcool são considerados como contribuintes na etiologia do CRC [3, 4]. Mais e mais estudos já reconheceram que fatores genéticos podem modular significativamente a susceptibilidade ao cancro colo-rectal. Em particular, os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em genes alterar a sua expressão ou atividade, alterando a sequência de aminoácidos pode predispor a CRC tumorigênese [5-7].

O cancro é uma classe de doenças caracterizadas pelo crescimento incontrolável de células e dividir. Como uma pequena população de células dentro de um tumor, cancro de células estaminais (CSC) poderia contribuir para as formas mais agressivas da doença com capacidade para iniciar o crescimento do tumor e as suas propriedades de resistência à droga. estudos acumulando concentraram-se na existência de células-tronco do câncer colorretal em câncer colorretal humano [8-10]. Desse modo, a identificação precisa do cólon CSC e suas propriedades podem ajudar a avançar significativamente a terapia do cancro eficiente. cólon putativo populações CSC podem ser identificadas pela expressão de marcadores específicos CSC. CD44 é um marcador de células da haste bem conhecido por CRC [11].

gene CD44

codificava uma glicoproteína da superfície celular envolvidas em muitos processos biológicos incluindo activação de linfócitos, hematopoiese, desenvolvimento embrionário homing e [12]. Enquanto isso,

CD44 desempenha um papel indispensável no crescimento de células de tumor, diferenciação, invasão e motilidade em resposta a um microambiente celular, aumentando, assim, a agregação celular e contribuir para o desenvolvimento e progressão de tumores [13-15]. Estudos recentes têm mostrado a correlação significativa entre o nível de

CD44

de células de câncer de mama expressão e maior tumorigenicidade e potencial metastático [13, 16], destacando, assim, um importante papel de

CD44

na progressão tumoral e metástase. Correspondentemente, knockdown de

CD44

com siRNA específico (pequeno RNA de interferência) em células cancerígenas do cólon humano poderia progressão crescimento celular e tumor dramaticamente suppresse

in vitro

e

in vivo

, implicando fortemente um regulador potente da

CD44

na progressão da CRC [17, 18]. Além disso, outros estudos também indicaram que variantes genéticas no

gene CD44

foram associados com o risco de câncer e prognóstico [19, 20]. Os 3′-UTRs (regiões não traduzidas) de genes são as principais regiões abrangidas por microRNAs e têm um papel papel central na estabilidade do mRNA do gene e eventual modular a regulação das proteínas relacionadas. SNPs localizados nos locais de ligação de microRNA podem afectar a capacidade de ligação de microARN e teoricamente perturbar a expressão de

CD44 e, portanto, pode predisposite para a susceptibilidade à doença. Nossa hipótese é que SNPs no

CD44

3′-UTR estão associados com risco CRC, afetando a expressão de gene.

No presente estudo de caso-controle de base hospitalar, nós genotipados três polimorfismos (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /a) na 3’UTR do

CD44

e analisou a associação entre as variações genéticas e risco de CRC. Posteriormente ensaios funcionais foram ainda realizados para investigar a importância e funções biológicas desses SNPs.

Materiais e Métodos

População do estudo

A população de estudo consistiu em 946 CRC Han-Chinês pacientes e 989 controles sem câncer etnicamente correspondido. No estudo, foram excluídos pacientes com câncer colorretal ou controles saudáveis ​​que recentemente teve transfusões de sangue. Os pacientes com câncer e histopatológico CRC confirmou recrutados consecutivamente no Hospital de Zhejiang Provincial Popular (Hangzhou). Além disso, não houve idade, estágio e histologia restrição para pacientes com câncer colorretal. Enquanto isso, todos os indivíduos saudáveis ​​recrutados aleatoriamente no estudo não tinha história documentada de câncer e sexo controles sem câncer combinados de frequência com base em sua idade (± 5 anos). Eles também foram recrutados aleatoriamente a partir de uma pesquisa de 3500 nutricional individual realizada na província de Zhejiang na quase mesmo período, no qual amostras de sangue dos pacientes de câncer foram recolhidos, com uma taxa de resposta de 90%. O estadiamento do tumor, nó, metástase (TNM) classificação e tumor foi avaliada de acordo com a Comissão Mista de 2002 Americana sobre sistema de estadiamento do Câncer. O consentimento informado foi assinado por cada participante para a análise de correlações moleculares, e cada participante foi agendada para uma entrevista com informação seleccionada como o status de fumo, consumo de álcool, histórico familiar e outros fatores de confusão em potencial. As distribuições das características clínicas selecionadas do status de caso-controle estão resumidos na tabela 1. As amostras de sangue de 5 ml foram coletadas no momento da inscrição para cada um dos assuntos. Este estudo foi aprovado pela comissão de ética médica do Hospital de Zhejiang Provincial Popular.

análise Genotipagem

DNA genômico foi extraído de cada amostra de sangue obtida de todos os participantes usando um Kit de sangue Mini (Qiagen, Valencia, CA) e armazenado a -80 ° C. Três polimorfismos (rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /A) no 3′-UTR de

CD44

foram selecionadas e genotipadas por análise de espectrometria de massa alelo-específico MALDI-TOF como descrito anteriormente [21]. Pares de primers e reações multiplex foram desenhados por reais NP.com site. Aproximadamente 10% MALDI-TOF espectrometria de massa analisaram amostras foram selecionados aleatoriamente para uma repetição cega. Para efeitos de controlo de qualidade, 50 amostras foram novamente analisadas por sequenciação directa e os resultados estavam de acordo a 100%.

Construção de repórteres de luciferase

A genotipagem para

CD44

SNPs mostrou que rs13347C /T foi significativamente associada com o risco de CRC. Com base na análise bioinformática (servidor Web SNPinfo: https://snpinfo.niehs.nih.gov/), o rs13347C a transição rs13347T ganhou uma nova ligação do microRNA HSA-mir-509-3p. Portanto, a hipótese de que SNP rs13347C /T para os locais de ligação de microRNA podem influenciar a capacidade de ligação da HSA-mir-509-3p, e, portanto, teve qualquer efeito sobre

expressão de CD44

. Para testar esta hipótese, o fragmento 358bp 3′-UTR do humano

CD44

gene que flanqueia o rs13347C ou rs13347T alelo foi sintetizado pela Companhia Genewiz (Suzhou, China), e, em seguida, foram clonados no vector de base psiCHECK2 (Promega, Madison, WI, EUA) com Renilla e sequências do gene de luciferase de pirilampo (Fig 1A). As duas construções foram sequenciadas para confirmar o alelo e integridade de cada inserção.

(A) Representante (

CD44

-rs13347C e psiCHECK2-

CD44

-rs13347T psiCHECK2-) gráfico da actividade da luciferase do alelo variante em genes repórter da luciferase que ostentam a 358bp do fragmento 3′-UTR do humano

gene CD44

que flanqueia o polimorfismo rs13347C /T. atividade luciferase relativa do psiCHECK2-

CD44

-rs13347C e psiCHECK2-

CD44

construções -rs13347T cotransfectadas com ou sem 40pmol HSA-mir-509-3p ou 40pmol HSA-mir-509-3p inibidor, respectivamente, realizada em células SW260 (B) e células SW116 (C). Seis repetições foram realizadas para cada grupo, e a experiência foi repetida pelo menos três vezes. Asterisco indica uma mudança significativa (

P Art 0,05). Os dados são média ± SEM. (D)

CD44

nível de expressão em 37 tecidos CRC de indivíduos com diferentes genótipos rs13347C /t (15 rs13347CC, 16 rs13347CT e 6 rs13347TT);

CD44

expressão foi normalizado para o

gene GAPDH Comprar e apresentados como média ± SEM. Os dados apresentados são representativos de pelo menos três experiências independentes. (E) O nível de expressão de HSA-miR-509-3p em 37 tecidos CRC agrupados por rs13347C genótipos /t. A expressão de ARNm de HSA-miR-509-3p foi calculada em relação à expressão de

U6

ARNm através do cálculo dos níveis de expressão relativos. Os dados são média ± SEM,

P

= 0,579. As diferenças nos níveis de expressão foram analisados ​​com o one-way ANOVA.

transfecções transientes e ensaios de luciferase

Duas linhas celulares colorectal humanos SW116 e SW620 foram mantidas em meio L-15 (Gibco, Los Angeles, Califórnia, EUA) com 10% de soro fetal bovino (Sigma-Aldrich, MO) a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2. 1 × 10

5 células por poço, foram semeadas em placas de 24 poços (BD Bio Sciences, Bedford, MA, EUA) antes da transfecção. Depois de 24h, as células foram então transfectadas transientemente como descrito anteriormente [22, 23] com plasmídeos repórter (1.5μg rs13347C ou alélicas rs13347T) com ou sem 40pmol imita tem-mir-509-3p 40pmol ou inibidores de Lipofectamine 2000 de acordo com o protocolo (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para os ensaios de luciferase, as células foram colhidas após a transfecção durante 24 h, e a actividade de luciferase Renilla foi quantificada com o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI).

-PCR em tempo real

ARNs de 37 tecidos diferentes genótipos com CRC rs13347C /T foram extraídos e sujeitos a transcrição reversa em cDNA utilizando oligo-dT. discriminação alélica dos polimorfismos rs13347 do

gene CD44

foi realizada com o sistema de detecção de 7500 seqüência ABI Prism para avaliar

CD44 Comprar e

GAPDH

níveis de mRNA baseado no SYBR-Green Método. L Al quantificações foram realizadas com

GAPDH

como padrão interno. Além disso, o TaqMan Ensaios MicroRNA (Applied Biosystems) foi utilizado para detectar a expressão de tem-mir-509-3p fundo em tecidos de CRC de acordo com o protocolo dos fabricantes. Expressão de RNA nuclear pequeno o universalmente expresso

U6

também foi utilizado para um controlo interno. A quantificação relativa de

CD44

expressão foi analisada pelo 2

método -ΔΔCT. Cada ensaio foi feito em triplicado.

A análise estatística

testes qui-quadrado de duas faces foram usados ​​para comparar diferenças nas distribuições de características clinicopatológicas entre os casos e controles sem câncer. Para o estudo de caso-controle, o equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) foi testado para comparar as freqüências genotípicas esperadas com freqüências genotípicas observadas nos controles por um teste qui-quadrado do goodness-of-fit. A correlação entre as variações genéticas e parâmetros clínicos foi analisada utilizando o teste do qui-quadrado, conforme apropriado. As odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC) foram estimados para avaliar a correlação entre rs13347C polimorfismo /T e risco de CRC usando um incondicional modelos de regressão logística. A análise estratificada também foi realizada para avaliar a possível interação entre

CD44

polimorfismos e variáveis ​​selecionadas sobre o risco de CRC. As comparações estatísticas de mais de dois grupos foram avaliados por ANOVA one-way. O poder estatístico foi calculado usando o Software PS (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSample-Size). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software STATA (versão 10; STATA Corporation). A associação foi considerado significativo quando

P

-valor foi inferior a 0,05.

Resultados

Genótipos e risco de CRC

Um total de 946 casos de CRC e 989 controles saudáveis ​​foram recrutados em nossa análise e genotipados para avaliar as associações entre

CD44

rs13347C /T, rs10836347C /T, rs11821102G /a e risco de CRC. As distribuições dos genótipos de três polimorfismos entre os casos e os controlos são resumidos na Tabela 2. As frequências do genótipo observadas desses SNPs estudados em controlos saudáveis ​​foram consideradas consistentes com HWE. resultados de genotipagem mostrou que apenas rs13347 foi estatisticamente significativamente associada com o risco de CRC, há associações significativas foram observadas em outros SNPs. Os pacientes com a

CD44

polimorfismo genótipos rs13347TT foi associado com o aumento do risco de câncer colorretal entre os casos e controles. Além disso, com o genótipo transportador variante combinada CT /TT exibiram um risco significativamente maior de CRC (OR = 1,79, 95% (CI) = 1,50-2,17),

P

10

-4) , em comparação com o genótipo CC.

Foi realizada ainda a análise estratificada por rs13347C /T por características clínicas ou patológicas, tais como idade, sexo, tabagismo, consumo de álcool e história familiar de câncer. Como mostrado na Tabela 3, não havia uma interacção significativa entre o polimorfismo rs13347C /T e estágio do tumor. Observou-se que, em comparação com o genótipo rs13347CC, os pacientes com o genótipo CT /TT teve mais de 1,6 vezes maior risco para o desenvolvimento avançado (estágio III + IV) CRC (

P

= 0,004). No entanto, há diferenças em outros subgrupos foram encontrados.

Efeito do SNP rs13347C /T sobre a atividade do gene repórter

Duas construções repórter luciferase contendo rs13347C ou alelo rs13347T transitoriamente foram co-transfectadas com mímica ou inibidor da HSA-mir-509-3p que foram predicado ligação a rs13347C T site /polimórfica por análise bioinformática para investigar o efeito do SNP rs13347C /T em

actividade de transcrição 3′-UTR CD44

. Como mostrado na Fig 1B e 1C, as células transfectadas CRC imitam microARN HSA-mir-509-3p pode diminuir significativamente a actividade de luciferase do gene repórter com o alelo rs2735383C em comparação com o alelo rs2735383T (

P = 0,007 para

SW620 e

P

= 0,02 para SW116). Em contraste, a actividade do gene repórter com o alelo rs13347C significativamente tenderam para inverter a seguir à transfecção transitória de células com HSA-mir-509-3p mímico e o seu inibidor correspondente. No entanto, não foram observadas quaisquer efeitos significativos sobre os genes repórter com o alelo rs2735383T com o tratamento da mímica HSA-mir-509-3p e inibidor. Estes resultados indicaram que o C a T mudança de base de rs13347C /T interrompe o sítio de ligação para HSA-mir-509-3p, assim, aumentou a atividade transcricional do

CD44

gene.

Associação entre rs13347C genótipos e /T

expressão de CD44

realizou-se PCR em tempo real para avaliar os efeitos da rs13347C /T em

CD44

expressão usando 37 tecidos tumorais de não tratada pacientes com CCR com diferentes genótipos. Tal como ilustrado na figura 1D mostrado, os resultados revelaram que os doentes com genótipos rs13347T (CT e TT), continham um número significativamente maior>

(média ± erro padrão da média (SEM): 0,565 ± 0,057), em comparação com portadores dos genótipos rs13347CC (média ± SEM: 0,305 ± 0,050, teste ANOVA:

P

= 0,003). E nós, em seguida, analisou a associação entre HSA-mir-509-3p expressão e

CD44

rs13347C /genótipos T. A HSA-mir-509-3p é expressa constitutivamente nos tecidos tumorais de 37 pacientes de CRC não tratadas com diferentes genótipos; no entanto, não houve associação significativa entre a expressão de HSA-mir-509-3p e do fundo do

CD44

rs13347C /genótipos T (0,037 ± 0,008 para CC; 0,027 ± 0,005 para CT e 0,029 ± 0,011 para o TT ; ANOVA teste:.

P

= 0,579) (Fig 1E)

Discussão

no presente estudo epidemiológico molecular, que investigou as associações de três SNPs em 3 ‘ -UTR de

gene CD44

com o risco de câncer colorretal em população chinesa e descobriu que o rs13347C /T foi significativamente associada com um risco aumentado de CRC. Observou-se também um elevado risco significativo de estágio do tumor CRC associado com a variante rs13347T de uma maneira dose-alelo. Outras experiências funcionais mostraram que a variante rs13347T pode alterar significativamente HSA-mir-509-3p mediada

CD44

atividade transcricional ea atividade de expressão. Os resultados indicam que as variantes em

gene CD44

pode ser valiosa para a avaliação de risco, diagnóstico e análise epidemiológica genética do CRC.

O

gene CD44

está localizado a cromossômicas lócus 11p13 e codifica uma glicoproteína transmembranar de superfície celular amplamente expressa em uma variedade de tipos de células. A proteína abrange, principalmente, com N-terminal (resíduos 38-46) e a porção C-terminal do domínio extracelular (resíduos 150-162), que se sabe ser necessária para ligação de um repertório diverso de ligandos, tais como ácido hialurónico (HA), osteopontina e metaloproteinase [24]. Existem várias linhas de evidência experimental apoiando um papel para

CD44 envolvido numa vasta gama de processos celulares, incluindo a activação dos linfócitos, a apoptose, a hematopoiese, recirculação e homing [25-27].

CD44

tem uma actividade promotora de tumor bem documentadas, que inclui a promoção do crescimento de células tumorais, a diferenciação e metástases [28]. Muitos estudos de biologia molecular identificaram que

CD44

expressão está intimamente relacionado com as várias malignidades ocorrência, progressão e prognóstico [29-32]. Unexceptionally,

CD44

foi também encontrada a desempenhar um papel importante no desenvolvimento do CRC. Um estudo recente com base em 234 pacientes de CRC demonstraram que o aumento da

a expressão de CD44 em

CRC é correlacionada com metástases, o aumento da recorrência do tumor inicial e quimiorresistência [33]. evidência experimental recente de ambos

in vitro

clonogênica e

in vivo

ensaio tumorigênico revelaram que as células CD44 (+) CRC exibir as propriedades de células-tronco do câncer [18], indicando uma importância funcional

CD44

na iniciação e desenvolvimento CRC. Consistentemente, nós estabelecemos associação genética entre a expressão de

CD44 Comprar e risco de CRC. Além disso, análises funcionais mostraram que o

CD44

rs13347C /T SNP pode afetar

expressão de CD44

modificando ligação ao 3′-UTR do

CD44 HSA-mir-509-3p

gene. Estudos anteriores relataram que HSA-mir-509-3p pode desempenhar um papel importante como um gene supressor de tumor durante a formação do cancro [34, 35]. E nenhuma associação significativa entre a expressão de HSA-mir-509-3p e do fundo do

CD44

rs13347C /genótipos T foi observado no estudo, indicando que alguns mecanismos não reconhecidos modular o efeito de HSA-mir-509- 3p em genótipos de rs13347T pode existir. Nosso resultado mostrou que a C a T mudança de base de rs13347C /T, possivelmente, perturba o sítio de ligação para HSA-mir-509-3p, aumenta a atividade transcricional do

gene CD44

e, portanto, foi mais suscetível ao CRC.

no presente estudo, nós demonstramos pela primeira vez que

CD44

rs13347C /variação T contribui para um aumento do risco de CRC. O presente estudo é baseado numa amostra relativamente grande, aleatório, etnicamente homogénea, o que significa que é possível evitar qualquer viés de confusão. De nota, o poder estatístico foi aumentada para ser 0,91 (teste bilateral, α = 0,05) na detecção de um OR de N para os genótipos rs13347CT + TT (que ocorrem com uma frequência de 41,56% entre os controles) em comparação com o genótipo rs13347CC . Além disso, a associação é biologicamente plausível, sugerindo esta descoberta é notável.

Em conclusão, este é o primeiro relatório para encontrar associação entre o polimorfismo rs13347C /T localizado no sítio de ligação HSA-mir-509-3p, o que pode afectar

CD44

nível de expressão de ARNm e o risco de CRC. Para além disso, o nosso estudo indicou que, em comparação com o genótipo CD44 rs13347CC, os genótipos variantes (CT + TT) confere um risco aumentado de populações de CRC. Além disso, o efeito de risco de este polimorfismo é mais evidente na fase de tumor (III + IV) de pacientes de CRC. Maior, de preferência estudos caso-controle de base populacional são necessários para confirmar as associações entre

CD44

polimorfismos com diferentes neoplasias humanas em diferentes grupos étnicos.

Reconhecimentos

Este estudo foi suportado pelo Provincial de Zhejiang Natural Science Foundation (No. 2013C33106).