Abstract

O metabolito activo da vitamina D

3, 1,25 -dihydroxyvitamin D

3 (calcitriol) tem efeitos anti-proliferativos em cancro da próstata não agressivo, no entanto, os seus efeitos em sistemas modelo mais agressivas ainda não são claras. Nestes estudos, os efeitos do calcitriol e um análogo de vitamina D menos calc�ica,

2-2 (QW), foram testados QW-1624F

in vivo

, usando o adenocarcinoma transgénico autóctone agressivo da próstata do rato ( ) modelo TRAMP. Para estudar a prevenção de cancro estimulado-andrógeno da próstata, do veículo, o calcitriol (20 ug /kg), ou QW (50 ug /kg) foram administradas a 4 semanas de idade, os ratinhos TRAMP intraperitoneais (ip) 3 x /semana em uma programação MWF para 14 semanas. Calcitriol e QW diminuiu a progressão do câncer de próstata, como indicado pela redução do trato urogenital (p = 0,0022, calcitriol; p = 0,0009, QW) e pesos da próstata (p = 0,0178, calcitriol; p = 0,0086, QW). No entanto, apenas o calcitriol aumento da expressão do marcador de pró-diferenciação, caderina 1 (p = 0,0086), e reduziu a proliferação do tumor (p = 0,0467). Em contrapartida, nem D análogo da vitamina tiveram qualquer efeito sobre o câncer de próstata resistente à castração em ratinhos tratados pré ou pós-castração. Curiosamente, apesar de vitamina D mostrou uma actividade inibitória contra tumores primários em ratos hormona intacta, metástases órgão distante parecia ser aumentada após o tratamento (P = 0,0823). Portanto, ratinhos TRAMP foram tratados a longo prazo com calcitriol continuar a analisar os efeitos sobre a metástase. Calcitriol aumentou significativamente o número de metástases órgão distante quando os ratos foram tratados a partir de 4 semanas de amadurecimento até que o desenvolvimento de tumores palpáveis ​​(20-25 semanas de amadurecimento) (p = 0,0003). No geral, os dados sugerem que a intervenção precoce com vitamina D em TRAMP diminuiu a progressão do tumor estimuladas por androgénio, mas o tratamento prolongado resultou no desenvolvimento de uma doença resistente e mais agressivo associado com o aumento da metástase órgão distante

citação:. Ajibade AA, Kirk JS, Karasik E, Gillard B, Moser MT, Johnson CS, et al. (2014) No início Crescimento inibição é seguida de doença metastática Aumento com vitamina D (Calcitriol) Tratamento no modelo TRAMP de câncer de próstata. PLoS ONE 9 (2): e89555. doi: 10.1371 /journal.pone.0089555

editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de setembro de 2013; Aceito: 21 de janeiro de 2014; Publicação: 26 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ajibade et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Roswell Park Cancer Institute e do National Cancer Institute (NCI) CA016056 concessão # P30, pelo NIH /NCI conceder # 5R01 CA95367 (a BAF) e pelo Departamento de defesa (DOD) Pré-dOUTORAMENTO concessão # W81XWH-05 -1-0571 (de AAA). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é uma das principais causas de câncer e mortalidade relacionada ao câncer em homens americanos [1]. fase inicial, confinado ao órgão, o PCA pode ser gerido por cirurgia, radioterapia ou espera vigilante, enquanto os homens com localmente avançado ou metastático CaP são tratados principalmente por terapia de privação de andrógeno [2]. No entanto, muitos pacientes acabam desenvolvendo castração resistente APC, para os quais as opções de tratamento atuais são apenas paliativos. A prevalência, longa latência, morbidade e mortalidade associada com PCA têm gerado interesse significativo em agentes de desenvolvimento para a quimioprevenção da doença [3].

associações epidemiológicas entre a vitamina D e PCA sugerem que a vitamina D pode ser um importante regulador de crescimento e diferenciação CaP [4]. No entanto, estudos que associam os níveis séricos de vitamina D e incidência de CaP e mortalidade não estão fortemente correlacionados (revisto em [5]). Em contraste, estudos pré-clínicos demonstraram que a vitamina D tem potentes efeitos anticancerígenos em células CaP

in vitro

, incluindo a inibição da proliferação de células [6] e invasividade [7], a indução da paragem do ciclo celular [8], de estimulação apoptose [9], e promoção da diferenciação [10]. Além disso, numerosos

in vivo

estudos que utilizam sistemas de xenotransplante rato demonstram que os compostos de vitamina D suprimir o crescimento de tumores e metástases [6], [11], [12]. Além disso, a utilização de modelos de ratinho geneticamente modificadas que desenvolvem espontaneamente cancro, demonstram que a vitamina D pode prevenir a progressão de lesões pré-cancerosas CaP [13] e suprimir o crescimento do tumor em castração CaP resistentes [14].

Os ensaios clínicos realizados em pacientes com CaP têm sido principalmente decepcionante [15], [16], [17], [18], embora tenha havido alguns resultados positivos [19], [20], e ganhos têm sido feito na compreensão da vitamina D farmacocinética e farmacodinâmica. Uma das razões para o mau desempenho clínico de vitamina D é a sua grande hipercalcemia toxicidade, limitando-dose. Embora hipercalcemia é de fácil manuseio, pode ser impedindo a utilização óptima de calcitriol. Por conseguinte, os análogos menos calcémicos da vitamina D têm sido desenvolvidas com o intuito de reter os efeitos anti-cancro potentes do calcitriol. QW-1624F

2-2 (QW) é um análogo de calcitriol fluorado híbrido que é 100 vezes menos calcémica, altamente antiproliferativo, e provoca efeitos semelhantes a jusante calcitriol [21], [22]. Além disso, a administração de doses elevadas de QW (3 ug) inibir 7,12-dimetilbenz [a] antraceno-iniciado e promovido TPA-carcinogénese da pele em ratos, sem efeitos secundários hipercalcémicos [23].

O adenocarcinoma transgénico da próstata do rato modelo (TRAMP) é um modelo agressivo, autóctone de CaP [24]. Por 10 semanas-de-idade, os ratinhos TRAMP desenvolver de baixo grau, o cancro da próstata não-invasivo [25]. Como os ratos continuam a idade, o tumor progride de não-invasiva para alto grau, adenocarcinoma invasivo e tumores neuroendócrinos, posteriormente, pouco diferenciados por 20-25 semanas de maioridade. A natureza progressiva do modelo apresenta uma oportunidade para examinar os efeitos de agentes quimiopreventivos em ambas as fases precoce e tardia de desenvolvimento APC, em oposição a somente um ou o outro. Até agora, ainda não foram realizados de frente comparações dos efeitos quimiopreventivos de diferentes compostos de vitamina D em progressão CaP estimuladas por androgénio e resistente à castração. Desde a mortalidade por câncer de próstata ocorre em homens com doença avançada, o câncer em estágio final, buscou-se examinar a eficácia anti-câncer de compostos de vitamina D, utilizando o modelo TRAMP mais agressivo. Nestes estudos, foi utilizado o modelo TRAMP para investigar se o calcitriol ou QW pode prevenir ou

Declaração lenta estimuladas por androgénio e resistente à castração CaP iniciação, progressão e metástase. Materiais e Métodos

Ética

usos experimentais de animais de laboratório foram realizados em estrita conformidade com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e uso de animais de laboratório e o protocolo foi aprovado pelo Instituto Roswell Park Cancer (RPCI) animal Care e do Comitê uso (Assurance # A3143-01). RPCI é uma instalação de pesquisa animal acreditado AALAC International. Todos cirurgia foi realizada utilizando isoflurano para anestesia inalatória e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal.

Animais

As colónias reprodutoras foram mantidos no Departamento de Laboratório e de Recursos Animal (DLAR) instalação do núcleo no Roswell Park Cancer Institute (Buffalo, NY). ratinhos TRAMP macho homozigóticas foram cruzadas com o tipo selvagem murganhos fêmea FVB (Taconic, Germantown, NY) para se obter C57BL /6 x FVB 50:50 ratinhos TRAMP macho. Camundongos foram genotipados para confirmar a transmissão da linha germinal do transgene [24]. Todos os animais experimentais foram heterozigotos para o transgene, e mantida na Harlan Teklan S2335 dieta que contém 2,980 UI /kg de vitamina D3.

A vitamina D estudos quimiopreventivos

1α-hidroximetil-16-eno -24,24-difluoro-25-hidroxi-26,27-bis-homovitamin D

3 (QW-1624F

2-2, QW) foi obtido do Dr. Gary Posner (Johns Hopkins University, Baltimore, MD). estoques de calcitriol e QW foram dissolvidos em 100% de etanol, e foram novamente suspensas em solução salina de fresco antes de cada injecção. Os animais foram pesados, monitorizados quanto à toxicidade, e palpados para avaliar a carga tumoral numa base semanal. Os estudos foram terminados geralmente 72 h após o último tratamento com fármaco foi administrado. No momento da eutanásia, os pesos corporais finais foram medidos e o urogenital (UG) trato (bexiga, próstata e vesícula seminal) foram excisados ​​e pesados. O dorsal, lóbulos da próstata lateral e ventral foram microdissectados a partir do tracto UG e pesados ​​para obtenção de pesos da próstata. incidência metastática foi determinado com base no exame macroscópico da pélvica gânglios linfáticos, fígado, rins e pulmões, e por coloração imuno-histoquímica de tecido com um anticorpo específico do antigénio SV40 T. Os seguintes tecidos foram coletadas em cassetes 9-câmara para a histologia: dorsal, próstatas laterais, ventral e anterior, vesícula seminal, nódulos linfáticos peri-aórtico, rim, intestino e fígado. Coleção de tecidos para histologia foi priorizada, assim, os tecidos única que tenham ficado de grandes tumores da próstata foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C para análise de Western blot.

Para estudar o efeito de calcitriol ou QW na progressão da CaP estimuladas por androgénio, três grupos de ratinhos TRAMP quatro semanas de idade foram tratados com veículo (N = 40), calcitriol (n = 41) ou QW (n = 42) IP 3 × /Semana segunda, quarta e sexta-feira (MWF) durante 14 semanas (Figura 1A). O estudo foi terminado quando os ratinhos tinham 18 semanas de idade e os tecidos foram recolhidas como descrito acima. Algumas amostras foram incapazes de ser analisados, ou não avaliadas com base nos critérios de exclusão referidos. Um segundo estudo foi realizado para investigar o efeito de

longo prazo

administração de calcitriol na progressão CaP estimulada por andrógeno. Dois grupos de ratinhos TRAMP quatro semanas de idade foram tratados

longo prazo com veículo (N = 47) ou o calcitriol (n = 49) por via i.p. 3 × /semana MWF, até tumores palpáveis ​​desenvolvido (Figura 1A). Os tumores foram colhidos quando detectável por palpação abdominal.

(A) Representação esquemática da evolução no tempo de estudos quimiopreventivos. Todos os ratinhos foram castrados aos 12 semanas nos estudos refractário a hormonas. (B-C) Quatro ratinhos TRAMP-semanas de idade foram tratados com veículo (controle), calcitriol (20 ug /kg) ou QW (50 ug /kg) i.p. 3 x /semana durante 14 semanas. (B) os pesos corporais finais (g) de controlo (n = 40), calcitriol (n = 41) e QW (n = 42) ratos medidos 72 h após o último tratamento. os níveis de (C) de soro de cálcio (mg /dl) de controlo (n = 39), calcitriol (n = 40) e QW (n = 42) ratos medidos 72 h após o último tratamento. Todos os dados são representados como gráficos de caixas com medianas, e bigodes que representam o th 5

e 95

th percentis. • (pontos), representam pontos fora do th 5

e 95

percentil. Todos os valores de p foram gerados utilizando o teste de Mann-Whitney.

Dois estudos foram desenhados para avaliar o efeito de calcitriol ou QW na prevenção do CaP resistentes a castração em ratinhos TRAMP castrados cirurgicamente. Na

pós-castração

estudo, o tratamento foi iniciado imediatamente após a castração de ratos TRAMP às 12 semanas de maioridade. Três grupos de ratos castrados 12 semanas de idade foram tratados com veículo (N = 33), calcitriol (n = 31) ou QW (n = 30) por via i.p. 3 × /semana durante 12 semanas MWF (Figura 1A). Os ratinhos foram sacrificados às 24 semanas de amadurecimento e amostras de tecido foram obtidos como descrito acima. O

pré-castração estudo

, 4 ratinhos TRAMP semanas de idade foram tratados com veículo (n = 29) ou calcitriol (n = 34) i.p. 3 × /semana MWF durante 8 semanas. Ao fim de 12 semanas-de-idade, todos os ratinhos foram castrados e o tratamento foi continuado durante mais 12 semanas (Figura 1A). Os ratos foram sacrificados com 24 semanas de maioridade e amostras de tecidos foram adquiridos como descrito acima.

A análise histopatológica

Os tecidos foram colhidas, fixas, processados, secções embebidas em parafina e tecido (5 m ) foram cortadas para análise histológica. Hematoxilina e eosina (H E) Coloração de secções de tecido foi realizada e os tipos de tumor foram distribuídos por avaliação cega por A.A.A. e B.A.F. usando um sistema de classificação histopatológica padrão desenvolvido para o modelo TRAMP [25]. Neste sistema de classificação, a próstata normal (grau 1) se desenvolve progressivamente lesões prostáticas incluindo neoplasia de baixo grau intraepitelial prostática (PIN) (grau 2), carcinoma

In situ

(grau 3), cancro invasivo (4 graus e 5) e câncer em estágio avançado pouco diferenciado (grau 6) [25]. As terminologias utilizadas para descrever lesões prostáticas nos estudos atuais foram adaptadas do sistema de classificação acima mencionada, onde

baixo grau

(LG) lesões são equivalentes aos graus de tumor 1 e 2,

grau intermediário

(IG) representam lesões de grau 3 e

câncer

é equivalente a graus 4, 5 e 6. O dorsal, lóbulos da próstata lateral e ventral foram classificados individualmente e atribuída uma classificação global e pior grau. A classificação global é determinada através da avaliação do grau do tumor predominante presente em cada um dos lóbulos da próstata. incidência metastática foi confirmada através do exame dos gânglios linfáticos, fígado, rins e pulmões sob um microscópio de luz após a coloração imuno-histoquímica para o antigénio T grande SV40. fotomicrografias representativas foram tiradas com uma câmera digital de cor KP-D50 (Hitachi, Brisbane, CA).

Imunohistoquímica

As secções de tecido foram de-parafinado usando xilol e reidratados com álcoois graduados. A recuperação de antígenos foi realizada por ebulição com 1 × tampão citrato, pH 6,0 (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) durante 20 min. A peroxidase endógena foi bloqueada por lâminas imergindo em 3% H

2O

2 em metanol durante 15 min. As lâminas foram incubadas com os seguintes anticorpos primários: antigénio T grande de SV40 (Tag) (1:400, BD Pharmingen, San Diego, CA), MKI67 (1:1000, Novocastra Laboratories, Newcastle upon Tyne, UK), uma caderina (CDH1 ) (1:500, BD Pharmingen), receptor de andrógeno (AR) (1:200, Upstate, Lake Placid, NY) e sinaptofisina (AEP) (1:400, Zymed). O anticorpo secundário foi utilizado apenas como controlo negativo para todos os anticorpos. As lâminas foram lavadas com 1 × tampão de fosfato de Tris, pH 7,8 (8,4 de Na mM

2HPO

4, KH 3,5 mM

2 PO?

4, 10 mM de Tris, 120 mM de NaCl) seguido por incubação com o seguinte: anticorpos secundários de coelho conjugado com HRP anti-ratinho (DakoCytomation, Carpinteria, CA), conjugado com HRP suína anti-coelho (DakoCytomation) e de cabra biotinilado anti-coelho (Vector Laboratories, Burlingame, CA). A imunorreactividade foi detectado usando reagente de Vectastain ABC (Vector Laboratories) e tetracloridrato de 3,3′-diaminobenzidina (DAB, Sigma, St. Louis, MO). Os tecidos foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas com álcoois graduados, desembaraçadas com xileno e montadas utilizando lamelas de vidro.

A pontuação CDH1 de lóbulo ventral foi calculado por contagem do número de CDH1 glândulas positivas por 15 glândulas em um 10 × campo. O índice de proliferação do lóbulo ventral foi determinada por contagem do número de células positivas MKI67 em três campos (40 × ampliação) que eram representativos de zonas que apresentam o grau do tumor, dividido pelo número total de núcleos em cada campo.

análise de Western blot

imunotransferência foi realizada como previamente descrito [22]. Resumidamente, tecidos snap-congelados foram homogeneizados com Triton X-tampão de lise /SDS contendo 1 × Cocktail de Inibidor de Protease (BD PharMingen) e inibidores de fosfatase. As amostras foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidas para membranas PVDF durante a noite a 4 ° C por electroforese. As membranas foram bloqueadas à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h utilizando 5% de leite em TBST × 1 (v /W). A seguir à incubação durante a noite com anticorpos primários para o antigénio T grande de SV40 (1:250, BD Pharmingen) e actina (CP01, Calbiochem, San Diego, CA), as membranas foram lavadas com TBST, incubados com anticorpos secundários conjugados com HRP durante um mínimo de 1 h e expressão de proteína foi detectada por quimioluminescência.

análise soro

o sangue foi obtido por punção cardíaca terminal no momento de autópsia e recolheu-se soro a partir de amostras de sangue por centrifugação. Os níveis de cálcio foram medidos nos Laboratórios Clínicos Cancer Institute Roswell Park.

A análise estatística

Todos os gráficos e análise estatística foram gerados utilizando GraphPad Prism versão 5.0d para Mac OS X, GraphPad Software, San Diego California EUA, www.graphpad.com. O teste de Mann-Whitney não paramétrico foi realizado para comparar entre os resultados quantitativos, enquanto a análise categórica foi realizada através do desenvolvimento de tabelas de contingência e usando qui-quadrado ou teste exato de Fisher. Os resultados quantitativos são representados como diagramas de caixa que retratam a th 5

, 25

th, 50

th, 75

th e 95

th percentis de conjuntos de dados em cada grupo de tratamento, e categórica resultados são representados como porcentagens de cada grupo de tratamento.

resultados

compostos de vitamina D são não-tóxico e não interferem com SV40 grande expressão do antígeno T

Os efeitos da vitamina D compostos sobre a progressão do CaP estimuladas por androgénio foram avaliadas em ratinhos com a maturidade sexual, que começa a cerca de 4 semanas de amadurecimento em TRAMP. Três grupos de ratinhos TRAMP quatro semanas de idade foram tratados com calcitriol (20 ug /kg), QW (50 ug /kg) ou veículo durante 14 semanas a uma programação MWF (Figura 1A). Ratos tratados com compostos de vitamina D não experimentar qualquer perda de peso após a terapia (Figura 1B). peso corporal final foram 31,5 ± 2,1 g para o veículo, 31,5 ± 2,5 g para o calcitriol, e 30,7 ± 2,7 g para os ratos tratados QW. Além disso, os níveis de cálcio foram inalterada após 14 semanas de tratamento com veículo (8,6 ± 1,0 mg /dL), calcitriol (8,5 ± 1,4 mg /dl, p = 0,3334), ou QW (8,5 ± 0,9 mg /dl, p = 0,9096) , sugerindo hipercalcemia sustentada não é um problema (Figura 1C). Os níveis de cálcio foram elevados em alguns ratinhos portadores de tumor (controlo do veículo, n = 2/39; calcitriol, N = 1/40; e QW, N = 1/42), mas isto está provavelmente relacionado com o fenótipo do tumor e independente de tratamento. Porque a expressão específica da próstata dos genes precoces de SV40 (t e t antigénios; TAG) é necessário para a progressão do tumor no TRAMP [24], foi importante determinar se os agentes terapêuticos alterar a expressão do transgene. Semelhante ao do grupo controle (Figuras 2A, D, G), Tag foi expressa nas dorsais (Figuras 2B-C), lateral (Figuras 2E-F) e ventral (Figuras 2H-I) lóbulos da próstata após o tratamento com calcitriol ou QW respectivamente. A análise Western blot confirmou ainda que os compostos de vitamina D não interfere com a expressão do Tag (Figura 2L).

ratinhos TRAMP foram tratados com veículo (controle), calcitriol (20 ug /kg) ou QW (50 ug /kg ) IP 3 x /semana durante 14 semanas. A análise imuno-histoquímica de expressão tag no dorsal (A-C), lateral (D-F) e (G-I) lóbulos ventrais de ratos 18 semanas de idade. Etiqueta de coloração (J) de SV40 no lóbulo ventral de ratinhos não transgénicos da mesma idade. (K) no anticorpo coloração controle negativo. As fotomicrografias foram tomadas em 20 × ampliação. (L) a análise Western blot de expressão Tag em amostras de tumor de próstata pouco diferenciadas de controle, calcitriol- e ratos tratados com QW. Actina foi utilizado como controlo de carga. WT, Wild-type e tecidos da próstata não-transgênicas da mesma idade. O número da amostra utilizada para immunoblotting varia (controlo = 5, calcitriol = 2, QW = 5), porque foi dada prioridade à recolha de tecidos para histologia. Só sobraram tecidos de grandes tumores de próstata estavam disponíveis para immunoblotting.

Efeito de compostos de vitamina D sobre a incidência e progressão tumoral

A capacidade de calcitriol ou QW para inibir ou retardar a formação de tumores em TRAMP foi analisada após o tratamento de estimuladas por androgénio e castração resistente à PCA (Figura 1A). Em camundongos estimulados andrógeno-tratados com veículo, calcitriol, ou QW, a partir de 4 semanas-de-idade até 18 semanas-de-idade, a incidência tumoral foi evidente em 35,0% dos ratos de controle do veículo (n = 14/40), 26,8% de calcitriol ratinhos tratados (n = 11/41) e 35.6% dos ratinhos tratados com QW (n = 15/42) (Figura S1). Embora tenha havido um decréscimo de 8,2% na incidência de tumores ao tratamento com calcitriol, esta diminuição não foi significativa (p = 0,6337, teste do qui-quadrado).

Após a castração em 12 semanas-de-idade, os ratinhos TRAMP desenvolver castração tumores resistentes por 24 semanas-de-idade [25], [26]. Para determinar se compostos de vitamina D podem atrasar ou prevenir CaP recorrência, três grupos de ratinhos TRAMP castrados foram tratados com veículo, o calcitriol (20 ug /kg), ou QW (50 ug /kg) durante 12 semanas

pós-castração

(Figura 1A). Aproximadamente 64% (21/33) dos ratinhos de controlo desenvolveram tumores resistentes veículo castração, em comparação com 68% (21/31) e 57% (17/30) dos ratinhos no calcitriol e grupos QW respectivamente (Figura S1). No entanto, estas alterações não foram significativas (p = 0,6648, teste qui-quadrado). Também investigamos se a intervenção com o tratamento de vitamina D

pré-castração

poderia alterar a castração recorrência. Dois grupos de ratinhos TRAMP quatro semanas de idade foram tratados com veículo ou com calcitriol (20 ug /kg) a partir das 4 semanas de amadurecimento. Aos 12 ratos semanas-de-idade foram castrados e terapia foi continuada até os ratos foram 24 semanas-de-idade (Figura 1A). Cerca de 62% (18/29) dos ratos tratados com veículo e 74% (25/34) dos camundongos tratados com calcitriol desenvolveram a doença resistente à castração (Figura S1), mas nenhuma diferença significativa foi observada (p = 0,4184, teste exato de Fisher). No geral, estes resultados indicam que os compostos de vitamina D não foram capazes de reduzir a recorrência do CaP resistentes a castração em TRAMP.

Efeito de compostos de vitamina D sobre o grau do tumor e carga da doença

Para avaliar melhor os efeitos da compostos de vitamina D na progressão CaP estimulada por andrógeno em ratos após 14 semanas de tratamento, a doença prostática foi marcado por avaliação padrão histológico (veja

Materiais e Métodos

). notas globais de tumor foram atribuídas após exame cego de H lâminas E-manchada. Relatórios anteriores demonstraram que o lóbulo ventral é mais sensível para a intervenção terapêutica [27], [28], por conseguinte os tipos gerais de tumor da próstata ventral foram comparados entre os grupos de tratamento (Figura 3). De baixo grau (LG) lesões eram não-invasivo e foram caracterizados por uma maior estratificação epitelial com uma arquitectura glandular intacta (Figura 3A). lesões de grau intermediário (IG) também foram não-invasivo, mas exibido nucléolos proeminentes, acolchoamento epitelial, estruturas micropapilares, arquitetura cribriform, e uma arquitetura glandular intacta (Figura 3B). Por último, os cancros de fase final consistiu de forma proeminente por folhas de células anaplásicas com perda da arquitectura glandular (Figura 3C). A incidência de lesões foi de 40% LG no veículo tratados, 54% no tratado de calcitriol e 39% em ratinhos tratados com QW (Figura 3D). Em contraste, as lesões IG e câncer em estágio avançado desenvolvido com mais frequência no controle (60%) e grupos QW (61%) em comparação com os ratinhos tratados com calcitriol (46%) (Figura 3D). Além disso, a incidência de lesões cancerosas foi de 25% no controlo, 34% no grupo QW, e 20% no grupo de calcitriol (Figura 3D), no entanto estas alterações não foram significativas (p = 0,4699, teste de qui-quadrado). Intervenção também não teve efeito sobre o grau do tumor em dorsal e os lóbulos laterais da próstata (dados não mostrados)

H E coloração foi realizada em secções de tecido a partir de ratinhos TRAMP tratados com veículo (controle), calcitriol (20 ug /kg) ou QW (50 ug /kg) i.p. 3 x /semana durante 14 semanas. tecidos da próstata foram classificadas com base em um sistema de classificação histopatológica discutido na seção

Materiais e Métodos

. fotomicrografias representativas (20 × ampliação) de H E coloração dos lobos ventrais retratando (A) de baixo grau (LG) lesão prostática do grupo calcitriol, (B) de grau intermediário (IG) da lesão, e (C) câncer em estágio avançado no grupo de controle. (D) Incidência (%) das lesões LG, lesões IG, e cancro nos lobos ventrais de controlo (n = 40), calcitriol (n = 41) e QW (n = 41) grupos. Um teste de Qui-quadrado foi realizado para determinar se havia alguma associação entre o tratamento ea doença palco.

Carga de doença em TRAMP pode ser diretamente ligada à próstata e peso do trato urogenital (UG) [25]. O efeito dos compostos de vitamina D sobre a carga da doença foi inicialmente examinada em todas as amostras, incluindo LG, IG e cânceres em estágio final. Não foram observadas diferenças significativas, provavelmente resultante do desenvolvimento de tumores volumosos em cânceres em estágio final. Uma vez que tumores volumosos têm desenvolvido, os pesos destes tumores pode mascarar qualquer efeito da vitamina D tem sobre lesões LG e IG. Portanto, todas as análises subsequentes realizadas para andrógeno-estimulado pela PCA foi feito nas lesões prostáticas não-invasivos LG e IG. O calcitriol (p = 0,0022) e QW (p = 0,0009) reduziu significativamente o peso UG quando comparado com veículo na doença estimulou-androgénio (Figura 4A). Além disso, o calcitriol (p = 0,0178) e QW (0,0086) tanto reduzido o peso da próstata (Figura 4B). No entanto, em resistente à castração tumores TRAMP histologicamente comparáveis ​​ao câncer em estágio final, compostos de vitamina D não estatisticamente alterar a carga da doença quando tratados pós-castração (Figura 4C) ou pré-castração (Figura 4D). No geral, os resultados sugerem que os compostos de vitamina D foram eficazes em retardar o crescimento de fase precoce CaP estimuladas por androgénio, mas ineficaz para a doença resistente a fase tardia TRAMP castração.

(A-B) Os ratinhos foram tratados com veículo (controle) , calcitriol (20 ug /kg) ou QW (50 ug /kg) ip 3 x /semana durante 14 semanas. Somente as amostras com global de baixo grau não-invasiva (LG) de grau intermediário e (Ig) em lesões prostáticas dorsal, os lóbulos laterais e ventrais foram analisados, enquanto que todos os cancros foram excluídos das análises. (A) urogenital (UG) pesos (mg) de controlo (n = 30), calcitriol (n = 32) e QW (n = 28) ratinhos. pesos (B) da próstata (mg) de controlo (n = 29), calcitriol (n = 32) e QW (n = 28) grupos. pesos (C) UG (mg) de ratos castrados TRAMP 24 semanas de idade, tratados com veículo de controlo (n = 33), calcitriol (n = 30) ou QW (n = 30)

pós-castração

. (D) UG peso (mg) de ratinhos TRAMP castração 24 semanas de idade, tratados com veículo de controlo (n = 29) ou o calcitriol (n = 34)

pré-castração

. Todos os dados são representados como gráficos de caixas com medianas, e bigodes que representam o th 5

e 95

th percentis. • (pontos), representam pontos fora do th 5

e 95

percentil. Todos os valores de p foram gerados utilizando o teste de Mann-Whitney.

Calcitriol promove a diferenciação e inibe a proliferação em ratinhos TRAMP estimulada por andrógenos

Com base em observações que o calcitriol UG inibida e peso da próstata no lóbulo ventral (Figura 4), análises posteriores foram realizadas em lesões LG e IG não-invasivos. A perda de expressão da caderina 1 (CDH1) está associada com a progressão da APC e diminuição da diferenciação em TRAMP [25], [29]. CDH1 expressão está predominantemente localizada na membrana plasmática. No entanto, quando as células cancerosas estado de diferenciação perdem, a regulação da CDH1 pode ser interrompido resultando em padrões de expressão citosólica e nucleares [30]. Além disso, os aumentos na expressão de CDH1 correlacionada com a indução de diferenciação induzida por análogos da vitamina D em linhas celulares de CaP [31]. Assim, a expressão de CDH1 foi avaliada para determinar o efeito de calcitriol sobre a diferenciação. Em contraste com os murganhos de controlo (Figuras 5A-B), CDH1 foi fortemente expresso nos lobos ventrais de ratinhos tratados calcitriol (Figuras 5C-D). Enquanto alguma coloração citoplasmática de CDH1 foi observada em ambos os grupos de tratamento, a maioria da coloração CDH1 permaneceu ligado à membrana. quantificação subsequente confirmou que o calcitriol aumentou significativamente o número de glândulas CDH1 positivos em relação ao veículo (Figura 5G) (p = 0,0086). Além CDH1, receptor de andrógeno (AR) expressão foi também examinada nas próstatas ventrais do veículo e ratos tratados calcitriol (Figuras 5E e 5F). Embora não se observou qualquer diferença na expressão de AR, é importante notar que a expressão de AR foi mantida. Finalmente, há um aparecimento estocástica de cancros neuroendócrinos no modelo TRAMP que é marcada por um aumento da expressão de sinaptofisina durante a progressão tumoral [25]. O exame da expressão sinaptofisina indicou que o calcitriol e QW tratamento não alterou o fenótipo de incidência neuroendócrino (dados não mostrados).

A imuno-histoquímica foi realizada com anti-CDH1, anti-AR e anticorpos anti-MKI67 em secções de tecido a partir de controlo, calcitriol e os grupos de tratamento QW. (A-D, G) expressão CDH1 em não-invasivo de baixo grau (LG) e de nível médio (IG) tecidos da próstata ventral. fotomicrografias representativas de coloração CDH1 no controle grupos (A-B) e calcitriol (C-D). Inserção em (A) representa uma coloração positiva CDH1 de células epiteliais do cólon normais. As fotomicrografias foram tomadas a ampliação de 40 × (A, C) e áreas em caixas representam a 100 vezes (B, D). fotomicrografias representativas (40 × ampliação) de expressão AR em lesões prostáticas não-invasivos de lobos ventrais de (E) e controle de grupo calcitriol (F). pontuação (L) CDH1 de lesões do lóbulo ventral não-invasivas de controlo (n = 25) e o calcitriol (n = 27) grupos foi calculada através da quantificação do número de glândulas de E-caderina positivos como descrito em

Materiais e Métodos

seção. (H) proliferativa índice de LG e lesões IG ventrais lóbulo de controlo (n = 30), calcitriol (n = 33) e QW (n = 27) grupos foi determinada por quantificação MKI67 coloração tal como descrito em

Materiais e Métodos

seção. Somente lesões prostáticas LG e IG foram analisados, enquanto que cânceres em estágio final foram excluídos por ambos CDH1 pontuação e coloração MKI67. Todos os dados são representados como gráficos de caixas com medianas, e bigodes que representam o th 5

e 95

th percentis. • (pontos), representam pontos fora do th 5

e 95

percentil. Todos os valores de p foram gerados utilizando o teste de Mann-Whitney.

Além de examinar o status diferenciação de LG e lobos ventrais IG, coloração imuno-histoquímica foi realizada com um anticorpo MKI67 para examinar o efeito de calcitriol e QW sobre a proliferação de lóbulo ventral. Comparação com o veículo, o calcitriol diminuiu significativamente a proliferação no lóbulo ventral (p = 0,0467), enquanto QW foi ineficaz (P = 0,2667) (Figura 5H). Análise de apoptose demonstraram que a expressão global de pró-apoptótica de caspase 3 foi muito baixo (dados não mostrados).