Abstract

Purpose

Exosomal microRNAs (miRNAs) têm atraído grande interesse como potenciais biomarcadores de diagnóstico de câncer. O objetivo deste estudo foi caracterizar os perfis de miRNA de exossomos soro e para identificar aqueles que são alterados no cancro colorectal (CRC). Para avaliar o seu uso como biomarcadores de diagnóstico, a relação entre os níveis de miRNA exosomal específicos e alterações patológicas de pacientes, incluindo estágio da doença e ressecção do tumor, foi examinada.

Experimental Design by

Microarray análise dos miRNAs no foram realizadas fracções enriquecidas com exossoma de amostras de soro de 88 pacientes de CRC primárias e 11 controlos saudáveis. Os níveis de miARN no meio de cultura de cinco linhas celulares de cancro do cólon de expressão também foram comparados com aqueles no meio de cultura de uma linha de células derivadas de cólon normal. Os perfis de expressão dos miRNAs que foram diferencialmente expressos entre CRC e conjuntos de amostras de controle foram verificados usando 29 amostras pareadas de pacientes de ressecção pós-tumorais. As sensibilidades dos miRNAs selecionados como biomarcadores da CRC foram avaliados e comparados com os de marcadores tumorais conhecidos (CA19-9 e CEA), utilizando um receptor operando análise característica. Os níveis de miRNAs selecionados expressão também foram validados por quantitativo em tempo real RT-PCR análise de um conjunto independente de 13 pacientes de CRC.

Resultados

Os níveis séricos de exosomal sete miRNAs (let- 7a, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 e miR-23a) foram significativamente maiores em pacientes com CCR primário, mesmo aqueles com doença em estágio inicial, do que nos controles saudáveis, e foram significativamente regulada para baixo após a ressecção cirúrgica de tumores. Estes miARNs também foram secretados em níveis significativamente mais elevados de linhas celulares de cancro do cólon do que por uma linha de células derivadas de cólon normal. As altas sensibilidades dos sete miRNAs exosomal selecionados foram confirmados por um receptor operando análise característica.

Conclusão

assinaturas

Exosomal miRNA parecem espelhar alterações patológicas de pacientes com CCR e vários miRNAs são promissores biomarcadores para a não diagnóstico -invasive da doença

Citation:. Ogata-Kawata H, Izumiya M, Kurioka D, Honma Y, Yamada Y, Furuta K, et al. (2014) Circulação Exosomal microRNAs como biomarcadores de cancro do cólon. PLoS ONE 9 (4): e92921. doi: 10.1371 /journal.pone.0092921

editor: Tadayuki Akagi, Universidade Kanazawa, Japão

Recebido: 13 de novembro de 2013; Aceito: 26 de fevereiro de 2014; Publicação: 04 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ogata-Kawata et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Subvencionado pela pesquisa avançada para produtos médicos Programa Mineração do Instituto Nacional de Biomedical Inovação (Nibio) (08-02), https://www.nibio.go.jp; Conceda-in-Aids do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar (13802015), https://www.mhlw.go.jp/; Conceda-in-Aids do Ministério da Educação, Cultura, Esportes Tecnologia do Japão (13314780), https://www.jsps.go.jp/; Cancro do Centro Nacional de Pesquisa e Fundo de Desenvolvimento (23-B-08), https://www.ncc.go.jp. National Cancer Center Biobank é suportada pelo Cancer Research Center, Nacional e Fundo de Desenvolvimento. . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: Hideki Ohta, Hiroyuki Okamoto e Hikaru Sonoda, são funcionários da Shionogi Co., Ltd. Shionogi Co., Ltd. tem uma licença exclusiva para vários miRNAs apresentados neste trabalho. Shionogi Co., Ltd. apresentou um pedido de patente (WO2011 /040525) para o desenvolvimento destes miRNAs como marcadores de diagnóstico. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. métodos sistemáticos para diagnosticar condições patológicas pode contribuir para uma elevada taxa de detecção de pacientes nas fases iniciais de CRC, levando a uma redução das taxas de mortalidade. Implementação do exame de sangue oculto nas fezes e sigmoidoscopia flexível como métodos de rastreio tem reduzido a mortalidade CRC [2], [3]. No entanto, estas técnicas têm limitações inerentes; a sensibilidade de detecção do teste de sangue oculto nas fezes é bastante baixa e sigmoidoscopia flexível é invasivo e desconfortável para os pacientes. Carboidratos antigénio 19-9 (CA19-9) e antigénio carcinoembrionário (CEA) têm sido amplamente utilizados como marcadores de tumores para detecção de muitos tipos de cancro, incluindo o cólon, fígado, pâncreas e estômago. No entanto, a sensibilidade destes marcadores para a detecção de CRC é baixo, especialmente nas fases iniciais da doença [4]. Por conseguinte, existe uma necessidade para o desenvolvimento de marcadores de diagnóstico específicos de CRC para o rastreio rápido, não invasivo e altamente sensível de pacientes.

MicroRNAs (miARNs) são endógenas, pequena, RNAs não codificantes e os seus a expressão específica de tecido contribui para o controle preciso de vários processos biológicos [5], [6]. Disfunção de miARNs é encontrado em vários tipos de cancro e os perfis de expressão endógena de miARN pode ser utilizado para classificar os tipos de cancro [7], [8]. Vários miARNs mostrando níveis elevados de expressão em tecidos de cancro têm sido relatados como marcadores de diagnóstico ou de prognóstico adequados [9]. Estudos recentes demonstraram que miARNs são secretadas a partir de várias células, incluindo células de cancro, nos fluidos corporais, tais como sangue, urina, leite materno e saliva,

através

exossomas [10] – [12]. Os exossomas são pequenas vesículas de membrana de cerca de 100 nm, que incorporam proteínas, lípidos, mRNAs, e miARNs, dependendo da origem das células secretoras de [13], [14]. Portanto, miARNs exosomal em fluidos corporais podem ser biomarcadores de diagnóstico úteis para a detecção de cancro [10], [15]. No entanto, existe actualmente uma falta de informação sobre a relação entre exosomal perfis de miRNA no sangue e da condição patológica de pacientes com câncer.

Aqui, realizamos perfis baseados em microarray de miRNAs exosomal em soros de controles saudáveis ​​(HCs ) e pacientes de CRC primárias. Os perfis de miRNA em exossomos de linhas celulares de cancro do cólon, também foram examinados para identificar biomarcadores candidatos secretadas por células cancerígenas do cólon. Os exosomal miRNA assinaturas diferiu entre pacientes e controles CRC. Ao comparar os perfis de miRNA de amostras clínicas e linhas celulares, oito miRNAs (deixe-7A, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 e miR-23a) que foram significativamente elevados em exossomas de soro de pacientes de CRC primárias e foram sub-regulada após a cirurgia foram identificados. elevação CRC-associado de sete destes miARNs exosomal foi validado num conjunto de amostra independente utilizando quantitativo em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR). Tomados em conjunto, os resultados aqui apresentados demonstram que exosomal miRNA assinaturas reflectir as alterações patológicas em pacientes com CCR e são aplicáveis ​​para o desenvolvimento de estratégias de diagnóstico para a detecção de CRCs primários.

Materiais e Métodos

As amostras clínicas

amostras de soro de 88 pacientes com CCR (com idade entre 35 a 65 anos) com um tumor primário foram fornecidos pelo National Cancer Center Hospital Biobank, Japão (Tóquio, Japão), de 2003 a 2004. as amostras de soro foram também coletadas de 29 dos pacientes após a ressecção cirúrgica do tumor primário de 2003 a 2004. para a validação por qRT-PCR, amostras de soro de 13 pacientes CRC diferentes (com idade entre 45 a 70 anos) com um tumor primário foram fornecidos pelo Cancer Center Hospital Biobank Nacional , Japão em 2009. Os espécimes cirúrgicos de câncer de cólon primário e as regiões circundantes não-cancerosas foram obtidas de pacientes tratados no Hospital Universitário de Teikyo (Tóquio, Japão) [16]. Os soros de 19 indivíduos (com idade entre 35 a 65 anos) que foram submetidos a um rastreio físico completo no NTT Medical Center Tóquio (Japão) em 2011 foram utilizados como amostras de HC. As amostras de soro foram armazenadas a -20 ° C até o uso.

Ética Declaração

aprovações Institutional Review Board para uso das amostras foram obtidas a NTT Medical Center, da Universidade de Tóquio, e Nacional do Câncer Centro. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes incluídos no estudo.

As linhas celulares

Todas as linhas de células utilizadas neste estudo foram obtidos a partir da American Tissue Culture Collection. células fetais humanos normais derivados do cólon FHC foram cultivadas em meio DMEM-F12 contendo HEPES 25 mM, 10 ng /ml de toxina da cólera, 5 ug /ml de insulina, 5 ug /ml de transferrina, /ml de hidrocortisona, e soro de bovino fetal a 10% a 100 ng [17]. A HCT116, HT-29, linhas celulares de cancro de cólon humano RKO, SW48, SW480 e foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino [18] – [20]. O meio de cultura foi recolhido após o crescimento das células durante 48 h.

Preparação de fracções enriquecidas em exossoma

fracções de exossoma foram preparados por um método de centrifugação-ultracentrifugação passo a passo, como descrito anteriormente com pequenas modificações [13]. Resumidamente, o meio de cultura de linhas celulares de cancro de cólon foi centrifugado a 500 × g durante 5 min para remover os restos celulares, e em seguida centrifugou-se a 16500 × g durante 20 min, utilizando um rotor JA-30.50 (Beckmann). O sobrenadante clarificado foi passada através de um filtro de 0,20 ^ m e, em seguida ultracentrifugado a 120000 × g durante 70 min, utilizando um rotor TLA-110 (Beckmann). As peletes foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois ressuspensa em 250 ul de PBS como fracções enriquecidas com exossoma. As amostras de soro (750 ul) a partir de pacientes de CRC e HCs foram diluídas oito vezes com PBS e as fracções enriquecidas com exossoma foram preparados como descrito acima. Enriquecimento do CD81 exossomo marcador nas fracções preparados foi confirmada por análise de imunotransferência (ver Métodos S1 e S1 Figura).

Preparação de ARN total exosomal

A fracção exossomo preparado a partir de soro foi misturada com 750 ul de reagente de Trizol-LS (Invitrogen) e a fase aquosa foi recolhido por adição de clorofórmio. Após a adição de etanol à fase aquosa, o RNA total foi purificado utilizando RNeasy Mini colunas de centrifugação (Qiagen). A amostra de ARN foi seca usando um concentrador centrífugo Speed-Vac (Savant) e em seguida, dissolvido em 10 ul de água isenta de nuclease. A concentração de ARN foi determinada utilizando um espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) e a quanti-iT RiboGreen RNA Assay Kit (Invitrogen). A qualidade do ARN foi analisada usando um Agilent Bioanalyzer 2100 e de ARN pequenas lascas (Agilent Technologies).

miARN microarray

ARN total a partir das fracções de exossoma foram marcados com pCp-Cy3 usando o Agilent miARN reagente de marcação, e, em seguida, hibridados com um oligonucleótido miARN microarray humano (8 x 15 K, versão 3.0; Agilent Technologies), de acordo com as instruções do fabricante. Após a hibridização, a matriz foi lavada com expressão Gene kit de Tampão de Lavagem (Agilent Technologies) e digitalizados utilizando um scanner de DNA microarray da Agilent. Após a conversão numérica dos dados brutos usando recurso de extração de Software (versão 10.7; Agilent Technologies), os dados transformados foram analisados ​​utilizando software GeneSpring GX (versão 12.5; Biology Digital). As intensidades dos sinais das manchas no microarray foram normalizadas para a intensidade total do sinal da matriz e são apresentadas como percentagens. Os dados de microarranjos de miRNA foram depositadas no banco de dados Omnibus Gene Expression NCBI com GSE40247 código de adesão.

qRT-PCR

miRNAs Exosomal foram transcritas inversa utilizando MultiScribe transcriptase reversa (Life Technologies) e miRNA- iniciadores específicos. Os miARNs foram quantificados por PCR em tempo real TaqMan utilizando kits microRNA (Life Technologies) e o Real-Time PCR System 7300 (Applied Biosystems), de acordo com um protocolo padrão [21]. O limiar de ciclo comparativo (Ct) foi utilizado para avaliar o nível de detecção relativo de cada miARN na amostra, a qual foi determinada utilizando o 2

método -ΔΔCT [22]. Em experimentos de qRT-PCR, o miR-451 foi usado como um padrão interno, pois foi detectável em todas as amostras e as suas intensidades normalizadas não foram significativamente diferentes entre os exossomas soro HC e CRC (

P

0,05).

a análise estatística

a Frente e verso emparelhado de Student

t

-teste ou de Welch

t

-test foi utilizado para determinar a significância estatística das diferenças de microarray intensidades de sinal. análise de agrupamento hierárquico do conjunto de dados de todos os perfis de miRNA foi realizada utilizando o método de Ward. A curva receiver operating characteristic (ROC) e a área sob a curva foram analisadas para avaliar a possibilidade de utilizar uma proporção de miARN seleccionado como um marcador de diagnóstico para CRC. Os coeficientes de correlação de exosomal perfis de miRNA entre linhas celulares e dos níveis de CA19-9, CEA e miRNAs exosomal no soro do paciente como candidatos marcadores CRC foram determinados por análise multivariada. Estas análises foram realizadas utilizando software JMP9. O teste de Jonckheere-Terpstra (software SPSS, versão 18) foi utilizado para determinar a correlação entre CRC tumor /node /metástase fases (TNM) e níveis de miRNA.

Resultados

Identificação de miRNAs exosomal que são elevados no CRC por análise de microarray

rastreio baseado em microarray foi utilizado para detectar níveis de miARN em fracções exosomal de amostras de soro de pacientes de CRC e HC, bem como meios de cultura de uma linha de células derivadas de cólon normal e cinco linhas celulares de cancro de cólon humano diferentes. A Figura 1 mostra uma visão geral da estratégia de rastreio utilizada. As fracções enriquecidas com exossoma foram preparados utilizando um método de centrifugação-ultracentrifugação passo a passo, como mostrado na Figura S1A. Enriquecimento de pequeno RNA e CD81 nas fracções de exossoma foi confirmada por electroforese capilar e análise de imunotransferência, respectivamente (Figuras S1B-D). Uma análise e correlação multivariada parcelas de dados microarray indicada a detecção reprodutível de miRNAs exosomal em experimentos independentes e correlações entre os perfis de miRNA das diferentes linhas celulares de cancro (Figura s1e e Tabela S1). Os perfis exosomal miRNA das cinco linhas celulares de cancro do cólon e a linha de células FHC eram distintos a partir dos perfis de miRNA celular endógenos (Figura S1F).

Os perfis de miRNA das frações exossomo de amostras de soro de 88 pacientes com CCR primários (incluindo estágios clínicos TNM I, II, III e IV) e 11 HCs foram determinados utilizando microarrays. As características dos pacientes e os miARNs exosomal detectadas em cada grupo são apresentados na Tabela 1. Um total de 164 miARNs foram detectadas em todas as amostras de soro examinadas (Figura S2a) e 69 miARNs foram expressos em níveis significativamente elevados em pacientes que HCS (CRC

P Art 0,05) (Figuras S2B e S2C, Tabela S2). A análise dos perfis exosomal miARN de meios de cultura de cinco linhas celulares de cancro diferente do cólon e células de FHC normais epiteliais do cólon revelou que 52 miARNs foram secretados em níveis significativamente mais elevados a partir de todas as linhas celulares de cancro de cinco cólon do que a partir das células FHC (Figuras S3A e S3B, tabela S3).

Uma comparação dos 69 miRNAs up-regulados de pacientes com CRC e os 52 miRNAs-regulada a partir das linhas de células de câncer de cólon revelou que 16 miRNAs estavam presentes em ambos os conjuntos (Figura 2 ): deixe-7a, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-1268, miR-1290, miR-1308, miR-150, miR-181b, miR-181d, miR-1915, miR- 21, miR-223, miR-23a, miR-483-5p e miR-638. Os níveis de expressão endógenos destes miARNs foram então medida nas linhas celulares do cancro do cólon e FHC, bem como o cancro do cólon e combinados tecidos não-cancerosas de quatro pacientes adicionais. Com a excepção de miR-181d, que foi significativamente regulada para cima em ambos os tecidos e células cancerosas nenhum destes miARNs foram expressos em tecidos de cancro (Figura S3C) ou linhas celulares de cancro (

P

0,05 ) (Figura S3D) em níveis significativamente mais elevados do que os tecidos não cancerosos correspondentes ou a linha de células de CSF, respectivamente. Estes resultados indicam que a secreção de miARNs não é dependente de seus níveis de expressão celular e sugerem que a sobre-regulada miARNs endógenos em células cancerosas não são necessariamente substratos para a secreção mediada por exossoma. células cancerígenas do cólon parecem secretar um subconjunto de miRNAs em espaços extracelulares através de exossomos.

exosomal Serum níveis de miRNA em 11 HCs (azul) e 88 pacientes de CRC (vermelho) em diferentes estádios TNM (I a IV). As intensidades de sinal foram normalizadas para a intensidade total do sinal da micromatriz. As linhas horizontais indicam a intensidade do sinal normalizado média para cada grupo. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas por Welch do

t

-teste.

Relação entre os níveis séricos exosomal de 16 miRNAs e os estágios clínicos de cancro do cólon

Em seguida, analisou-se a relação entre os 16 miARNs geralmente regulada para cima e estágios clínicos do CRC, separando os pacientes de CRC em função da sua fase TNM. Para cada miRNA, nenhuma correlação significativa (

P Art 0,05) entre o nível exosomal eo estágio clínico da doença foi identificado por um teste de Jonckheere-Terpstra (Figura S4)

Down. -regulação de oito miARNs após a remoção de tumores primários

para determinar se os 16 miARNs geralmente sobre-regulada originado a partir de células cancerosas, análises de microarray foram usadas para determinar os níveis destes miARNs em fracções enriquecidas com soro de exossoma combinados As amostras recolhidas após a ressecção cirúrgica dos tumores primários (n = 29 doentes). Os níveis de expressão de oito dos miARNs foram significativamente reduzidos (

P

0,05) após a remoção de tumores primários (Figura 3 e Tabela S4): let-7a, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 e miR-23a. Estes resultados sugerem que estes oito miARN pode ser derivado de exossomas secretadas por células de cancro e que os seus níveis pode reflectir o estado do cancro do cólon de pacientes.

(A) do gráfico de dispersão 16 geralmente sobre-regulada miARNs exosomal soro em pacientes com CCR (n = 29) antes (Pré) e após (Post) a remoção cirúrgica de tumores. O conjunto de amostras fase incluiu I (n = 6), fase II (n = 6), IIIa estágio (n = 5), fase III-B (n = 9), e estágio IV (n = 4) pacientes. Os dados representam as intensidades de sinal normalizado Média (%). Os pontos vermelhos indicam os oito miRNAs que foram significativamente regulada para baixo após a ressecção do tumor: deixe-7a, miR-1224-5p, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, e miR- 23a. (B) A variação individual nos níveis exossomo soro dos oito miRNAs regulados negativamente em pacientes com CCR (n = 29) antes (Pré) e após (Post) a remoção cirúrgica de tumores. diferenças estatisticamente significativas entre os valores pré médios e os valores médios de Post foram determinadas por pareado de Student

t

-Testes.

Potenciais miRNAs exossomo soro para aplicação biomarcadores como diagnóstico

Para estimar seu poder como potenciais marcadores de diagnóstico, os valores de corte dos oito miRNAs que foram regulados positivamente em cancro do cólon e regulada para baixo após a ressecção do tumor foram analisados ​​por meio de uma curva ROC (Figura 4). Os verdadeiros taxas positivas de miR-1246 e miR-23a para a identificação dos 88 pacientes com CCR foram 95,5% e 92,0%, respectivamente; estes miARNs também teve baixas taxas de falsos positivos para a identificação dos 11 HCS (9% e 0%, respectivamente). Os verdadeiros taxas positivas de miR-21, miR-150, deixe-7a, miR-223, miR-1224-5p e miR-1229 para a identificação do CRC eram 61,4%, 55,7%, 50,0%, 46,6%, 31,8% , e 22,7%, respectivamente; as taxas de falsos positivos destes miARNs variou de 0% a 9% (Figura 4). Note-se que uma utilização combinada de 8 miARNs não mostraram poder de diagnóstico mais do que aqueles em miRs-1246 e -23 (dados não mostrados). Por comparação, as sensibilidades de CEA e CA19-9, que são conhecidos biomarcadores de CRC, eram 30,7% e 16,0%, respectivamente. Uma análise multivariada indicou não haver correlação entre os níveis dos oito miARNs seleccionados em exossomas séricos e os níveis de soro de CEA e CA19-9 (Tabela S5). Portanto, nós re-avaliou os níveis dos oito miRNAs em exossomos soro por qRT-PCR expressão análises de um conjunto de amostras adicional que incluía oito HCs, sete pacientes em Estágio I CRC, e seis da fase II pacientes com CCR (Tabela S6). Os níveis de sete dos miARNs, nomeadamente let-7a, miR-1229, miR-1246, o miR-150, miR-21, o miR-223 e miR-23a, foram significativamente maiores nos exossomas de soro de pacientes de CRC do que aqueles a partir de HCS (

P

0,05) (Figura 5). aumentos estatisticamente significativos nos níveis destes miRNAs expressão foram ainda observados para a fase inicial (TNM fase I) amostras de CRC (Figura S5). Estes resultados sugerem que miARNs exosomal soro podem ser úteis para a detecção precoce de CRCs primárias.

As intensidades de sinal dos miARNs estão apresentados como percentagens do total de intensidade de sinal. Os valores de corte dos oito miRNAs que foram regulados positivamente em cancro do cólon e regulada para baixo após a ressecção do tumor foram analisados ​​por meio de uma curva ROC. caixas pretas indicam os pacientes sobre o valor de corte dos biomarcadores ou níveis de miRNA. As intensidades normalizadas de miRNAs indetectáveis ​​em exossomos de soro foram calculados como 0.

parcelas Box-e-suiça dos níveis dos oito miRNAs selecionados expressão em um conjunto independente de HCs (n = 8) e CRC pacientes com tumor primário (n = 13). Diferenças estatisticamente significativas entre os conjuntos de dados de HC e CRC foram determinadas por Welch do

t

-Testes. O método comparativo limiar ciclo (Ct) foi utilizado para quantificar os níveis de miARN exosomal em pacientes de HC e de BF. O rácio relativo foi calculado usando o

-ΔΔCt o método 2. O valor de Ct de miR-451 foi usado como um padrão interno. Cada ponto de dados foi normalizada a uma amostra representativa HC.

Discussão

Recentemente, miRNAs têm atraído grande interesse como um meio para analisar as vias moleculares envolvidas no desenvolvimento e progressão do câncer. Em adição às suas importantes funções celulares, é possível que miARNs segregadas incorporados em exossomas podem ser biomarcadores de diagnóstico para a detecção do cancro. Aqui, análises abrangentes de exosomal perfis de miRNA identificaram 16 miRNAs que foram expressos em níveis significativamente mais elevados em linhas celulares de cancro do cólon e amostras de soro de pacientes com CCR do que as células normais derivadas de cólon e amostras de soro de HCs, respectivamente. Os níveis de expressão endógenos da maioria destes miARNs não foram sobre-reguladas em linhas celulares de cancro e tecidos de cancro, sugerindo que a secreção de exosomal miARNs não depender dos níveis de expressão celular. Por outro lado, o miR-181, um miARN dependente do contexto associado a um cancro [23], [24], apenas indicado supra-regulados níveis de expressão celular e exosomal em linhas celulares de cancro e amostras clínicas, o que sugere uma hipótese interessante que a função exosomal de miR-181 pode estar envolvido no desenvolvimento e progressão do cancro do cólon.

Os níveis exosomal soro de oito destes 16 miARNs foram significativamente regulada para baixo após a ressecção cirúrgica de tumores primários, o que sugere que estes são secretadas a partir de miARNs células tumorais. No entanto, não se exclui a possibilidade de que estas miARNs são secretadas a partir de outras células, incluindo células do sistema imunológico e inflamatórias que ocorrem em coincidência lesões primárias do tecido. elevações Finalmente, CRC-associados dos níveis exosomal de sete níveis de miRNA (deixe-7A, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223 e miR-23a) foram validados por qRT-PCR , indicando que estes biomarcadores miARN pode ser adequados para detectar cancros do cólon. As altas sensibilidades e especificidades destes miRNAs exosomal determinados por análise ROC (Figura 4) apoiar a sua utilização como biomarcadores de diagnóstico.

Os níveis exosomal dos sete miRNAs selecionados não foram dependentes do estágio clínico da CRC (Figura S4 ). Na verdade, miR-23a e miR-1246 mostrou alta sensibilidade para a fase I amostras de 95% e 90%, respectivamente. Em comparação, as sensibilidades de CA19-9 e CEA para a fase I CRC são apenas 10 e 15%, respectivamente. Além disso, qRT-PCR demonstrou a detecção reprodutível destes miRNAs em níveis elevados em um conjunto independente de exossomos de soro de fase I CRC pacientes (Figura S5). Estes resultados sugerem que estes biomarcadores miARNs são adequados para a detecção de CRC fase precoce. Entretanto, uma validação é necessária para apoiar esta proposta.

Um relatório recente demonstrou que deixá-7a é expresso em níveis elevados em exossomos secretados no soro por células tumorais glioblastoma [15]. Além disso, o miR-1246 é detectável em amostras de soro total, em vez de fracções de exossoma, a partir de doentes com cancro esofágico [25]. Nós também medido let-7a, miR-1224-5p, e miR-150 níveis no meio de cultura de linhas de células pancreáticas e descobriram que os níveis foram semelhantes aos secretado pelas linhas de células de cancro do cólon de cinco (dados não apresentados), sugerindo miARNs que estes são normalmente segregada a partir de várias células de cancro. Vários relatórios têm sugerido a utilização de miARNs em circulação no plasma, ou soro total, incluindo o miR-141, miR-21, o miR-221, miR-29, e miR-92a, como biomarcadores de diagnóstico de CRC [26] – [30]. Estes miARNs foram mostradas para exibir sensibilidades e especificidades semelhantes às dos marcadores de cancro do cólon atualmente em uso. Notavelmente, foram relatados miR-141, o miR-221 e miR-21 a ser regulados positivamente em tecidos de cancro [31] – [33]; miARN conjunto total do plasma total ou soro pode incluir miARNs celulares endógenas derivadas de células tumorais quebradas ou circulantes [34], [35], o que pode explicar por que o miR-141, o miR-221 e miR-21 estão presentes em níveis elevados em amostras de soro ou plasma inteiro de pacientes com câncer. Além disso, miARNs soro /plasma, que não estão associadas a vesículas, foram relatadas para mostrar a estabilidade diferencial ao tratamento por ARNase A [36], o que sugere que miARNs exosomal são mais preferíveis como espécimes biológicos para o desenvolvimento de marcadores de diagnóstico devido à sua estabilidade em soro /plasma. Na verdade, os resultados aqui apresentados demonstram que os níveis de miRNA exosomal também refletem o status de câncer de rolamento e as alterações patológicas de pacientes. Exossomos são liberados de forma activa a partir de células de câncer e seus componentes específicos dependem da célula a partir da qual são originários. Com efeito, as células cancerígenas podem utilizar um mecanismo ainda não identificado para incorporar um subconjunto de miARNs em exossomas.

Em resumo, tentativas têm sido feitas recentemente para usar miARNs no soro ou plasma como biomarcadores de diagnóstico de vários cancros [37] ; no entanto, não há atualmente nenhuma visão coletiva dos quais miRNAs deve ser selecionado como marcadores. As propriedades únicas dos exossomas, incluindo a sua capacidade para incorporar miARNs específicos, da sua estabilidade em circulação, a sua detecção reprodutível e, mais importante ainda, o facto de que reflectem as propriedades de células cancerosas, poderá torná-las úteis para o desenvolvimento de estratégias de diagnóstico altamente sensíveis para a monitorização rápida e não invasiva do estado patológico de pacientes com câncer.

Informações de Apoio

Figura S1.

Preparação de fracções enriquecidas em exossoma a partir de meio de soro ou de cultura de células. (A) Visão geral do procedimento exosome-enriquecimento. (B) A análise de imunotransferência dos níveis de CD81 no soro humano antes de exossoma-enriquecimento e antes (pista 2) ou depois de armazenamento overnsight a 4 ° C (pistas 5 e 6), -20 ° C (pistas 7 e 8), ou – 80 ° C (pistas 9 e 10). de soro bovino fetal (FBS), antes (pista 1) e depois da armazenagem durante a noite a 4 ° C (pistas 3 e 4) foi utilizado como um controlo. A fracção enriquecida em exossomo foi então preparado a partir de 1 ml de soro utilizando o método de ultracentrifugação descrito nas secção Materiais e Métodos (pista 11). Cinco microlitros de cada amostra de soro, ou de 300 ng da fracção enriquecida foi carregado num gel de SDS-poliacrilamida de gradiente 10-20%. CD81, um marcador de exossoma, foi detectada utilizando um anticorpo específico. (C) Detecção do ARN pequena fracção de ARN celular total (endógenas) e RNAs exosomal (exosomal) a partir de células HCT116 (30 ng de cada). Os RNAs foram carregados 5-150 chips de RNA nt pequenas (Agilent) e capilar electroforese usando um Agilent 2100 Bioanalyzer. Uma fracção contendo RNA pequeno miARNs foi detectável em aproximadamente 10-40 nt. O pico a 4 nt representa um marcador de tamanho. As setas a negrito e abertos indicam 5S ARNt e ARNr pequenas, respectivamente. FU, unidades de fluorescência. (D) Análise de imunotransferência da expressão de CD81 em meio de cultura isento de soro de células HCT116 antes e depois exossomo-enriquecimento. As quantidades específicas de amostras de proteína a partir do sedimento celular, meio de cultura, e fracções enriquecidas com exossoma foram submetidos a análise de immunoblot utilizando anticorpos dirigidos contra CD81 ou anti-γ-tubulina, uma proteína intracelular representativo. As pistas 1-4, a pelota de células; pistas 5-7, meio de cultura isento de soro; pistas 8-10 fracção, enriquecida com exosome. (E) Gráficos de dispersão de intensidades de sinal normalizado (%) de miARNs exosomal (painéis esquerdos) e miARNs celulares endógenos (painéis da direita) nas linhas celulares indicadas. (F) de agrupamento hierárquico dos miRNAs endógenos e exosomal na linha de células de FHC normal, e cinco linhas celulares de cancro do cólon humano. Os dados representam os valores médios de intensidades normalizadas de sinal (%) de n = 3 experiências independentes. Um total de 489 miRNAs foram detectados em todas as amostras

doi:. 10.1371 /journal.pone.0092921.s001

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Figura S2. análise

Microarray de perfis de miRNA em amostras de soro enriquecido com exossomo de pacientes com CRC e HCs. (A) de agrupamento hierárquico dos miRNAs exosomal em amostras provenientes de 11 HCs e 88 pacientes com CCR (TNM: Estágio I, n = 20; fase II, n = 20; fase III-A, n = 20; fase III-B, n = 16; estágio IV , n = 12). O sombreamento azul e vermelho indica os pacientes HC e CRC, respectivamente. As intensidades de sinal de cada um miARN são apresentados como uma percentagem da intensidade do sinal total na matriz. Um total de 64 miARNs foram detectadas em todas as amostras de soro examinadas. (B) de agrupamento hierárquico dos 69 miRNAs que foram expressos em níveis significativamente maiores em pacientes com CCR de HCs (

P Art 0,05 por Welch do

t

-teste). parcela (C) de dispersão a partir das intensidades de sinal normalizado de 69 miARNs exosomal que foram supra-regulados em pacientes de CRC (eixo y) em comparação com HCS (eixo x). Os dados representam a média intensidades de sinal normalizadas de cada miRNA dos pacientes com CCR e HC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0092921.s002

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Figura S3. análise

Microarray de miRNAs exosomal de linhas celulares de cancro do cólon e os níveis de expressão endógenos de miRNAs. (A, B) Os níveis de expressão de 52 miARNs que foram segregadas a partir de cinco células do cancro do cólon em níveis significativamente mais elevados do que a partir de células (FHC

P

0,05). Os dados representam a média intensidades de sinal normalizado de n = 3 experiências independentes microarray.