Abstract

Apesar de todos os biomarcadores à base de sangue utilizados para monitorar pacientes com câncer de próstata, câncer de próstata permanece como a segunda causa comum de mortalidade por câncer em homens nos Estados Unidos. Isto é principalmente devido a uma falta de compreensão das vias moleculares que são responsáveis ​​pelas formas agressivas de câncer de próstata, o cancro da próstata castração-resistente e o câncer de próstata metastático. vias de sinalização celular ativados pelo

ERBB2

oncogene ou o

RAS

oncogene são frequentemente encontrados a ser alterado no câncer de próstata metastático. Para avaliar e definir o papel do ERBB2 via /RAS na metástase do câncer de próstata, que nós avaliamos o impacto da

ERBB2 Restaurant – ou

RAS

-overexpression sobre os potenciais metastáticos para células de câncer de próstata quatro linhas derivadas de tumores, com diferentes sensibilidades de androgénio. Para fazer isso, nós transfectadas do DU145 humana, LnCaP, e as células cancerosas da próstata PC3 e os Myc-Cap células cancerosas da próstata murinos com a forma ativada de

ERBB2

ou

H-RAS

e avaliados seus potenciais metastáticos por três ensaios complementares, um ensaio de cicatrização de feridas, um ensaio transpoço motilidade, e um ensaio de transpoço invasão. Nós mostramos que, enquanto a superexpressão de

ERBB2

aumentou o potencial metastático das células de câncer de próstata andrógeno-insensitive (ou seja, PC3 e DU145), não afetou o potencial metastático das células cancerosas da próstata andrógeno-sensíveis (ou seja LnCaP e myc-CAP). Em contraste, a sobre-expressão de

H-RAS única

aumentou a motilidade celular de células Myc-tampão, que sobre-expressam o humano

c-MYC

oncogene. Os nossos dados sugerem que ERBB2 colabora com androgénio sinalização para promover metástases de cancro da próstata, e que embora o RAS é um dos efectores a jusante críticos de ErbB2, não fenocópia ERBB2 para o seu impacto sobre os potenciais metastáticos de linhas celulares de cancro da próstata.

Citation: Tome-Garcia J, Li D, Ghazaryan S, Shu L, Wu L (2014) ERBB2 Aumenta metastático Potenciais Especificamente em células andrógeno-Insensitive do cancro da próstata. PLoS ONE 9 (6): e99525. doi: 10.1371 /journal.pone.0099525

editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, China

Recebido: 11 Abril de 2014; Aceito: 15 de maio de 2014; Publicação: 17 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Tome-Garcia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. estão disponíveis no papel todos os dados

Financiamento:. Start-up fundos de Rutgers de Nova Jersey Medical School. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o mais comum de câncer não-cutânea e a segunda principal causa de mortalidade por câncer em homens nos Estados Unidos [1]. Apesar do aumento de triagem para a detecção precoce e acompanhamento, a mortalidade específica por cancro da próstata tem-se mantido no mesmo nível [2]. Isto é provavelmente devido tanto à incapacidade de distinguir diagnóstico entre os não-invasivos, câncer de próstata localizado indolentes e os cancros localizados muito agressivos com alto potencial metastático, e os pobres compreensão da base celular e molecular para o câncer de próstata metastático [3].

Um dos genes mais estudados em tumores humanos, incluindo cancro da próstata, é a

ERBB2

ou

HER2

ou

NEU

oncogene. ERBB2 é um membro da família de receptores do factor de crescimento epidérmico (EGFR), que consiste de quatro membros (EGFR, erbB2, erbB3 e erbB4) que actuam como receptores tirosina-quinase [4] – [7]. Eles são considerados como mediadores potentes do crescimento de células e desenvolvimento de cancro [8] – [10]. No cancro da mama, a amplificação ou a sobre-expressão de

ERBB2

é um evento comum que aparece em 15-30% de todas as amostras [11], e

ERBB2 gene amplificação e /ou a sobre-expressão têm sido associados com um mau resultado clínico [12], [13]. Consistente com um papel importante de ErbB2 na metástase do cancro da mama, a sobre-expressão de uma forma constitutivamente activada do

ERBB2

(isto é,

neut

) [14] em ratinhos é suficiente para provocar tumores mamários metastáticos [15 ]. No entanto, o papel potencial de ErbB2 no desenvolvimento do cancro da próstata metastático não está claro em parte porque várias tentativas para avaliar frequências de

ERBB2

amplificação /sobre-expressão em amostras de cancro da próstata humanas produziram resultados inconsistentes [16] – [25]. Curiosamente,

ERBB2

superexpressão tem sido implicada em cancros da próstata metastático andrógeno-resistentes [26], sugerindo um possível papel para ERBB2 na aquisição de potenciais metastáticos de células cancerosas da próstata.

A superexpressão de

ERBB2

resulta na indução de várias vias de sinalização, tais como a fosfoinositida 3-quinase /proteína quinase B (PI3K /AKT) e a via de proteína cinase activada por mitogénio (MAPK) [27]. Tanto a via PI3K /AKT e MAPK a via de regular a proliferação celular e sobrevivência celular, e tem sido implicada na metástase do cancro [28] – [30]. O principal efetor a jusante de ErbB2 que regula estas duas vias de cinase é o oncogênico

RAS

, embora ERBB2 também é capaz de ativar PI3K /AKT independente do

RAS

activação [31]. Importante, PI3K /AKT e MAPK são as únicas vias RAS-efetoras comumente mutado em cancros humanos [32].

RAS

oncogenes codificam três GTPases monoméricas, H-RAS, N-RAS, e K-ras, os quais são activados quando ligada a GTP. Embora a inibição da

RAS

em células de câncer de próstata PC3 andrógeno-independente e células cancerosas próstata LNCaP andrógeno-dependentes levaram à paragem do crescimento e apoptose [33], a ativação constitutiva da via /MAPK RAS em células de cancro da próstata LNCaP promovido hipersensibilidade androgénio [34]. Além disso, a análise imuno-histoquímica de espécimes de cancro da próstata hormona-sensíveis e refractário a hormonas revelou que a expressão aumentada de

N-RAS

foi associada com cancros da próstata refractário a hormonas, e estava correlacionada com o tempo mais curto a reincidência do tumor e reduziu sobrevida específica da doença [35]. Em um modelo de rato xenograph, ativação de duas vias efetoras RAS,

Raf /ERK

e

RalGEF

, na linha de células de câncer de próstata DU145 moderadamente metastático promovido metástase para o cérebro, ossos, respectivamente [ ,,,0],36]. Estes dados sugerem um possível papel do RAS na promoção da metástase em câncer de próstata humanas.

Para definir ainda mais os potenciais papéis do ERBB2 /RAS via na promoção da metástase do câncer de próstata, que examinaram os efeitos da superexpressão de

ERBB2

ou

RAS

nas propriedades metastáticas de três linhas de células de cancro da próstata humano e uma linha celular de cancro da próstata de murideo, com vários níveis de sensibilidade de androgénio e diferentes potenciais metastáticos. Para fazer isso, primeiro transfectadas três linhas comumente usados ​​próstata humana de células de câncer (DU145, LNCaP e PC3) e uma linha de células de cancro da próstata murino (Myc-PAC) com a forma ativada de

ERBB2

ou

H-RAS

. Em seguida, avaliou os potenciais metastáticos de células geneticamente modificadas por três ensaios complementares diferentes, um ensaio de cicatrização da ferida, um ensaio Transwell motilidade, e um ensaio de invasão. Descobrimos que, enquanto a superexpressão de

ERBB2

aumentou potenciais metastáticos especificamente para células cancerosas humanas da próstata andrógeno-insensitive, superexpressão de

RAS

não tiveram impactos semelhantes sobre potenciais metastáticos mas especificamente aumento da motilidade celular de

células c-MYC

-overexpressing murino Myc-Cap.

Métodos

linhas celulares e Cultura de células

Myc-Cap é um não-metastático, andrógeno linha de murino sensível a célula de câncer de próstata que foi estabelecida a partir de tumores de próstata primários isolados do

ratinhos [37] Pb-Hi-Myc

. LnCaP [38], DU145 [39], e PC3 [40] são três linhas de células de cancro da próstata metastático humano com diferentes sensibilidades de androgénio e diferentes propriedades metastáticas (Tabela 1). LNCaP e células PC3 linhas foram mantidas em meio RPMI 1640, e as células Myc-CAP foram cultivadas em DMEM. Ambos os meios foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (FBS). células DU145 foram mantidas em meio DMEM: F12 de Ham (01:01) suplementado com 10% de soro de vitelo recém-nascido. células anfotrópicas Phoenix foram usadas para transfecção retroviral e foram mantidas em DMEM suplementado com 12,5% de FBS. células de fibroblastos de pele humana BJ senescentes foram gerados pela senescência replicativa [41] e foram utilizadas como um controlo positivo para o ensaio de actividade de β-galactosidase. Elas foram mantidas em DMEM suplementado com FBS a 10%. Todas as células foram cultivadas numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO

2.

Retroviral transfecção

vetores retrovirais superexpressão

pBabe-puromicina-H- Ras

e

pBabe-puromicina-ErbB2, que sobre-expressam uma forma mutante do ser humano

H-RAS

gene (

H-RAS

G12V

) e uma forma activada constitutiva do ser humano

ERBB2

gene (

neut

), respectivamente, foram presentes de Dr. Gustavo Leone. vírus de título elevado foram produzidas por transfecção com fosfato de cálcio transiente de construções retrovirais anfotrópicos em células de empacotamento Phoenix como previamente descrito [42]. Nós infectadas células de cancro da próstata com retrovírus frescos usando métodos padrão, na presença de polibreno (4 jig /ml). As células infectadas foram sujeitas a selecção com puromicina (2,5 ug /ml) durante cinco dias. células resistentes puromicina foram cultivadas em DMEM fresco sem puromicina por um dia, antes de ser colhida, quer para preparar lisados ​​de células para análise de transferência Western, ou re-plaqueadas para experiências. Todos os dados apresentados foram coletados usando células de pelo menos duas transfecções retrovirais independentes que produziram níveis semelhantes de

ERBB2

e

RAS

superexpressão.

Western Blot

Os lisados ​​celulares com quantidades iguais de proteínas (30 ug) foram separados em 8% SDS-PAGE, excepto para ERK e vantagens, para o qual os lisados ​​celulares foram separadas em 10% SDS-PAGE. As proteínas separadas foram então transferidas electroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 um (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido), que foi subsequentemente bloqueado a 4 ° C durante 1 hora com 5% de leite em pó magro em TBST (Tris 50 mM, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% de Tween 20 (w /v)). As manchas foram então incubadas com diluições apropriadas de anticorpos primários durante a noite a 4 ° C em TBST contendo 3% de leite em pó magro. Os anticorpos primários utilizados para análise de Western blot incluem anticorpos policlonais para H-ras (SC-520), E2F1 (SC-193), E2F2 (SC-633), ERK1 /2 (SC-135900), e P-ERK1 /2 ( SC-81492) a partir de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX); actina (A2066) a partir de Sigma (St. Louis, MO); ERBB2 (MS-730-PI) a partir de Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA); AKT (4691S), p-AKT (4060S), p38 (9212S), e p-p38 (9211S) a partir de Cell Signaling (Beverly, MA). Após lavagem de 10 minutos para três vezes em TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano a partir de Perkin Elmer (Boston, MA) quer contra o coelho (NEF 812001EA) ou contra rato (NEF 822001EA) com uma diluição de 1:3000 em TBST com leite 3%. Após três lavagens com TBST, durante 10 minutos cada, as membranas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 h com ECL da Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL), e exposto a um filme de raios-X para autorradiografia. Os anticorpos contra actina foram utilizados como controlos de carga. Quantificação dos níveis de proteína com base em intensidades de banda em Western blots foi realizada com o programa Image J (NIH, MD, EUA, https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Ferida cura ensaio

A capacidade de migração das células foi avaliada usando um ensaio de ferida cura como descrito anteriormente, com ligeiras modificações [43]. As células foram colocadas em placas em pratos de 35 mm e deixou-se crescer até atingir 100% de confluência. As células confluentes foram mantidos nas mesmas condições de cultura durante 48 horas para induzir a paragem densidade e para minimizar a proliferação celular. placas confluentes foram riscado para baixo três vezes com uma ponta de pipeta de 200 mL, a criação de esquerda, centro e direita arranhões /feridas que cruzaram com duas linhas horizontais anteriormente desenhadas como pontos de referência para quantificações. Após a coçar, as placas foram lavadas uma vez com meio para remover as células flutuantes, e foram substituídos com meio fresco. As células foram deixadas migrar através das feridas e as fotografias foram tiradas em diferentes pontos no tempo usando um microscópio de contraste de fase até que a ferida estava completamente fechada. Os pontos de tempo nos quais as imagens foram tiradas dependia da capacidade migratória das diferentes linhas celulares estudadas. Cada experimento foi realizado em triplicado e foi repetido pelo menos uma vez para validar os dados iniciais.

Motilidade Assay (Boyden Câmara Assay)

A motilidade das células, também foi avaliada utilizando cultura de células insere a partir BD Falcon (Franklin Lakes, NJ), e seguindo o protocolo previamente estabelecido com pequenas alterações [44]. As células que foram previamente cultivadas num meio de inanição com 0,2% de FBS durante 24 horas para minimizar a proliferação celular, foram ressuspendidas a uma concentração de 2 x 10

5 células /ml em meio contendo 0,2% de FBS. 1 × 10

5 células ou 500 ul de suspensões de células foram plaqueadas em cada pastilha, a qual foi previamente revestida com 3 ug /ml de solução de colagénio de cauda de rato a partir de BD (Bedford, MA) durante a noite à temperatura ambiente. A câmara inferior continha meio com FBS a 10% como um quimio-atractor. As células foram deixadas a passar através da membrana porosa e foram recolhidas a diferentes pontos de tempo que foram determinados empiricamente com base na capacidade migratória de cada linha de células. As células não migratórios foram então removidos da superfície das membranas utilizando cotonetes. As células que passaram através dos poros da membrana foram fixadas e coradas utilizando os núcleos Diff-Quick e kit de coloração citoplasma (Dade Behring, Newark, DE). células migratórias coradas foram contadas sob um microscópio. Cada experimento foi realizado em triplicado e foi repetido pelo menos uma vez para validar os dados iniciais.

Invasion Ensaio

A capacidade de invasão das células foi medida usando inserções de cultura de células de BD Falcon (Franklin Lakes, NJ), seguindo um protocolo previamente descrito com modificações de menor importância [45]. Como no ensaio de motilidade à base de Transwell descrito acima, as células foram mantidas em meio de privação com 0,2% de FBS durante 24 horas antes de semear para minimizar a proliferação celular. Inserções foram revestidas com 50 ug /ml de solução de colagénio de cauda de rato a partir de BD (Bedford, MA) durante 5 h à temperatura ambiente. Após a incubação, as inserções foram lavadas três vezes com meio isento de soro e foram deixados a secar a 37 ° C durante a noite. Uma vez secas, as membranas foram cobertas com 100 ul de solução de colagénio a uma concentração final de 1,3 mg /ml (para todas as células) ou com 100 uL de Matrigel (Cat. # 356231) a partir de BD (Bedford, MA) a uma concentração final de 300 ug /ml (para apenas as células Myc-CAP) e foram deixadas a solidificar a 37 ° C. As células foram ressuspensas a uma concentração de 2 x 10

5 células /ml em meio contendo 0,2% de FBS. 1 × 10

5 células ou 500 ul de suspensões de células foram plaqueadas em cada pastilha. O procedimento restante foi realizado como descrito acima na secção de ensaio de motilidade. Cada experiência foi efectuada em triplicado e foi repetida pelo menos uma vez para validar os dados iniciais.

avaliação da actividade β-galactosidase A senescência-associado

A actividade β-galactosidase endógena de células de cancro da próstata estava avaliada por coloração com X-Gal conforme previamente descrito [46]. As células cultivadas em pratos de 35 mm em triplicado foram fixadas durante três minutos à temperatura ambiente em PBS 1X, contendo 2% de formaldeído e 0,2% de glutaraldeído. Após duas lavagens consecutivas com 1X PBS, as células foram incubadas durante 16 h a 37 ° C com solução de coloração (2 ml por placa) que consiste de X-gal a uma concentração final de 1 mg /ml em dimetilf ormamida, ácido cítrico 40 mM /tampão fosfato de sódio pH 5,7 (ácido cítrico 0,1 M /fosfato de sódio 0,2 M), ferrocianeto de potássio 5 mM, ferricianeto de potássio 5 mM, cloreto de sódio 150 mM e cloreto de magnésio 2 mM. Fotos foram tiradas sob um microscópio de contraste de fase. As células positivas e negativas foram contadas a partir de pelo menos três campos diferentes.

celular Growth Rate Assessment

células cancerosas da próstata foram semeadas em placas de 6 poços em triplicado. A densidade da sementeira inicial foi determinada empiricamente para nos permitir contar, pelo menos, quatro pontos de tempo antes que as células atingiram 100% de confluência. Assim, as células foram semeadas a seguinte: 70000 células para PC3, 35000 células para LnCaP, 120000 células para DU145 e 70000 células para Myc-tampão. Doze horas após a sementeira, as células foram contadas utilizando um hemocitómetro (Hausser Scientific, Horsham, PA) para ser normalizada, tal como o número de células de sementeira correspondente e para ser utilizado como o primeiro ponto de tempo. As células foram então contadas a cada 12 horas, para a PC3 e linhas celulares Myc-tampão ou a cada 24 horas para linhas celulares DU145 e LNCaP. As taxas de crescimento foram estimados pelo cálculo e comparando a inclinação linear para cada curva de crescimento.

Análise Estatística

Os valores são apresentados como média ± SD. A significância estatística foi determinada por Student

t

-teste com um limiar de significância

P Art 0,05. Em todas as figuras, significâncias estatísticas foram indicados como

*

P Art 0,05, **

P Art 0,01 e ***

P Art 0,001.

Resultados

superexpressão do

ERBB2

e

RAS

oncogenes no câncer de próstata Linhas Celulares por retroviral Infecção

Para superexpressam

ERBB2

e

RAS

oncogenes em linhas celulares de cancro da próstata, nós transfectadas células cancerosas da próstata com

pBabe-Puromycin-

(

PBP-

) retrovírus com base superexpressão uma forma activada do

ERBB2

(

PBP-ErbB2

) ou uma forma mutante do

H-RAS

(

PBP-RAS

). Como mostrado na Figura 1, a análise de transferência de Western indicou que a transfecção de células com

PBP-RAS

retrovírus levou à média até-regulamentos de

RAS

que varia de 1,5 vezes (para LnCaP) a 4,7 vezes (por PC3), e que a transfecção de células com

PBP-ErbB2

retrovírus levou à média até-regulamentos de

ERBB2

que varia de 2,5 vezes (para DU145) a 4,0 vezes (para Myc- PAC) Curiosamente, embora

RAS

superexpressão não alterou os níveis de proteína de ErbB2,

ERBB2

superexpressão elevados níveis de proteína de RAS (2,9 vezes) especificamente nas células Myc-tampão (Figura 1), que sobre-expressa o humano

c-MYC

oncogene [37].

ErbB2 e os níveis de proteína RAS foram avaliadas por Western blot usando anticorpos contra H-RAS ou ERBB2 para lisados ​​totais de células preparadas a partir de câncer de próstata As células transfectadas com retrovírus de controle (

PBP

), ou retrovírus superexpressão

PBP Restaurant –

H-RAS

(

RAS

) ou

PBP -ERBB2

(

ERBB2

). Borrões com anticorpos contra actina serviram como controlos de carga. Os números em branco representam mudanças dobra em ERBB2 ou níveis de proteína RAS em

ERBB2 Restaurant – ou

RAS

-overexpressing células relativos àqueles em seus

PBP

células correspondentes de controle após a actina normalização.

superexpressão do

ERBB2

leva a moderar aumentos no crescimento celular em LnCaP, DU145 e células PC3

Considerando que a ativação do

ERBB2

/

RAS

via em células de câncer de próstata sinalização podem afetar suas taxas de crescimento, o que poderia influenciar a análise para avaliar o seu potencial metastático, foi realizado um ensaio de curva de crescimento, utilizando células assíncronas. Como mostrado na Figura 2,

ERBB2

superexpressão conduziu a aumentos moderados nas taxas de crescimento de todos os três linhas celulares humanas de cancro da próstata: uma média de aumento de 43% para células de LNCaP, aumento de 33% para as células DU145, e aumento de 25% para as células PC3. No entanto, a sobre-expressão de

ERBB2

não afetou a taxa de crescimento da linha de células de câncer de próstata murino, Myc-tampão. Em contraste,

RAS

superexpressão não ter efeitos significativos sobre as taxas de crescimento de qualquer uma das quatro linhas de células (Figura 2).

taxas de crescimento celular foram avaliadas por celular contando a cada 12 horas ou 24 horas para várias células de câncer de próstata que foram transfectadas com retrovírus de controle (

PBP

), ou retrovírus superexpressão quer

PBP-H-RAS

(

RAS

) ou

PBP-ErbB2

(

ERBB2

).

superexpressão do

RAS

Reduz Cell Migration Preços de LNCaP e DU145 linhas celulares

os efeitos do

ERBB2

e

RAS

superexpressão sobre os potenciais metastáticos de LnCaP, DU145, PC3, e linhas celulares de cancro da próstata Myc-CAP foram avaliados primeiramente através da realização de uma ferida ensaio de cura. Para superar os potenciais efeitos do aumento da proliferação celular em

ERBB2 células -overexpressing

(Figura 2) sobre a ferida ensaio de cura, que promoveu a parada densidade celular, mantendo placas confluentes durante 48 horas antes de fazer arranhões /feridas. Como mostrado na Figura 3, a sobre-expressão de

ERBB2

e

RAS

mostrou vários efeitos sobre as três linhas de células de cancro da próstata humana. Especificamente, enquanto a superexpressão de

ERBB2

não teve impacto significativo sobre as taxas de migração de todas as três linhas de células de câncer de próstata humanas, superexpressão de

RAS

diminuiu significativamente as taxas de migração de células LnCaP e DU145 linhas. Em comparação com as linhas de células de câncer de próstata humanas, a linha de células de cancro da próstata murino Myc-Cap pareciam ter menores taxas de migração, como evidenciado pelo fato de que eles não conseguiram fechar completamente a ferida antes de começarem a crescer novamente em torno do ponto de tempo 32 horas (dados não mostrados), independentemente do estado de

ERBB2 Restaurant – ou

RAS

-overexpression (Figura 3). No entanto,

ERBB2 Network -. Ou

RAS

-overexpressing Myc-Cap células teve um aumento moderado, mas estatisticamente insignificante em taxas de migração em comparação com células de controlo (Figura 3)

taxas de migração celular foram estimados por uma ferida ensaio de cura para cancro da próstata células que foram transfectadas quer com retrovírus de controle (

PBP

), ou retrovírus com superexpressão

PBP Restaurant –

H-RAS

(

RAS

) ou

PBP-ErbB2

(

ERBB2

). painéis esquerdos mostrou percentuais de feridas permaneceram em diferentes pontos de tempo. As percentagens de feridas foram estimadas com base na média de 12 medições em cada placa reflecte medições de quatro secções uniformemente distribuído em cada uma das três feridas /arranhões em cada placa. Os dados foram apresentados como médias ± DP de três repetições. painéis da direita mostrou imagens representativas tomadas em momentos diferentes. Todas as imagens foram tiradas na mesma escala com uma barra de escala de 200? M apresentado na primeira imagem.

ERBB2

superexpressão célula aumenta motilidades do DU145 andrógeno-insensitive e células PC3 e

RAS

superexpressão aumenta a motilidade celular das células Myc-Cap

Para complementar a cicatrização de feridas dados apresentados acima, também avaliou os efeitos da superexpressão de

ERBB2

e

RAS sobre a motilidade celular das linhas celulares de cancro da próstata por um ensaio de motilidade celular à base de Transwell usando inserções membrana porosa em transwells. Enquanto a cicatrização de feridas ensaio mede a motilidade celular lateral, resultou da ruptura das interacções célula-célula [47], câmaras de Boyden Transwell ensaio mede a migração quimio-atraente, que ao contrário do ensaio de cicatrização da ferida, é independente de quebras na junção célula-célula [48]. Portanto, estes dois ensaios são complementares e são muitas vezes utilizados em paralelo para obter insights biológicos em diferentes tipos de migração de células. Para minimizar o impacto das taxas de crescimento de células diferenciadas do

ERBB2

superexpressão no ensaio de motilidade, nós induzidas parada do ciclo celular através da manutenção de células em condições de soro-jejum de 24 horas antes da realização do ensaio de motilidade. Como mostrado na Figura 4, a sobre-expressão de

ERBB2

aumentou significativamente motilidades celulares dos mais duas metastático, linhas celulares de androgénio-insensível, células DU145 e PC3 células, com um aumento de 30% e um aumento de 6 vezes, respectivamente . Em contraste,

ERBB2

superexpressão reduziu significativamente os possíveis rearranjos das duas linhas, humildes ou não-metastático andrógeno-sensíveis cancro da próstata celulares, LnCaP e Myc-tampão. Além disso, enquanto

RAS

superexpressão significativamente reduzidos os possíveis rearranjos de células LNCaP e células PC3, aumentou substancialmente a mobilidade das células Myc-PAC, que superexpressam o

c-MYC

oncogene.

motilidades celulares foram avaliadas por um ensaio de motilidade baseada transpoço de células cancerosas da próstata que foram transfectadas quer com retrovírus de controle (

PBP

), ou retrovírus com superexpressão

PBP Restaurant –

H-RAS

(

RAS

) ou

PBP-ErbB2

(

ERBB2

). Cada gráfico de barras que mostram os números relativos de células que passaram por as inserções Transwell /membranas, que foram coradas e contadas sob um microscópio para, pelo menos, 10 campos por pastilha. Os dados foram apresentados como médias ± DP de três repetições. Imagens representativas tomadas num dado ponto de tempo foram mostrado por baixo de cada gráfico de barras. Todas as imagens foram tiradas na mesma escala com uma barra de escala de 200? M apresentado na primeira imagem.

ERBB2

superexpressão Promove Invasividade celular no DU145 andrógeno-insensitive e células PC3

Os potenciais metastáticos de

ERBB2 Network – ou

RAS

-overexpression em várias linhas celulares de cancro da próstata foram ainda avaliadas por avaliar a sua capacidade de invasão relativa por um ensaio de invasão à base transpoço usando insertos celulares revestido com uma matriz de colagénio. Este ensaio de invasão permite que as células passam por uma matriz de colagénio de 100 um de espessura a partir de uma baixa de soro contendo meio de um ambiente enriquecido com soro. Como mostrado na Figura 5, a capacidade de invasão das células DU145-andrógenos e insensível células PC3 foi substancialmente aumentada na presença de

ERBB2

sobre-expressão, mas não na presença de

RAS

superexpressão. Estes dados são consistentes com os dados do ensaio de motilidade à base de Transwell que mostram que a sobre-expressão de

ERBB2

em células DU145 e PC3 células levaram a um aumento da motilidade celular (Figura 4). Consistente com o seu baixo ou nenhum potencial metastático, nem as células nem células LNCaP Myc-Cap apareceu para ser capaz de penetrar na matriz de colagénio, mesmo após 96 horas de incubação (dados não apresentados). Mais importante, a sobre-expressão de

ERBB2

ou

RAS

foi insuficiente para permitir a utilização de células-Myc tampa ou células LNCaP de passar através da matriz de colagénio (dados não mostrados).

celular invasividade foi avaliada por um ensaio de invasão à base de Transwell de células de cancro da próstata que foram transfectadas, quer com retrovírus de controlo (

PBP

), ou retrovírus que sobre-expressam

PBP

–

H-ras

(

RAS

) ou

PBP-ErbB2

(

ERBB2

). Cada gráfico de barras que mostram os números de células que tenham passado através da matriz de colagénio, quer 72 horas (para as células PC3) ou 96 horas (para as células DU145) após o plaqueamento. inserções Transwell foram coradas e células invasoras foram contadas durante todo o inserções. Os dados foram apresentados como médias ± DP de três repetições. Imagens representativas foram mostrados abaixo de cada gráfico de barras. Todas as imagens foram tiradas na mesma escala com uma barra de escala de 200? M apresentado na primeira imagem.

Uma vez que a sobre-expressão de

RAS

aumento da motilidade celular especificamente nas Myc-tampão células (Figura 4), foi realizado um ensaio de invasão à base de Transwell em células Myc-CAP usando Matrigel para substituir o colágeno. Em comparação com a matriz de colagénio, a matriz Matrigel é uma membrana basal reconstituída preparada a partir de um sarcoma de rato que imita melhor o ambiente extracelular de um cancro. Tal como no caso da matriz de colagénio, não celular foi visto a passar através da matriz Matrigel, quer nas células de controlo ou nas

RAS

-overexpressing células (dados não apresentados).

níveis moderados de

RAS

superexpressão não promove Cellular senescência em células cancerosas da próstata

estudos anteriores demonstraram que a expressão prolongada de oncogênico

RAS

em células de fibroblastos primários de roedores humana e

in vitro

[49] ou altos níveis de sobre-expressão de

RAS oncognic

em células epiteliais mamárias

in vivo

[50] levou ao aumento da senescência celular. Desde

RAS

-overexpressing células LNCaP e células DU145 mostrou capacidades reduzidas para fechar uma ferida provocada (Figura 3), e desde

RAS

-overexpressing células LNCaP e células PC3 mostraram diminuição da motilidade de células no ensaio de mobilidade Transwell (Figura 4), procurou-se determinar se a diminuição da mobilidade nestes

RAS

-overexpressing células cancerosas humanas da próstata pode ser explicado por um aumento potencial na senescência celular nessas células. Para este fim, usamos

in vitro

X-gal coloração para avaliar as atividades β-galactosidase associada à senescência, um biomarcador comumente usado para a senescência celular [51]. Como mostrado na Figura 6A e Figura 6B, níveis moderados de

RAS

sobreexpressão no nosso meio experimental (Figura 1) não aumentou significativamente a senescência celular em LNCaP, PC3, DU145 e células, como evidenciado pelo facto de

RAS

-overexpressing células apresentaram percentuais semelhantes de células X-gal-positivos como os seus em> PBP

células correspondentes

RAS

superexpressão (ou seja 13,6 vezes; Figura 6C, “

Oi-Ras”

) mostraram um aumento significativo na percentagem de X-gal -positivas células do que qualquer das células PC3 infectadas com o vector de controlo (Figura 6C, “

PBP”

) ou as células PC3 com uma expressão moderada de

RAS

(ou seja, 4,2 vezes; Figura 6C , “

RAS”

) (Figura 6A e 6B). O aumento da percentagem de células PC3 positivos X-gal com um maior nível de

RAS

superexpressão é compatível tanto com sua morfologia senescência-like (isto é grande e plana) (Figura 6A) e com um relatório anterior que níveis elevados de

Ras

superexpressão levou ao aumento da senescência celular [50]. Tomados em conjunto, os nossos dados sugerem que a incapacidade de RAS para promover a motilidade celular ou invasão em linhas celulares de cancro da próstata humano não é devido a senescência celular prematura.

actividades (A) β-galactosidase A senescência-associados foram avaliadas pela coloração X-gal para as linhas de células de câncer de próstata humanas transfectadas tanto com retrovírus de controle (

PBP

) ou retrovírus superexpressão

PBP-H-RAS

(

RAS

). células PC3 que expressam um nível extremamente elevado de

RAS

(

Hi-RAS) foram incluídos para comparações. células de fibroblastos de pele humana BJ senescentes foram usadas como controlo positivo para a coloração com X-gal. Imagens representativas foram mostrados com células representativas-X-gal positiva que está sendo marcado com setas vermelhas. Inserções em cada imagem mostrou ampliada, células representativas-X-gal positivo. (B) quantificações de dados coletados a partir do painel (A). Os dados foram apresentados como médias ± DP de três repetições.